ABLIM1作为胶质瘤分子标志物的应用的制作方法

ablim1作为胶质瘤分子标志物的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及ablim1作为胶质瘤分子标志物的应用。


背景技术：

2.原发性神经系统肿瘤指来源于中枢神经细胞的异质性肿瘤，分为良性和恶性。至今，原发性颅内恶性肿瘤仍为最难治疗的肿瘤之一，5年生存率小于35％。其中胶质瘤(gliomas)是成人最常见的颅内恶性神经系统肿瘤，约占原发性恶性神经系统肿瘤的75％。采用手术切除联合放疗及化疗的综合性治疗方案，平均生存期仍不超过2年。
3.胶质瘤化疗效果有限，而抗血管生成剂(anti-angiogenesis)结合放化疗可显著延长患者的无进展生存期(progression-free survival,pfs)，因此于2009年被广泛应用于临床胶质瘤患者的治疗，但大量的临床研究发现，血管生成抑制剂并不能延长患者的总生存期(overall survival,os)。对血管生成抑制剂治疗的患者进行临床研究分析发现，个体对治疗的响应性不同，可能为重要原因之一。
4.在应用血管生成抑制剂时，瘤体氧分压增高的患者较无显著变化的患者，总生存期延长。因此申请人通过给予富氧刺激，模拟血管生成抑制剂应用时产生的氧分压增高环境，筛选出在该条件下的相关通路，其中下游末端分子ablim1表现出显著调控作用，并且在临床样本及数据库中进行广泛验证时发现，ablim1具有良好临床诊疗应用价值。因此ablim1或可应用于筛选临床抗血管生成抑制剂反应性良好的患者，进行精准诊疗，个体化治疗，对改善胶质瘤患者的预后具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供ablim1作为胶质瘤分子标志物的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、ablim1(actin binding lim protein 1,gene id:3983)作为胶质瘤分子标志物的应用。
8.优选的，ablim1作为胶质瘤预后判断或治疗方式筛选分子标志物的应用。
9.2、ablim1在制备胶质瘤预后判断或治疗方式筛选试剂盒中的应用。
10.3、一种胶质瘤预后判断或治疗方式筛选试剂盒，其有效成分为ablim1。
11.本发明的有益效果在于：
12.本发明公开了ablim1在胶质瘤辅助诊断及治疗的应用。申请人发现ablim1在高级别胶质瘤患者的肿瘤组织中表达明显低于低级别患者，其可作为胶质瘤分子标志物，应用于胶质瘤患者的预后判断、治疗方式筛选及靶向治疗，并有利于进一步阐明胶质瘤的发生发展的分子机制及信号通路，具有较高的应用前景和理论研究价值。
附图说明
13.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行
说明。
14.图1通过数据库预测上游分子的下游终末效应蛋白集，并与转录组芯片数据，翻译组蛋白质谱结果进行交集分析得到“备选下游调控分子集”(即a中右侧纵向分子集)。然后通过在5种人源胶质瘤细胞系中(u87mg,u118mg,u251,a172及ln229)敲减及过表达响应富氧刺激的上游分子，并通过qpcr检测“备选下游调控分子集”中各分子的表达水平，最符合下游表达趋势的分子plcb1及ablim1为研究筛选出的下游终末效应蛋白，由于plcb1已有研究报道，本发明主要分析ablim1的应用前景；其中，a为qpcr检测“备选下游调控分子集”的表达水平热图展示，b为“备选下游调控分子集”在敲减及过表达上游分子后表达水平差异条图展示；
15.图2为免疫组化染色及评分，其中，a为对临床诊断明确的胶质瘤样本进行ablim1的免疫组化染色，各分级的代表样本镜下视野，及样本评分统计分析结果，b为胶质瘤患者组织样本ablim1免疫组化评分结果热图展示【共39例患者胶质瘤样本，每个样本双盲拍照并评分3个视野(热图上中下)】；
16.图3为下载并分析中国胶质瘤基因组图谱(cgga)数据库数据，不同ablim1表达水平患者的kaplan-meier生存期曲线分析(1曲线为ablim1高表达患者，2曲线为ablim1低表达患者)；其中，a为胶质瘤和低级别胶质瘤，b为胶质母细胞瘤和who
‑ⅲ
，c为who
‑ⅱ
和who
‑ⅳ
，d为1p/19q非共缺失和1p/19q共缺失，e为idh突变型和idh野生型；
17.图4为下载并分析中国胶质瘤基因组图谱(cgga)数据库数据，ablim1在不同患者集群中的表达水平分布；其中，a为胶质瘤，b为idh野生型，c为idh突变型，d为1p/19q共缺失，e为1p/19q非共缺失；
18.图5为下载并分析中国胶质瘤基因组图谱(cgga)数据库数据，通过roc曲线分析ablim1对临床生存期预测的诊断价值。
具体实施方式
19.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
20.实施例：
21.在血管生成抑制剂治疗过程中，胶质瘤局部氧分压增高的患者较无显著氧分压增高的患者，生存期更久。因此研究通过给予胶质瘤富氧刺激筛选出上游关键分子mi-1290，为研究mi-1290的下游终末靶效应蛋白分子【mirna为通路中间调控分子，通过结合并降解靶分子的信使rna(mrna)，下调靶分子的表达，并产生生物学效应，因此最终的末端效应蛋白具有重要研究价值】，通过数据库靶预测，结合转录组芯片数据及翻译组蛋白质谱数据，取交集筛选出“备选下游调控分子集”(图1中a)，然后在u87mg、ln229、u118mg、a172、u251人源胶质瘤细胞系中，通过慢病毒转染构建稳定敲减及过表达mir-1290细胞株，并通过定量pcr检测“备选下游调控分子集”中各分子的表达水平，筛选出最符合表达趋势的下游目的分子plcb1及ablim1【图1中b，由mi-1290调控的下游靶分子应符合以下趋势，当过表达mi-1290时，靶分子mrna会被mi-1290大量结合并降解，因此定量pcr检测时，靶分子表达丰度降低，反之则升高。图1中b表达差异值＝敲减后表达差异倍数-过表达后表达差异倍数(如x基因，mi1290敲减后上调( 2)倍，过表达后下调(-2)倍，则表达差异值＝2-(-2)＝4】，plcb1的应用已有报道，因此本发明着重于探讨ablim1分子。
22.ablim1临床胶质瘤样本免疫组化染色
23.临床样本取自陆军军医大学第一附属医院人类遗传资源样本库，为2014年8月-2020年8月就诊于陆军军医大学第一附属医院，并根据病理诊断报告诊断为胶质瘤。ablim1免疫组化染色组织切片自病理诊断参考的同一石蜡组织块。样本临床信息统计资料见表1，项目已从陆军军医大学第一附属医院伦理委员会得到认可和授权。
24.表139例胶质瘤样本的患者信息
[0025][0026][0027]
ablim1免疫组化简要步骤：切好的石蜡组织片捞于载玻片上，37℃温箱中烘干。经脱蜡(依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-体积浓度100％酒精-体积浓度100％酒精-体积浓度95％酒精-体积浓度90％酒精-体积浓度80％酒精-体积浓度70％酒精)，抗原修复(体积浓度3％h2o2浸泡10分钟)，体积浓度10％血清封闭(37℃，半小时)，加入ablim1抗体工作液(武汉三鹰生物技术有限公司，15129-1-ap，稀释比例(体积)1：100，稀释液1
×
pbs，ph＝7.4)，4℃孵育过夜，回收抗体后经1
×
pbs(ph＝7.4)洗涤3次后，加入hrp标记羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，pr30011)并置于37℃温箱中半小时。取出1
×
pbs(ph＝7.4)洗涤3次，滴加适量dab工作液(碧云天，p0203)，室温孵育5-10分钟，或者镜下控制反应时间。去离子水冲洗3次，每次1分钟。最后经复染【苏木素染色液(碧云天，c0107)复染2-3分钟，然后1
×
pbs冲洗切片3次，每次1分钟。再在去离子水中浸泡切片5分钟)，脱水(各级酒精体积浓度60％，体积浓度80％，体积浓度95％，体积浓度100％脱水，每级5分钟。取出后置于二甲苯2次，每次5分钟)后进行封片，晾干。
[0028]
免疫组化染色完成后，通过双盲镜下观察拍照并评分，每个样本拍摄3个视野并评分，每个样本的评分结果见热图(图2中b)，ablim1主要表达于细胞胞质中，在彩色免疫组化样本片中，表现为细胞核之间的黄色至棕褐色阳性着色，图片灰度处理后，视觉观察阳性与阴性辨识度降低，但在who-ii到iii级样本中，仍可见细胞核之间条索状阴影(箭头所指的细胞核间隙)，而在who-iv样本细胞核间无显著阴影(图2中a)。
[0029]
下载cgga数据库内数据，通过以下分析验证ablim1作为临床预测分子的可行性。
[0030]
1、ablim1对患者生存期的预测性能
[0031]
通过对患者生存曲线kaplan-meier分析，在不同等级及不同分子亚型患者中高表达与低表达患者间是否存在生存差异。分析结果如图3，ablim1高表达患者不仅在胶质瘤(低级别胶质瘤 胶质母细胞瘤，图3中a左)，低级别胶质瘤(图3中a右)，胶质母细胞瘤(图3
中b左)，who-iii(图3中b右)，who-iv(图3中c右)胶质瘤中生存期显著高于低表达患者，且在现今已广泛应用于临床的诊断分子分型标记物1p/19q非共缺失型(图3中d左)、idh突变型(图3中e左)、野生型(图3中e右)患者中高表达与低表达患者也存在生存差异，这说明ablim1可在现有临床分子分型的基础上，对患者的生存期进行进一步预测，具有重要临床推广意义。
[0032]
患者的中位生存期(median survival time)分析，用以衡量不同表达水平患者间的中位生存期差异值。进一步说明ablim1作为临床预后预测分子的可行性。结果如表2。结果显示ablim1高表达患者的中位生存期(2292天)显著长于低表达患者(508天)，并且在不同分级，以及idh突变型、野生型、1p/19q非共缺失型的分子分型患者中，ablim1高表达患者的中位生存期也显著长于低表达患者(详见表2)。
[0033]
表2ablim1
[0034][0035]
n.s.(not statistically significant)无统计学意义
[0036]
2、ablim1的表达水平对临床分级的预测性能
[0037]
ablim1在不同分级患者中的表达水平分布，结果见图4。ablim1在胶质瘤(图4中a)、idh野生型(图4中b)、idh突变型(图4中c)、1p/19q共缺失(图4中d)、1p/19q非共缺失患者集群中(图4中e)，均表现为：低级别(who-ii/iii)患者高表达ablim1，高级别(who-iv)患者低表达ablim1；低级别胶质瘤(lgg，low grade glioma)患者高表达，胶质母细胞瘤(gbm，glioblastoma multiforme)中低表达。这说明ablim1具有良好临床预测性能，该预测性能除了可对临床胶质瘤患者进行总体分级预测外，还可在现有临床分子分型的基础上，对患者的临床分类分级进行进一步预测，具有重要临床推广意义。
[0038]
3、ablim1对临床生存期预测的诊断价值分析
[0039]
通过roc曲线分析，判断ablim1对胶质瘤患者1，3，5年生存期的预测性能，并通过
与现有临床分级及临床广泛应用分子标记物idh，1p/19q的诊断性能分析结果，进行比较，衡量ablim1对生存期预测的诊断性能。roc曲线越靠近左上角，auc(area under curve,曲线下面积)值越大，试验的灵敏度越高，误判率越低，则诊断方法的性能越好。分析结果如图5。结果显示ablim1对于胶质瘤患者1，3，5年的生存期均具有良好的诊断性能(图5左)。且ablim1的auc值大于现临床广泛应用的诊断分子1p/19q[auc(ablim1)＝0.69，auc(1p/19q)＝0.62]，与idh相等[auc(idh)＝0.69](图5右)。该结果说明ablim1具有良好的临床预测性能及临床应用价值。
[0040]
4、衡量ablim1是否可以作为对胶质瘤患者生存期的独立预测因子
[0041]
通过单因素及多因素cox回归分析，排除调整其他混杂因素，检测ablim1是否可作为独立作用因素，对胶质瘤的生存期进行预测。结果如下表3。结果显示ablim1可作为独立影响因素，影响患者的生存期，并可作为独立因子对患者的生存期进行预测，具有重要的临床研究及应用潜力。
[0042]
表3影响患者预后的临床病理因素的单因素和多因素cox回归分析(cgga)
[0043][0044]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。