一种病毒纯化高效保护试剂及其应用的制作方法

1.本发明属于生物制药技术领域，特别是一种病毒纯化高效保护试剂。


背景技术：

2.现有技术中病毒的纯化主要有两种方法，分别是密度梯度离心和层析纯化。密度梯度离心多采用氯化铯或碘克沙醇进行密度梯度离心，但梯度离心法用于中试放大和gmp生产时面临成本高、耗时久等诸多困难。层析纯化法中，多采用亲和层析、离子层析。离子层析的过高或偏低离子浓度均会影响到aav的电荷，会影响到aav的蛋白的折叠导致构象发生改变，甚至引起蛋白变性，失去活性。
3.对腺相关病毒(aav)进行亲和层析时，往往采用ph2.5-3的洗脱缓冲液，而aav的蛋白的稳定保存对ph值要求阈值比较小，当ph从7逐渐变为4的过程中，aav的vp1蛋白的α螺旋发生可逆的结构构象改变，进而影响aav的生物活性。缓冲液中离子浓度偏低会引起aav的蛋白聚集成团，也会影响aav的生物活性。
4.空壳aav中缺失部分或全部目标基因片段，属于纯化中需要去除的杂质之一。但是空壳aav与实心aav的物理特性差异较小，仅能根据空壳aav和实心aav的微小电荷差异进行分离，层析过程中需要采用极端的ph值或离子浓度进行洗脱，极端的缓冲液环境会改变aav的蛋白的结构，导致aav的蛋白脱酰胺、被氧化使得aav失活，进而影响实心aav的纯化收率。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于针对背景技术中所述的现有技术中，对腺相关病毒(aav)进行亲和层析时存在的影响aav的生物活性以及在去除空壳aav时也会使得实心aav失活，影响实心aav的纯化收率的问题，提供一种能够解决前述问题的病毒纯化高效保护试剂。
6.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：其包括的组分及含量为：其包括的组分及含量为：0.5-1m蔗糖、20-30g/l精氨酸、15-20g/l甘氨酸、15-20g/l甘露醇、35-40g/l海藻糖、0.4-0.5m mgcl2、0.5m tris-hcl，其余为超纯水，ph为7.5。
7.本发明的第二个目的在于提供一种的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段，在层析平衡缓冲液中添加1%-2%病毒纯化高效保护试剂，层析柱平衡时保护aav蛋白免于因ph值或离子浓度引起的蛋白变性。
8.本发明的第三个目的在于提供一种上述的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法的亲和层析的上样阶段，上样样品中添加1%-2%的病毒纯化高效保护试剂，防止样品中aav或其它病毒的蛋白外壳变性、聚集和氧化。
9.本发明的第四个目的在于提供一种上述的病毒纯化高效保护试剂在病毒纯化中的应用，上述的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法的洗脱阶段，在层析洗脱液中添加
1%-2%的病毒纯化高效保护试剂，洗脱时能避免极端ph值导致aav变性失去生物活性，提高实心aav/空壳aav比例，提高aav产量。
10.本发明的有益效果为：1）本发明的病毒纯化高效保护试剂，在病毒层析纯化的过程中，在平衡阶段、上样阶段和洗脱阶段，通过添加本发明的病毒纯化高效保护试剂，能对aav病毒或其他病毒进行保护，避免aav或其他病毒的蛋白外壳在层析纯化中因条件发生剧烈变化导致蛋白构象改变而影响aav或其它类病毒的活性和产量；2）本发明的病毒纯化高效保护试剂，不仅能用于aav病毒的层析纯化过程的保护，还能用于其他病毒的层析纯化过程的保护，用途广泛；3）本发明的病毒纯化高效保护试剂中，精氨酸能降低蛋白质异化作用，保护aav病毒蛋白vp1,vp2和vp3蛋白的构象稳定性，保证纯化过程中aav的生物活性；甘氨酸为具有氨基和羧基的两性离子，具有很强的缓冲能力，可以维持纯化过程中缓冲液的ph环境相对稳定，保护aav病毒蛋白；同时，其金属螯合作用可以抗氧化，避免aav病毒蛋白氧化变性；海藻糖拥有许多羟基，能够替代水与磷脂头部发生氢键结合，从而取代失去的结合水，在高盐等极端环境下，具有稳定生物膜和蛋白质结构的特性，可以保护aav病毒蛋白因发生变性而失活；mgcl2中的镁离子在缓冲液中起到防止aav病毒蛋白聚集的作用，同时提高纯化过程中aav的空壳病毒与实心病毒的分离度；蔗糖(sucrose)是一种渗透调节物质，维持蛋白的折叠与重折叠处于一个相对动态平衡的状态，避免蛋白因错误折叠导致构象改变，可以保证在纯化过程中aav病毒蛋白的稳定和产量。
11.需要说明的是，根据目前的实验检测结果，氨基酸中只有甘氨酸和精氨酸是经过实验检测能在病毒纯化过程中保护aav病毒蛋白，在糖类中也只有蔗糖和海藻糖是经过实验检测能够在病毒纯化过程中保护aav病毒蛋白。
具体实施方式
12.下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.实施例1一种病毒纯化高效保护试剂，其包括的组分及含量为：1蔗糖、30g/l精氨酸、 20g/l甘氨酸、20g/l甘露醇、40g/l海藻糖、0.5m mgcl2、0.5m tris-hcl，其余为超纯水，ph为7.5。
14.实施例2一种病毒纯化高效保护试剂，其包括的组分及含量为：0.5蔗糖、20g/l精氨酸、 15g/l甘氨酸、15g/l甘露醇、35g/l海藻糖、0.4m mgcl2、0.5m tris-hcl，其余为超纯水，ph为7.5。
15.实施例3一种病毒纯化高效保护试剂，其包括的组分及含量为：0.8蔗糖、25g/l精氨酸、 18g/l甘氨酸、18g/l甘露醇、38g/l海藻糖、0.5m mgcl2、0.5m tris-hcl，其余为超纯水，ph为7.5。
16.应用例1
将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段，在2l的平衡缓冲液中加入20ml的病毒纯化高效保护试剂，层析柱平衡时aav蛋白免于因ph值的降低或离子浓度的降低引起的蛋白变性。
17.应用例2将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段，在2l的平衡缓冲液中加入40ml的病毒纯化高效保护试剂，层析柱平衡时能保护aav蛋白免于因ph值的降低或离子浓度的降低引起的蛋白变性。
18.应用例3将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段，在2l的平衡缓冲液中加入30ml的病毒纯化高效保护试剂，，层析柱平衡时能保护aav蛋白免于因ph值的降低或离子浓度的降低引起的蛋白变性。
19.应用例4将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的上样阶段，在200ml上样样品加2ml病毒纯化高效保护试剂，防止样品中aav或其它病毒的蛋白外壳变性、聚集和氧化。
20.应用例5将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的上样阶段，在200ml上样样品加4ml病毒纯化高效保护试剂，防止样品中aav或其它病毒的蛋白外壳变性、聚集和氧化。
21.应用例6将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的上样阶段，在200ml上样样品加3ml病毒纯化高效保护试剂，防止样品中aav或其它病毒的蛋白外壳变性、聚集和氧化。
22.应用例7将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的洗脱阶段，在1l洗脱缓冲液中加入10ml病毒纯化高效保护试剂，洗脱时能避免极端ph值导致aav变性失去生物活性，提高实心aav/空壳aav比例，提高aav产量。
23.应用例8将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的洗脱阶段，在1l洗脱缓冲液中加入20ml病毒纯化高效保护试剂，洗脱时能避免极端ph值导致aav变性失去生物活性，提高实心aav/空壳aav比例，提高aav产量。
24.应用例9将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的洗脱阶段，在1l洗脱缓冲液中加入15ml病毒纯化高效保护试剂，洗脱时能避免极端ph值导致aav变性失去生物活性，提高实心aav/空壳aav比例，提高aav产量。
25.对比例按照上述的应用例的方法，将上述实施例1中的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段、上样阶段和洗脱阶段，按照下表的添加方式，分别在层析平衡缓冲液中添加1%的病毒纯化高效保护试剂，在上样样品中加1%的病毒纯化高效保护试剂，在洗脱
缓冲液中加入1%的病毒纯化高效保护试剂；作为对照组，在平衡阶段、上样阶段和洗脱阶段都不加入保护液，分别检测aav病毒的细胞滴度和收率以及aav病毒的空壳实心比。
26.上述对比例中得到的检测数据如下表所示：通过上表可以看出，在平衡阶段或者在上样阶段或者在洗脱阶段添加本发明的病毒纯化高效保护试剂后，得到的aav病毒的细胞滴度和收率都比对照组中不添加保护液的数值更高，aav病毒的空壳实心比则更低，而在三个阶段都添加本发明的病毒纯化高效保护试剂后，得到的aav病毒的细胞滴度和收率比在单个阶段中添加病毒纯化高效保护试剂得到的数值更高，aav病毒的空壳实习比则更低。证明本发明的病毒纯化高效保护试剂用于层析纯化法中的平衡阶段、上样阶段和洗脱阶段都能保护aav病毒，避免aav或其他病毒的蛋白外壳在层析纯化中因条件发生剧烈变化导致蛋白构象改变，提高aav或其它类病毒的活性和产量。
27.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。