用于分析腹膜透析样品的方法

1.本发明涉及一种用于分析腹膜透析样品的方法。


背景技术：

2.晚期肾病患者通常依靠救生透析来清除尿毒症体内的盐和水。腹膜透析(pd)提供了特别的优势，例如，更多地远离医院透析中心、更好地保留残余肾功能以及在肾替代治疗开始时存活的优势。
3.不幸的是，这些优势被pd的局限性所抵消，包括作为技术失败的主要生理原因的腹膜炎的风险、炎症和膜衰竭。细菌感染的出现需要基于深刻诊断的快速和准确的决策。
4.引发pd意外终止的事件可以分为三类：i)患者患有腹膜炎(即炎症事件)；ii)患者患有腹膜恶化或iii)发生技术故障，其中技术故障是导致pd治疗意外终止的事件(包括移植、死亡、切换到血液透析等)的集合术语。
5.pd患者的管理目前主要依靠系统参数(即常规实验室血液、血浆或血清评估)和腹膜平衡试验(pet)，后者是腹膜转运的功能试验并且评估局部/腹膜参数。系统参数可能在诊断上结论性太迟，而且太不具体。pet是指导pd患者治疗机制的一种费力、耗时、成本密集的方法。长期监测家庭治疗患者、在三级护理中心只进行间歇性例行检查也是pd患者面临的挑战，往往导致并发症的发现晚。
6.在腹膜透析中，在下腹(即腹腔)引入特殊溶液(pd流体)，并且腹膜作为与血液交换的膜。随后，从腹腔中去除所引入的体积。去除的溶液是所谓的pd流出物。因此，pd流出物是直接从患者体内获得的流体。pd流出物含有大量的腹膜生物学以及膜以溶解分子的状态的信息。
7.各种研究使pd流出物在所含蛋白质、代谢物和细胞水平上的更深入表征(kratchwill 2016，aufricht 2017，herzog 2017，herzog 2018，wiesenhofer 2019)，其中任何一项都未被接受为预测生物标记物(aufricht 2017)。例如，透析相关腹膜炎患者中腹膜透析液的蛋白质组分析发现，蛋白β2微球蛋白是capd腹膜炎的生物标记物(wei-tung 2008)。虽然这些方法允许更广泛的生物学洞察力，但是它们比临床上适用的诊断测试更昂贵和耗时。
8.ara
ú
jo等人用质谱和主成分分析(pca)研究了pd流出物样品，以根据患者的肾脏疾病来分类患者，包括pd流出物样品中的蛋白质组分的化学损耗(ara
ú
jo 2016)。
9.在透析中已经建议光谱分析方法用于诊断和分析。美国专利申请us2004/0204634提出了一种用于监测血液透析的方法，包括获取样品(即患者血液)的拉曼光谱。拉曼光谱是一种散射技术。显示拉曼活性的分子要求极化率变化。wo2015/164620a1(us2017/045455a1)中描述了另一种基于拉曼光谱的方法。该方法要求确定样品中存在至少两种分析物的分析物模式。在实施例中，所述样品是在血液透析中出现的透析液。在血液透析液中，采用傅里叶变换红外光谱(ftir)测定尿素、葡萄糖和磷酸盐(jensen 2004)。ftir也被建议作为血液样品中癌症筛查的方法(barlev 2015)。
10.迄今为止，还没有公开分析pd患者的生物流体的方法，该方法允许分配临床参数以便为临床医师提供更好的工具来监测/管理透析制度和/或预测pd结果。


技术实现要素：

11.本发明提供了一种用于分析腹膜透析分析样品的方法，包括以下步骤：
12.a)提供来自受试者的分析样品，其中所述受试者接受腹膜透析，并且所述分析样品基于所述受试者的腹膜透析流出物；
13.b)在应用傅里叶变换红外光谱(ftir)的光谱分析步骤中，在4000cm-1
至400cm-1
的光谱范围内测量所述分析样品的样品光谱；
14.c)在比较步骤中，尤其是在计算步骤中，通过将所述样品光谱与由至少一个参考样品按照步骤b)中所定义的方式进行测量而获得的至少一个参考光谱进行比较，确定相似性值；
15.d)基于所述相似性值给所述分析样品分配临床参数。
16.本发明人发现ftir技术允许分析pd流出物样品，并且以直接的方式预测(即分配)具有临床重要性的参数。一项初步研究表明，即使基于一个小数据集，所述方法也可以高精度地分配pd相关参数和生理参数如免疫相关生物标记物的浓度(实施例1)。
17.因此，根据本发明的方法提供了一种快速、非侵入性且成本有效的获得pd治疗中重要临床参数的工具，所述工具允许评估患者状态并指导pd管理。
18.与酶联免疫吸附试验(elisa)等常规使用的分子检测相比，化学计量学辅助光谱学方法具有许多优点，因为它依赖于通过同时研究一系列不同分子对样品的“整体视图”，而不是识别和量化特定化合物。使用ftir技术，生成样品中主要生物化学成分的整体化学组成的光谱图(也称为分子光谱指纹)。
19.由于ftir还允许以较低的运行成本(无试剂、无标签、可重复使用的样品架)进行高通量分析，所以它非常适合大规模研究以及转化为每天进行的可临床使用的常规分析。
具体实施方式
20.在本发明的方法中，“样品”是基于接受pd的受试者的腹膜透析流出物(pde)的。pde是pd治疗的副产品，所述样品采集是直接的且对患者方便。
21.在优选的实施方式中，所述样品为腹膜透析流出物。
22.或者，所述pde可以进行样品制备，其中所述制备可以包括诸如离心和分离、稀释、冷冻、解冻冷却和/或干燥等步骤。所述样品可以作为液体或干样品来制备。
23.因此，在另一实施方式中，该样品由腹膜透析流出物来制备，特别是通过稀释腹膜透析流出物和/或冷冻和解冻腹膜透析流出物来制备。
24.如本文所使用的，术语“分析样品”是指使用本发明的方法待分析并且在步骤a中提供的样品。
25.另一方面，如本文所使用的，“至少一个参考样品”是指用于比较的样品。
26.分析样品和参考样品都是基于所述主题的pde。因此，关于准备分析样本的实施方式和优选方式分别或类似地适用于参考样品。优选地，与分析样品类似地制备(即应用相同或类似的制备步骤)至少一个参考样品。
27.在某些实施方式中，所述参考样本是基于pde的：
[0028]-与采集分析样品pde的受试者不同的pd受试者(即参考样品来自参考受试者)或
[0029]-与采集分析样品的pde的受试者相同的受试者。
[0030]
在第一种情况下，该方法依赖于具有不同生理状态和/或病理状态的个体受试者之间的差异(或相似性)。
[0031]
在第二种情况下，特别优选参考样品来自同一受试者，但是在不同的时间点进行。因此，该方法依赖于受试者可能随时间而变化的不同状态。第二种情况是特别有兴趣的，意味着纵向比较。在纵向比较的情况下，还可以随着时间的推移与参考样品的相对差异来确定相似值并分配临床参数，特别是在使用在不同时间点采集的一对参考样品进行训练的算法的情况下。
[0032]
优选地，参考样品与某一临床参数相关(或预先分配)。参考样品与定义的临床参数的分配或关系可以通过常规诊断来完成，例如，包括系统参数、pet数据、病史和医疗文档的评估。
[0033]
在本发明方法的步骤b)中，在应用傅里叶变换红外(ftir)光谱的光谱步骤中，在4000cm-1
至400cm-1
的光谱范围内测量光谱。
[0034]
分别基于分析样品和参考样品，对样品光谱和参考光谱相互独立地进行测量。然而，参照样品按照步骤b中所定义的方式进行测量，因此参照光谱与样品光谱类似地测量。因此，应用相同或类似的测量条件(即技术、光谱范围，
…
)测量至少一个参考光谱，并且与样本光谱相关的实施方式类似地适用于所述至少一个参考光谱。
[0035]“ftir光谱”是指吸收光谱技术。ftir取决于分子偶极矩的变化(与拉曼光谱相反)。根据红外光谱原理，利用傅里叶变换同时采集和处理红外区域光谱范围内的高光谱分辨率数据。
[0036]
本文所使用的ftir光谱包括ftir透射样品技术以及ftir衰减全反射(ftir-atr)。这两种技术都依赖于ftir原理。透射样品技术与atr的区别在于光在测量时对样品所采取的光路。在ftir透射样品技术中，光透射穿过样品。因此，优选或要求由液体或流体中获得诸如干燥样品等薄样品。atr技术可以在样品上反射光，而不需要透射。因此，可以使用atr分析液体或干燥样品。在本发明的方法中，可以优选作为液体样品的制备物，因为pde本身是液体，如果样品是液体，则可以省略作为耗时准备步骤的干燥过程。另一方面，与液体样品相比，干燥样品具有较高的生物分子浓度，并且可以获得更好的信号强度。
[0037]
因此，在一个实施方式中，通过应用ftir透射样品技术获得步骤b)中的所述光谱，其中在步骤a)中，所述样品是干燥的。在另一实施方式中，通过ftir衰减全反射(atr)获得步骤b)中的所述光谱，其中在步骤a中，所述样品以液体形式或干燥形式提供。
[0038]
本文所使用的术语“光谱”是指光学谱。如本文所理解的，术语光谱包括一个或多个样品光谱成分，所述光谱成分包括波数和吸光度值。在光谱步骤b)中，在光谱范围内确定多个光学值，其中多个光学值中的每个与某个波数相关。因此，任何光谱都可以是包括多对数据点(波数/吸收值)的数据集，即函数。
[0039]
根据本发明，在4000cm-1
至400cm-1
的光谱区域内测量所述样品光谱。在该范围内，某些子范围是特别感兴趣的，因为它们与生物分子有关。3000cm-1
至2800cm-1
的范围值得关注，因为与脂肪酸相关的信号出现在该光谱范围(脂肪酸区域)。1500cm-1
至1200cm-1
的范围
是值得关注的，因为与蛋白质和脂肪酸相关的信号出现在该光谱范围(混合区域)。1800cm-1
至1500cm-1
的范围值得关注，因为与蛋白质相关的信号出现在该光谱范围(蛋白质区域)。1200cm-1
至800cm-1
的范围值得关注，因为与碳水化合物相关的信号出现在该光谱范围(多糖区域)。初步数据确定1800cm-1
至1500cm-1
、1200cm-1
至800cm-1
的范围、它们的组合(1800至1500cm-1
1200至800cm-1
)以及1800cm-1
至800cm-1
的全范围是用于分析基于pde样品的首选区域(实施例1和3)。
[0040]
因此，在一个实施放手中，在步骤b)中，所述样品光谱是在选自以下光谱范围所组成的组中的至少一个光谱范围中进行测量：3000cm-1
至2800cm-1
、1500cm-1
至1200cm-1
、1800cm-1
至1500cm-1
、1200cm-1
至800cm-1
、1800cm-1
至800cm-1
以及它们的组合(例如，1800至1500cm-1
1200至800cm-1
)，优选1800cm-1
至800cm-1
、1800cm-1
至1500cm-1
和/或1200cm-1
至800cm-1
。
[0041]
在步骤c)中，通过将所述样品光谱与至少一个参考光谱进行比较来确定相似性值。
[0042]
在某些实施方式中，在步骤c)中，所述比较步骤包括对所述样本频谱、参考光谱或两者进行预处理。
[0043]
如此处所理解的，“预处理”可以包括计算光谱的n阶导数，其中n是自然数。在本说明书的内容中，术语“导数”以其在数学领域中已知的含义使用。术语“光谱的导数”表示函数的导数，其中独立变量是波长或波数，其中所述从属变量是光学值，其中，通过对样品的光谱测量所确定的光学值由该函数近似获得。在某些实施方式中，计算一阶、二阶、三阶、四阶或五阶导数，优选计算二阶导数。
[0044]
预处理还可以包括光谱的归一化，优选向量归一化。向量归一化按照如下方式进行：由液体样品确定多个光学值，其中，在特定的波数确定每个光学值。随后，提供一个函数，其中该函数包括多个x值和多个y值，其中每个x值对应于波数，每个y值对应于光学值，其中该函数描述x值与y值之间的关系。此外，确定多个y值的平均值，并且从每个y值中减去平均值，从而产生多个校正的y值。随后，计算每个校正的y值的平方，并确定所有平方的和。最后，将每个校正的y值除以所有平方和，从而形成多个向量归一化的y值，其中向量归一化的y值和确定各y值的波数构成向量归一化光谱。有利的是，矢量归一化允许更好地分析光谱，特别是光谱的比较。
[0045]
在一个实施方式中，所述预处理选自以下所组成的组：
[0046]-savitzky-golay平滑；
[0047]-多元散射校正(msc)；
[0048]-标准正态变换(snv)；
[0049]-光谱微分，例如，一阶、二阶、三阶、四阶或五阶微分；
[0050]-基线校正，例如，橡皮筋(rubber band)、自动加权最小二乘、惠特克滤波器(whittaker filter)；
[0051]-规范化；
[0052]-缩放，例如，平均中心化、块缩放(block scaling)；和
[0053]-它们的组合。
[0054]
在优选的实施方式中，所述预处理包括计算所述光谱的二阶导数以及随后该导数
的向量归一化以获得导出的向量归一化光谱。
[0055]
为了确定相似性值，将分析光谱与按照以上所定义的方式测量的至少一个参考光谱进行比较。在某些实施方式中，所述至少一个参考光谱被存储为数据集。以此方式，可以多次使用参考光谱来比较不同分析样品的样品光谱。
[0056]
优选参考光谱以类似于样品光谱的方式进行预处理。在该实施方式中，优选，所述预处理不是在步骤c)中进行，而是存储所述至少一个参考光谱进行预处理，例如，作为导出的向量归一化参考光谱。
[0057]
本文所使用的“相似性值”是来自比较步骤，特别是计算步骤的结果，其中所述分析样本直接或间接地与至少一个参考样品进行比较。例如，如果样品光谱更类似于参考光谱，则相似性值更大。根据比较步骤，所述相似性值可以是实数或自然数。所述相似性值也可以是一种类别，例如“是/否”；或转换为类别的数值，例如“低”、“高”或“无结果”。
[0058]
因此，在某些实施方式中，所述相似性值是数值变量和/或分类变量。
[0059]
在某些实施方式中，通过计算分析谱的统计学参数，特别是单变量统计学参数，更特别是均值或中值或多元统计学参数，并将参考光谱与统计学参数进行比较来确定所述相似性值。
[0060]
在某些实施方式中，使用算法来确定所述比较步骤中的相似性值，特别是在计算步骤中，其中所述算法包括机器学习模型的应用。
[0061]
基于机器学习模型的算法是优选的算法，因为它们是动态性质的，即：可以递增地扩展参考样本集以随着时间的推移进一步改进该算法。
[0062]
本领域技术人员可以根据临床参数的性质、参考样品的数量和质量选择用于计算相似性值的方法。例如，在某些实施方式中，所述机器学习模型选自以下所组成的组中：
[0063]-神经网络，例如，人工神经网络(ann)、卷积神经网络(cnn)；
[0064]-支持向量机；
[0065]-判别分析，例如，线性/二次/马氏判别分析、偏最小二乘判别分析、典型变量分析、判别函数分析；
[0066]-k-近邻算法(也简称为k-nn)；
[0067]-回归分析，例如，线性回归、多元线性回归、主成分回归、偏最小二乘回归分析、逻辑回归；
[0068]-基于进化的算法，例如，遗传算法、遗传编程/计算、进化编程；
[0069]-回归和决策树学习，例如，分类和回归树(cart)、梯度增强树、自举聚合决策树，包括随机森林；
[0070]-自适应增强；以及
[0071]-它们的组合。
[0072]
在更特定的实施方式中，该算法基于主成分分析
‑‑
线性判别分析(pca-lda)或主成分分析
‑‑
马氏判别分析(pca-mda)。
[0073]
如实施例中所示的，基于计算主成分(pca)来确定相似性值，可以成功地将临床参数分配给调查样品，即：预处理光谱的多元参数(二阶导数，归一化)，并应用基于线性判别分析(lda)或马氏判别分析(mda)的算法。
[0074]
机器学习模型是通过被称为训练(监督或无监督)的过程来创建的。在本发明的方
法中，所述训练可以依赖于一组参考光谱。通过按照步骤b)中所定义的方式测量多个参考样品来获得参考光谱集。即：参考光谱集包括多个参考光谱。参考光谱是由与所述样品光谱类似或相似的参考样品中来测量的。优选地，每个参考样品是其中定义了某些临床参数的样品。
[0075]
在使用算法的实施方式中，例如，在计算步骤c中基于机器学习模型，使用一组参考光谱来训练该算法(或机器学习模型)。
[0076]
当在步骤c中应用机器学习模型时，相似性值被确定为模型的输出值。在这些情况下，所述样品光谱与至少一个参考光谱的比较可以是间接的。机器学习算法包括训练过程中参考光谱的信息，然后在基于(处理)样品光谱计算相似性值时应用它。
[0077]
在步骤d)中，根据步骤c中确定的相似性值，所述分析样品被分配给临床参数。因此，用于分析腹膜透析分析样品的方法的结果是预测所述分析样品的临床参数。
[0078]
本文所用的术语“临床参数”包括人口统计学参数、生理学和病理学参数，包括生物标记物浓度、透析相关参数和结果参数。
[0079]
应当理解的是，步骤d)中分配的临床参数与预先分配给参考样品的特定临床参数具有相同的性质。因此，可以针对分析样品分析的临床参数取决于用于训练所述算法的至少一个参考样品的预先分配或所述参考光谱组。
[0080]
在优选的实施方式中，在步骤d)中，所分配的临床参数选自包括生物标记物浓度、透析相关参数和结果参数的生理学参数和病理学参数。通过基于ftir技术的方法分配此类临床参数，可以使临床医师比其他方法更快地获得参数。此外，复杂的结果参数将有助于指导临床医生(和/或患者)在pd期间的决策。
[0081]
此外，其他描述性人口统计学参数如年龄被证明对pde光谱有判别作用(实施例1)。因此，这些参数还可以包括在确定相似性值的步骤中，和/或可以根据本发明的方法分配这些参数用于对比。
[0082]
因此，在一个实施方式中，临床参数是描述性人口统计学参数，优选地选自透析制度(例如，自动循环pd与手动capd)、pd持续时间、共同发病率、血压、体重指数、性别和年龄。
[0083]
在一个实施方式中，所述临床参数是选自以下所组成的组中的透析相关的参数：残余尿量、超滤、残余物清除率、透析液与血浆肌酐之比、残余肾小球滤过比率、腹膜小溶质转运率、传质面积系数、有效淋巴吸收率、经毛细血管超滤比率、自由水转运和钠浸。
[0084]
在某些实施方式中，所述临床参数是选自以下所组成的组中的人口统计学参数：透析制度(例如，自动循环pd与手动capd)和pd持续时间，和/或透析相关的参数选自以下所组成的组中：超滤(腹膜超滤)、透析液与血浆肌酐比值、腹膜小溶质转运率、传质面积系数、有效淋巴吸收率、经毛细血管超滤率、自由水转运和钠浸。这些临床参数对腹膜透析是特定的、对腹膜透析管理是有着特殊的意义。
[0085]
在另一实施方式中，所述临床参数是选自以下的人口统计学参数：共患病率、血压、体重指数、性别和年龄；和/或透析相关的参数选自以下所组成的组中：残余尿量、残余清除率和残余肾小球滤过率。这些参数与腹膜透析不是特别相关，但是例如在血液透析期间也是很重要的。残余尿量、残余清除率、残余肾小球滤过率等参数对水和电解质平衡的管理也具有普遍意义。
[0086]
在另一实施方式中，所述临床参数是生物标记物浓度，其中生物标记物选自：蛋白
质如细胞因子和趋化因子(例如，白细胞介素8、白细胞介素-6)和热休克蛋白(hsps；例如，hsp72)或代谢产物如氨基酸(例如，谷氨酰胺)、和生物胺(例如，蛋氨酸亚砜)。通常，所述生物标记物浓度代表pd流出物中的浓度。
[0087]
在另一实施方式中，所述临床参数是指示以下结果的结果参数：
[0088]-受试者患有或发展为腹膜炎的风险；
[0089]-受试者患有或发展为腹膜恶化的风险；和/或
[0090]-技术故障的风险。
[0091]
因此，根据本发明的方法允许分析用于预测腹膜透析的结果的风险类别的腹膜透析样品。所述结果可能是受试者患有或发展为腹膜炎的风险，受试者患有或发展为腹膜恶化的风险和/或腹膜透析技术失败的风险。
[0092]
本发明进一步由以下实施例来说明，这些实施例不应被解释为将本发明限制在其中所描述的具体程序中。
[0093]
实施例
[0094]
实施例1-透析相关参数的分配和生物标记物浓度
[0095]
患者
[0096]
pd流出物样品是在维也纳医科大学(奥地利)的肾脏学系进行的前瞻性随机、开放标签、两期交叉i/ii期研究中获得的。研究和研究方案已由维也纳医科大学地方道德委员会批准(ek 867/2010，ek 1167/2013，ek 2035/2015)，并且在www.clinicaltrials.gov(nct01353638)上注册。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。所有患者在试验参与前均提供书面知情同意书。先前已经描述研究设计、资格标准、随机化、临床方法、患者特征和不良事件(kratchwill 2016)。总之，根据方案对20名稳定pd患者(13名男性/7名女性，平均年龄58岁，平均pd年份为2.4年)进行治疗。患者经临床诊断稳定，并且无严重伴发疾病(5例患者在采集样本前有3个月以上腹膜炎史)。
[0097]
在透析液滴注至患者腹腔(＝时间点0)和4小时(＝时间点4小时)之后立即在标准收集管中收集流出物样品而无任何抗凝剂(vacuette,bio-greiner-one,kremsm
ü
nster，奥地利)，即在两次标准腹膜平衡试验结束后，一次使用商用pd流体(dianeal，3.86％葡萄糖，巴克斯特公司(baxter)，美国伊利诺斯州狄尔菲尔德(deerfield，il，usa))，另一次使用相同pd流体，并添加8mm的丙氨酸谷氨酰胺(ala-gln)(n(2)-丙氨酸-l-谷氨酰胺200mg/ml，费森尤斯卡比公司(fresenius kabi)，德国巴特洪堡市(bad homburg,germany))，按随机顺序进行。两次腹膜平衡试验被28～35天的洗涤时间隔开。
[0098]
样品收集和制备
[0099]
在收集后立即离心(250后立，10分钟)pd流出物，并将无细胞上清液样品等分并且存储于-80℃的温度下直到进一步分析。在维也纳综合医院临床实验室通过标准方法，对血清(pet测试2小时)和透析液标本进行了生化测量和腹膜循环和全身循环之间的转运动力学分析。通过jaff学反应动力学测量测定pd流出物肌酐浓度，并通过测定用相同方法测量未使用的pd流体的校正因子，校正高血糖水平。用免疫系统(西门子公司，奥地利维也纳)或生物丛珠阵列(bio-plex bead array)(bio rad公司，加利福利亚州赫拉克勒斯市(hercules，ca))测定pd流出物白细胞介素6(il-6)和白细胞介素8(il-8)浓度。
[0100]
样品制备与ftir光谱
[0101]
将pd流出物样品随机分分组，并且进行盲测和盲法分析。首先，将pd流出物样品解冻，并且随后在硒化锌(znse)光学板上点滴30μl的未稀释或稀释的nacl(1:2或1:5)，并在40℃下干燥30分钟。在透射模式下，使用与tensor 27ftir光谱仪(bruker光学公司，ettlingen,germany)耦合的hts-xt微型板适配器并且使用以下参数来进行红外光谱采集：4000～500cm-1光谱范围、6cm-1光谱分辨率、零填充因子4、哈布斯三期切趾法(blackmann harris 3-term apodization)和32幅干涉图(32interferograms)，对每个光谱均采用背景减除(grunert 2013)以进行平均。总共记录了来源于20例pd流出物样品的79个光谱(0小时流出物，n＝39，4小时流出物，n＝40)。
[0102]
光谱预处理与分析
[0103]
使用软件opus 7.2(bruker光学公司(bruker optics gmbh))进行光谱预处理和减法光谱分析。为了提高后续化学计量学分析的稳健性，进行了光谱预处理以提高光谱分辨率、最小化基线偏移以及调整不同样品制备之间的生物量变化。通过如下方法对原始吸收光谱在整个光谱范围(4000～500cm-1
)内进行预处理：(1)向量归一化，然后进行基线校正；(2)使用9-平滑点savitzky-golay滤波器，然后进行向量归一化，对原始光谱的二阶导数预处理，后一种方法用于计算减法光谱、无监督化学计量学分析和监督分类(grunert 2014、grunert 2016)。
[0104]
采用以下基于监督学习的分类算法，使用高分辨蛋白质(1800～1500cm-1
)或多糖(1200～800cm-1
)光谱区域对光谱数据进行分类：主成分分析
‑‑
线性判别分析(pca-lda)；主成分分析
‑‑
马氏判别分析(pca-mda)。
[0105]
无监督和监督的化学计量学
[0106]
所有多变量分析均使用软件uncombler x(camo软件，挪威奥斯陆市)进行。采用主成分分析(pca)对预处理的数据进行无监督化学计量学。
[0107]
pca计算是基于奇异值分解(svd)算法，并且在蛋白质(1800～1500cm-1
)或多糖(1200～800cm-1
)的光谱范围内进行。分数图用于探索性数据分析，并且显示类别之间可能存在的区别，而负荷图提供有关光谱区域的信息。
[0108]
采用主成分分析线
‑‑
性判别分析(pca-lda)和主成分分析
‑‑
马氏判别分析(pca-mda)对预处理数据进行监督化学计量学分析。当两类之间的差异用线性函数表示时，采用线性判别分析法(lda)；而马氏方法(mda)使用椭圆来定义距离。对于pca-lda和pca-mda，使用了以下参数：pca投影的7个分量，假设先验概率相等以及所有变量的权重相等。
[0109]
将样本分为两个不同的数据集：1)停留4小时(n＝20)后没有ala-gln的pd流出物样品，以反映日常pd程序中的情况；或者(2)在停留4小时后，将未使用和使用ala-gln的两种处理的样品合并(n＝40)，以获得每组足够的数据，从而进行pca-lda和pca-mda分析。
[0110]
临床参数
[0111]
所有与临床参数相关的可用数值数据集被分成两个平衡组，并在类别变量中进行转换，以实现二元分类问题，该问题允许分配类别相似性值。分类率(％)被用作分类性能度量，其定义为两个类别中每个类别的个体准确度(％)之间的平均值，这两个类别解释了不平衡的数据集，而不是计算总体正确猜测(gajjar 2013)。
[0112]
结果
[0113]
主成分分析
‑‑
线性判别分析(pca-lda)和主成分分析
‑‑
马氏判别分析(pca-mda)
的所有结果被绘制为混淆矩阵，并且所有总准确度汇总在以下表中，其中所述缩写表示如下：治疗a(treatment a)：用8mm的ala-gln补充pd流体；治疗b(treatment b)：标准pd流体，capd：连续可活动性腹膜透析，uf：超滤，il：白细胞介素，d/p crea：透析液与血浆肌酐比率，glu：仅基于葡萄糖的pdf透析史，ico：基于艾考糊精(icodextrin)的pdf透析史。
[0114]
表1.患者相关参数的分类率(％)
[0115]
[0116][0117]
基于与患者特征、年龄和性别相关的ftir光谱数据的分类结果如表1所示。在蛋白质或多糖光谱区域，使用pca-mda对患者年龄(60岁以上/60岁以下)的两个数据集(n＝20和n＝40)获得了高分类率(分类率两个。从女性和男性患者身上提取的pd样品之间的差异显示没有最喜欢的光谱范围或分类器，并且总准确率最高为78.3％(n＝40，蛋白质区域的pca-mda)。因此，ftir光谱数据建模为pd流出物样品的年龄相关分子特征的存在提供了证据，能够区分年龄小于或大于60岁的患者。
[0118]
与治疗史相关的进一步人口统计学数据，例如，治疗形式(97.5％)或pd治疗时间(88.3％)。这些数据的分配可能与患者分层和临床表型的理解有关。
[0119]
表2.透析相关参数的分类率(％)
[0120]
[0121][0122]
与pd治疗相关的生理参数的分配(表2)可能具有诊断价值。透析液与血浆肌酐比值(100.0％)和超滤(100.0％)在多糖区获得最高的分类率，而蛋白质区在残余尿量(100.0％)和残余清除率(89.0％)样品参数方面的分类率最高。
[0123]
目前，超滤和透析液与血浆肌酐的比率等参数是通过时间广泛的腹膜平衡试验确
定的。残余尿量和残余清除率需要进一步收集尿液。所希望的是更快地获得类似的信息，例如，使用光谱法分析腹膜透析样品。此外，这些参数可以很好地反映透析的技术性能。
[0124]
表3.生理参数如生物标记物浓度的分类率(％)
[0125]
[0126][0127]
此外，参见表3，pd光谱特征与指示炎症(il-8，il-6)和应激反应(hsp)的生物标记物之间的明确相关性可以显示出来。利用蛋白质和多糖区(100.0％)可以很好地预测热休克蛋白hsp。利用多糖区预测il-6的分类率为88.1％。蛋白质和多糖光谱区对来自有或无腹膜炎患者的样品的鉴别率为83.3％。但是，利用pca-mda通过将使用的光谱窗口缩小到850～800cm-1
在多糖光谱区内，可以进一步提高到92.5％的总准确率(未显示数据)。
[0128]
生物标记物的浓度可以通过其他方法获得，并且一些单独生物标记物已被证明与腹膜膜状态(例如，il-6流出物浓度和腹膜小溶质转运率(pstr))相关(lambie 2013)。然而，基于光谱的分配可以提供一种更容易获得生物标记物信息的方法。
[0129]
此外，这些数据清楚地表明，样品光谱包含了关于受试者生理状态(例如，炎症)的宝贵信息。
[0130]
实施例2-具有结果参数的参考样品
[0131]
基于实施例1所示概念的证据，合理的是，基于样本光谱可以获得与患者疾病状态直接相关性，而不需要对单个生物标记物进行识别和量化，条件是给出一组预先分配的参考样品。
[0132]
pd样品可以用于奥地利治疗的患者队列(约n＝340)，主要在2010年至2019年期间在维也纳医科大学进行治疗的患者。
[0133]
在该组中大约85例有经验的腹膜炎(总共约180次感染发作)，进行了大约500次腹膜平衡试验(表征膜状态和/或膜故障和运输特性)，并且记录了大约400个技术失败事件。
[0134]
总共有大约7800个样品可用。在某些情况下，每个患者可获得多个样品(纵向剖面)，在其他情况下，每个患者只能提供一个样品。
[0135]
根据这些数据，可以将采样的参考样品被分配给临床结果参数。因此，该数据构成训练算法的基础，该算法计算受试者的pde样品的相似性值，并且所述pde样品可以被分配给指示以下结果的临床参数：
[0136]-受试者患有或发展为腹膜炎的风险；
[0137]-受试者患有或发展为腹膜膜恶化的风险；和/或
[0138]-技术故障风险。
[0139]
实施例3-疾病状态的分配
[0140]
在实施例2中描述的数据中选择样品子集。选择18个被分配有“急性腹膜炎”的pde样品，以及22个取自没有急性腹膜炎患者的pde样品作为对照组。选择对照组，使得其与患有腹膜炎的pde样品组在标准性别分布、pd治疗时间和年龄方面相匹配。
[0141]
腹膜炎患者接受pd治疗平均15个月(范围0～77个月)，患者年龄中位数为48岁(范围1～85岁)，与pd流出物样品相关的患者性别分布相似。对照样品的性别相同，pd治疗时间相似(中位差异为0.2个月(iqr：0.06～0.71))以及年龄相似(中位差异为5.9岁(iqr：3.1～11.6))。
[0142]
制备所有的pde样品，并且通过类似于实施例1的过程的ftir光谱法进行测量。对样品进行三次测量，共产生120个ftir光谱，其中54个光谱被分类为“腹膜炎”，以及66个光谱被分类为“腹膜炎阴性”。
[0143]
类似于实施例1，基于预处理光谱(二阶导数，归一化)对数据进行主成分分析(pca)，并应用基于线性判别分析(lda)或马氏判别分析(mda)的算法。
[0144]
表4.基于特定生物分子的光谱范围的急性腹膜炎分类率(％)
[0145][0146]
表5.基于组合且更大的光谱范围的急性腹膜炎分类率(％)
[0147][0148]
表4和表5显示了不同光谱范围的分类率。通过这两种分析模型，包括多糖和含磷分子信号在内的范围表现略好于蛋白质范围(表4)。然而，来自这两个范围的数据表明：涉及ftir光谱的腹膜透析分析方法可以用于给分析样品分配临床结果参数。
[0149]
由表4和表5的比较中可以看出：关于整体预测精度方面，更宽的光谱范围产生了甚至更好的结果。据信通过ftir指纹获得的整体信息有助于用于分析pd样品的方法预测复杂的临床参数，即使不区分和确定单个标记分子。
[0150]
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