一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增引物及扩增方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增引物及扩增方法。


背景技术：

2.本发明围绕新冠肺炎患者鼻咽拭子等上呼吸道样品中病毒载量低、难以扩增病毒全基因组序列的问题，采用巢式pcr方法提高病毒基因组扩增的效率，在同一反应管不开盖即可完成整个巢式pcr反应，避免了反应管开盖操作可能导致的交叉污染，保证了方法的准确性。现有基于高通量测序的病毒基因组扩增方法具有成本高、耗时长、依赖特殊测序设备、需要高通量测序专业操作人员和数据分析人员等弊端，不利于在一线疾控、科研部门推广。


技术实现要素：

3.针对上述问题本发明提供了一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增引物及方法。
4.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
5.一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增引物，包括36对引物对：
6.第1对引物的上游引物为：5
’‑
tgcttagtgcactcacgcag-3’，下游引物为：5
’‑
gccacaaaattcgcaagtggc-3’；
7.第2对引物的上游引物为：5
’‑
gatctgtctatccagttgcgtcacc’，下游引物为：5
’‑
tgtacaatccctttgagtgcgtgac-3’；
8.第3对引物的上游引物为：5
’‑
gttcagttgacttcgcagtggc-3’，下游引物为5
’‑
cctgcaacacctcctccatg-3’；
9.第4对引物的上游引物为：5
’‑
cctgtgttgtggcagatgctgtc-3’，下游引物为：5
’‑
aaccctgacccgggtaagtgg-3’；
10.第5对引物的上游引物为：5
’‑
ccagattctgccactcttgttagtgac-3’，下游引物为：5
’‑
ggcaagataacagttgttatctgccca-3’；
11.第6对引物的上游引物为：5
’‑
ccacacgcaagttgtggacatgtc-3’，下游引物为：5
’‑
ccaccacatcaccatttaagtcaggg-3’；
12.第7对引物的上游引物为：5
’‑
gatgtcagcaccacctgctcagtatg-3’，下游引物为：5
’‑
ccaccacatcaccatttaagtcaggg-3’；
13.第8对引物的上游引物为：5
’‑
aagtcagaggacgcgcagg-3’，下游引物为：5
’‑
ctaaccatagctgaaatcggggcc-3’；
14.第9对引物的上游引物为：5
’‑
gcttttggcttagttgcagagtgg-3’，下游引物为：5
’‑
gctacctgcgcattaatatgacgc-3’；
15.第10对引物的上游引物为：5
’‑
ggtgatagtgcggaagttgcag-3’，下游引物为：5
’‑
ggcaaggcatgttactacgatagctac-3’；
16.第11对引物的上游引物为：5
’‑
cctggtttgcctggcacgat-3’，下游引物为：5
’‑
ggtgcagatcacatgtcttggacag-3’；
17.第12对引物的上游引物为：5
’‑
gaagaagctgcgctgtgcacc-3’，下游引物为：5
’‑
gtccacactctcctagcaccatcatc-3’；
18.第13对引物的上游引物为：5
’‑
agcttggttgtacgctgctg-3’，下游引物为：5
’‑
gtaactggacacattgagcccaca-3’；
19.第14对引物的上游引物为：5
’‑
gatcaagccatttccatgtgggctc-3’，下游引物为：5
’‑
ccatcactcttagggaatctagcccat-3’；
20.第15对引物的上游引物为：5
’‑
caatgcaagagatggttgtgttcccttg-3’，下游引物为：5
’‑
gcatagacgaggtctgccattgtgt-3’；
21.第16对引物的上游引物为：5
’‑
tgccacagtacgtctacaagctgg-3’，下游引物为：5
’‑
ctgcagttaaagccctggtcaagg-3’；
22.第17对引物的上游引物为：5
’‑
ggcagacctcgtctatgctttaaggc-3’，下游引物为：5
’‑
ctacagtagctcctctagtggcggc-3’；
23.第18对引物的上游引物为：5
’‑
caggatggtaatgctgctatcagcg-3’，下游引物为：5
’‑
actgtatgcggtgtgtacatagcctc-3’；
24.第19对引物的上游引物为：5
’‑
gtcaagctgtcacggccaatg-3’，下游引物为：5
’‑
cttgtggcactagtgtaggtgcac-3’；
25.第20对引物的上游引物为：5
’‑
gatgtggtgcttgcatacgtagacc-3’，下游引物为：5
’‑
cttgtaaagttgccacattcctacgtgg-3’；
26.第21对引物的上游引物为：5
’‑
ggcgaccctgctcaattacctgc-3’，下游引物为：5
’‑
tcgtggacagctagacacctagtcatg-3’；
27.第22对引物的上游引物为：5
’‑
attggcttcgatgtcgaggggtgt-3’，下游引物为5
’‑
cccacaagctaaagccagctgagatc-3’；
28.第23对引物的上游引物为：5
’‑
cccagttcttcacgacattggtaacc-3’，下游引物为：5
’‑
ccggttgccacgcttgactaga-3’；
29.第24对引物的上游引物为：5
’‑
ggagtcacattaattggagaagccg-3’，下游引物为：5
’‑
acacactgactagagactagtggc-3’；
30.第25对引物的上游引物为：5
’‑
ctacgggtacgctgcttgtcg-3’，下游引物为：5
’‑
cagcaccagctgtccaacctg-3’；
31.第26对引物的上游引物为：5
’‑
catgggacacttcgcatggtgg-3’，下游引物为：5
’‑
gggtcaagtgcacagtctacagcatc-3’；
32.第27对引物的上游引物为：5
’‑
gtctctgggaccaatggtactaagagg-3’，下游引物为：5
’‑
gaatagcaacagggacttctgtgcag-3’；
33.第28对引物的上游引物为：5
’‑
tctatcaggccggtagcacaccttg-3’，下游引物为：5
’‑
ccgctaacagtgcagaagtgtattgagc-3’；
34.第29对引物的上游引物为：5
’‑
gtgacacttgcagatgctggcttcatc-3’，下游引物为：5
’‑
tcaccattactatggcaatcaagccagc-3’；
35.第30对引物的上游引物为：5
’‑
ggcacacactggtttgtaacacaaagg-3’，下游引物为：5’‑
cacgctagtagtcgtcgtcggttc-3’；
36.第31对引物的上游引物为：5
’‑
tggccatggtacatttggctaggt-3’，下游引物为：5
’‑
agtaccgttggaatctgccatggc-3’；
37.第32对引物的上游引物为：5
’‑
cttcaggtgatggcacaacaagtcc-3’，下游引物为：5
’‑
agttactggccataacagccagagg-3’；
38.第33对引物的上游引物为：5
’‑
gttacactagccatccttactgcgc-3’，下游引物为：5
’‑
cctcgtatgttccagaagagcaagg-3’；
39.第34对引物的上游引物为：5
’‑
gcgtgtagcaggtgactcagg-3’，下游引物为：5
’‑
accaaacgtaatgcggggtgc-3’；
40.第35对引物的上游引物为：5
’‑
aattgtgcgtggatgaggctggttc-3’，下游引物为：5
’‑
gatggcacctgtgtaggtcaacc-3’；
41.第36对引物的上游引物为：5
’‑
cattggcacccgcaatcctgc-3’，下游引物为：5
’‑
cacattagggctcttccatataggcagc-3’。
42.一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增方法，包括以下步骤：
43.步骤1，逆转录：
44.步骤1.1，在rnase-free离心管中配制如下混合液：total rna的体积为10pg-5μg，根据total rna体积，补充rnase-free ddh2o至8μl，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；
45.步骤1.2，cdna第一链合成反应：向步骤1.1中的混合液加入2μl 10
×
反转录预混液(rt mix)，2μl反转录酶(hiscript iii enzyme mix)，1μl 20碱基的多聚胸腺嘧啶vn寡核苷酸(oligo(dt)
20
vn)，1μl 6碱基随机寡核苷酸(random hexamers)，4μl无rna酶水(rnase-free ddh2o)，用移液器轻轻吹打混匀，25℃加热5min，37℃加热45min，85℃加热5s，产物可立即用于pcr反应，或置于-20℃冻存；
46.步骤2，利用所述36对扩增引物进行pcr扩增，使用质量浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，使用pcr扩增引物进行双端测序，测序序列使用dnastar软件包的seqman进行拼接。
47.进一步，所述pcr扩增的反应体系为：25μl 2
×
预混pcr反应液(reaction mix)，上游引物50μmol/0.4μl，下游引物50μmol/0.4μl，5μl模板dna，ddh2o补充至50μl。
48.进一步，所述pcr扩增的扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57-61℃退火30s，72℃延伸30s/kb，共35个循环，最后72℃延伸7min。
49.与现有技术相比本发明具有以下优点：
50.(1)相比高通量测序方法，具有准确率高、速度快等优点。应用本发明所述方法扩增新冠病毒全基因组仅需36个逆转录pcr反应加一代测序，结果准确度高，可被直接认可。而高通量测序结果一般仍需一代测序进一步验证，且需艰苦、测序加数据分析等繁琐步骤。因而本方法相比高通量测序准确率高、速度快。
51.(2)相比其他pcr加一代测序方法，具有扩增效率高、非特异扩增少等优点。基于本发明所设计的引物和建立的pcr扩增方法，可对新冠病毒基因组进行高效、非特异地扩增，扩增效果如附图所示。且由于所设计的引物均靶向病毒基因组的保守区，因而扩增效率基本不受病毒变异的影响。
附图说明
52.图1为本发明方法扩增新冠病毒基因组的效果图，pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶跑胶。从1-36号为本发明1-36对引物对应的pcr扩增产物，m为2000bp marker。
具体实施方式
53.实施例1
54.一种新型冠状病毒全基因组序列的扩增引物，包括36对引物对：
55.第1对引物的上游引物为：5
’‑
tgcttagtgcactcacgcag-3’，下游引物为：5
’‑
gccacaaaattcgcaagtggc-3’；
56.第2对引物的上游引物为：5
’‑
gatctgtctatccagttgcgtcacc’，下游引物为：5
’‑
tgtacaatccctttgagtgcgtgac-3’；
57.第3对引物的上游引物为：5
’‑
gttcagttgacttcgcagtggc-3’，下游引物为5
’‑
cctgcaacacctcctccatg-3’；
58.第4对引物的上游引物为：5
’‑
cctgtgttgtggcagatgctgtc-3’，下游引物为：5
’‑
aaccctgacccgggtaagtgg-3’；
59.第5对引物的上游引物为：5
’‑
ccagattctgccactcttgttagtgac-3’，下游引物为：5
’‑
ggcaagataacagttgttatctgccca-3’；
60.第6对引物的上游引物为：5
’‑
ccacacgcaagttgtggacatgtc-3’，下游引物为：5
’‑
ccaccacatcaccatttaagtcaggg-3’；
61.第7对引物的上游引物为：5
’‑
gatgtcagcaccacctgctcagtatg-3’，下游引物为：5
’‑
ccaccacatcaccatttaagtcaggg-3’；
62.第8对引物的上游引物为：5
’‑
aagtcagaggacgcgcagg-3’，下游引物为：5
’‑
ctaaccatagctgaaatcggggcc-3’；
63.第9对引物的上游引物为：5
’‑
gcttttggcttagttgcagagtgg-3’，下游引物为：5
’‑
gctacctgcgcattaatatgacgc-3’；
64.第10对引物的上游引物为：5
’‑
ggtgatagtgcggaagttgcag-3’，下游引物为：5
’‑
ggcaaggcatgttactacgatagctac-3’；
65.第11对引物的上游引物为：5
’‑
cctggtttgcctggcacgat-3’，下游引物为：5
’‑
ggtgcagatcacatgtcttggacag-3’；
66.第12对引物的上游引物为：5
’‑
gaagaagctgcgctgtgcacc-3’，下游引物为：5
’‑
gtccacactctcctagcaccatcatc-3’；
67.第13对引物的上游引物为：5
’‑
agcttggttgtacgctgctg-3’，下游引物为：5
’‑
gtaactggacacattgagcccaca-3’；
68.第14对引物的上游引物为：5
’‑
gatcaagccatttccatgtgggctc-3’，下游引物为：5
’‑
ccatcactcttagggaatctagcccat-3’；
69.第15对引物的上游引物为：5
’‑
caatgcaagagatggttgtgttcccttg-3’，下游引物为：5
’‑
gcatagacgaggtctgccattgtgt-3’；
70.第16对引物的上游引物为：5
’‑
tgccacagtacgtctacaagctgg-3’，下游引物为：5
’‑
ctgcagttaaagccctggtcaagg-3’；
71.第17对引物的上游引物为：5
’‑
ggcagacctcgtctatgctttaaggc-3’，下游引物为：5
’‑
ctacagtagctcctctagtggcggc-3’；
72.第18对引物的上游引物为：5
’‑
caggatggtaatgctgctatcagcg-3’，下游引物为：5
’‑
actgtatgcggtgtgtacatagcctc-3’；
73.第19对引物的上游引物为：5
’‑
gtcaagctgtcacggccaatg-3’，下游引物为：5
’‑
cttgtggcactagtgtaggtgcac-3’；
74.第20对引物的上游引物为：5
’‑
gatgtggtgcttgcatacgtagacc-3’，下游引物为：5
’‑
cttgtaaagttgccacattcctacgtgg-3’；
75.第21对引物的上游引物为：5
’‑
ggcgaccctgctcaattacctgc-3’，下游引物为：5
’‑
tcgtggacagctagacacctagtcatg-3’；
76.第22对引物的上游引物为：5
’‑
attggcttcgatgtcgaggggtgt-3’，下游引物为5
’‑
cccacaagctaaagccagctgagatc-3’；
77.第23对引物的上游引物为：5
’‑
cccagttcttcacgacattggtaacc-3’，下游引物为：5
’‑
ccggttgccacgcttgactaga-3’；
78.第24对引物的上游引物为：5
’‑
ggagtcacattaattggagaagccg-3’，下游引物为：5
’‑
acacactgactagagactagtggc-3’；
79.第25对引物的上游引物为：5
’‑
ctacgggtacgctgcttgtcg-3’，下游引物为：5
’‑
cagcaccagctgtccaacctg-3’；
80.第26对引物的上游引物为：5
’‑
catgggacacttcgcatggtgg-3’，下游引物为：5
’‑
gggtcaagtgcacagtctacagcatc-3’；
81.第27对引物的上游引物为：5
’‑
gtctctgggaccaatggtactaagagg-3’，下游引物为：5
’‑
gaatagcaacagggacttctgtgcag-3’；
82.第28对引物的上游引物为：5
’‑
tctatcaggccggtagcacaccttg-3’，下游引物为：5
’‑
ccgctaacagtgcagaagtgtattgagc-3’；
83.第29对引物的上游引物为：5
’‑
gtgacacttgcagatgctggcttcatc-3’，下游引物为：5
’‑
tcaccattactatggcaatcaagccagc-3’；
84.第30对引物的上游引物为：5
’‑
ggcacacactggtttgtaacacaaagg-3’，下游引物为：5
’‑
cacgctagtagtcgtcgtcggttc-3’；
85.第31对引物的上游引物为：5
’‑
tggccatggtacatttggctaggt-3’，下游引物为：5
’‑
agtaccgttggaatctgccatggc-3’；
86.第32对引物的上游引物为：5
’‑
cttcaggtgatggcacaacaagtcc-3’，下游引物为：5
’‑
agttactggccataacagccagagg-3’；
87.第33对引物的上游引物为：5
’‑
gttacactagccatccttactgcgc-3’，下游引物为：5
’‑
cctcgtatgttccagaagagcaagg-3’；
88.第34对引物的上游引物为：5
’‑
gcgtgtagcaggtgactcagg-3’，下游引物为：5
’‑
accaaacgtaatgcggggtgc-3’；
89.第35对引物的上游引物为：5
’‑
aattgtgcgtggatgaggctggttc-3’，下游引物为：5
’‑
gatggcacctgtgtaggtcaacc-3’；
90.第36对引物的上游引物为：5
’‑
cattggcacccgcaatcctgc-3’，下游引物为：5
’‑
cacattagggctcttccatataggcagc-3’。
91.一种利用上述36对扩增引物进行新型冠状病毒全基因组的扩增方法，包括以下步骤：
92.步骤1，逆转录：
93.步骤1.1，在rnase-free离心管中配制如下混合液：total rna的体积为10pg-5μg，根据total rna体积，补充rnase-free ddh2o至8μl，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；
94.步骤1.2，cdna第一链合成反应：向步骤1.1中的混合液加入2μl 10
×
反转录预混液，2μl反转录酶，1μl 20碱基的多聚胸腺嘧啶vn寡核苷酸，1μl 6碱基随机寡核苷酸，4μl无rna酶水，用移液器轻轻吹打混匀，25℃加热5min，37℃加热45min，85℃加热5s，产物可立即用于pcr反应，或置于-20℃冻存；
95.步骤2，利用所述36对扩增引物进行pcr扩增，所述pcr扩增的反应体系为：25μl 2
×
预混pcr反应液，上游引物50μmol/0.4μl，下游引物50μmol/0.4μl，5μl模板dna，ddh2o补充至50μl，所述pcr扩增的扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57-61℃退火30s，72℃延伸30s/kb，共35个循环，最后72℃延伸7min。
96.使用质量浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，使用pcr扩增引物进行双端测序，测序序列使用dnastar软件包的seqman进行拼接。
97.具体的，第1对引物对应的退火温度为58℃，第2对引物对应的退火温度为58℃，第3对引物对应的退火温度为58℃，第4对引物对应的退火温度为60℃，第5对引物对应的退火温度为58℃，第6对引物对应的退火温度为59℃，第7对引物对应的退火温度为58℃，第8对引物对应的退火温度为59℃，第9对引物对应的退火温度为58℃，第10对引物对应的退火温度为58℃，第11对引物对应的退火温度为59℃，第12对引物对应的退火温度为60℃，第13对引物对应的退火温度为58℃，第14对引物对应的退火温度为59℃，第15对引物对应的退火温度为59℃，第16对引物对应的退火温度为60℃，第17对引物对应的退火温度为61℃，第18对引物对应的退火温度为59℃，第19对引物对应的退火温度为59℃，第20对引物对应的退火温度为58℃，第21对引物对应的退火温度为60℃，第22对引物对应的退火温度为61℃，第23对引物对应的退火温度为59℃，第24对引物对应的退火温度为57℃，第25对引物对应的退火温度为60℃，第26对引物对应的退火温度为61℃，第27对引物对应的退火温度为59℃，第28对引物对应的退火温度为60℃，第29对引物对应的退火温度为60℃，第30对引物对应的退火温度为60℃，第31对引物对应的退火温度为60℃，第32对引物对应的退火温度为60℃，第33对引物对应的退火温度为59℃，第34对引物对应的退火温度为60℃，第35对引物对应的退火温度为60℃，第36对引物对应的退火温度为60℃。
98.序列表
99.seq id no.1：tgcttagtgcactcacgcag
100.seq id no.2：gccacaaaattcgcaagtggc
101.seq id no.3：gatctgtctatccagttgcgtcacc
102.seq id no.4：tgtacaatccctttgagtgcgtgac
103.seq id no.5：gttcagttgacttcgcagtggc
104.seq id no.6：cctgcaacacctcctccatg
105.seq id no.7：cctgtgttgtggcagatgctgtc
106.seq id no.8：aaccctgacccgggtaagtgg
107.seq id no.9：ccagattctgccactcttgttagtgac
108.seq id no.10：ggcaagataacagttgttatctgccca
109.seq id no.11：ccacacgcaagttgtggacatgtc
110.seq id no.12：ccaccacatcaccatttaagtcaggg
111.seq id no.13：gatgtcagcaccacctgctcagtatg
112.seq id no.14：ccaccacatcaccatttaagtcaggg
113.seq id no.15：aagtcagaggacgcgcagg
114.seq id no.16：ctaaccatagctgaaatcggggcc
115.seq id no.17：gcttttggcttagttgcagagtgg
116.seq id no.18：gctacctgcgcattaatatgacgc
117.seq id no.19：ggtgatagtgcggaagttgcag
118.seq id no.20：ggcaaggcatgttactacgatagctac
119.seq id no.21：cctggtttgcctggcacgat
120.seq id no.22：ggtgcagatcacatgtcttggacag
121.seq id no.23：gaagaagctgcgctgtgcacc
122.seq id no.24：gtccacactctcctagcaccatcatc
123.seq id no.25：agcttggttgtacgctgctg
124.seq id no.26：gtaactggacacattgagcccaca
125.seq id no.27：gatcaagccatttccatgtgggctc
126.seq id no.28：ccatcactcttagggaatctagcccat
127.seq id no.29：caatgcaagagatggttgtgttcccttg
128.seq id no.30：gcatagacgaggtctgccattgtgt
129.seq id no.31：tgccacagtacgtctacaagctgg
130.seq id no.32：ctgcagttaaagccctggtcaagg
131.seq id no.33：ggcagacctcgtctatgctttaaggc
132.seq id no.34：ctacagtagctcctctagtggcggc
133.seq id no.35：caggatggtaatgctgctatcagcg
134.seq id no.36：actgtatgcggtgtgtacatagcctc
135.seq id no.37：gtcaagctgtcacggccaatg
136.seq id no.38：cttgtggcactagtgtaggtgcac
137.seq id no.39：gatgtggtgcttgcatacgtagacc
138.seq id no.40：cttgtaaagttgccacattcctacgtgg
139.seq id no.41：ggcgaccctgctcaattacctgc
140.seq id no.42：tcgtggacagctagacacctagtcatg
141.seq id no.43：attggcttcgatgtcgaggggtgt
142.seq id no.44：cccacaagctaaagccagctgagatc
143.seq id no.45：cccagttcttcacgacattggtaacc
144.seq id no.46：ccggttgccacgcttgactaga
145.seq id no.47：ggagtcacattaattggagaagccg
146.seq id no.48：acacactgactagagactagtggc
147.seq id no.49：ctacgggtacgctgcttgtcg
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