一种氨基糖苷类抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用

1.本发明属于农业、食品和环境检测技术领域，具体涉及一种氨基糖苷类 抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用。


背景技术：

2.氨基糖苷类抗生素(ags)是一类广谱抗生素，多为极性化合物，易溶 于水，其分子是由一个氨基环醇和一个或多个氨基糖分子通过苷键连接而成。 ags大部分是由不同种类的链霉菌和小单孢菌产生的，如卡那霉素、新霉素、 链霉素、庆大霉素、妥布霉素和大观霉素等，还有一些是人工半合成的，如 奈替米星、阿米卡星和阿贝卡星等。ags作为一种重要的抗菌药物主要是通 过抑制细菌蛋白质合成过程和破坏细菌细胞膜的完整性而发挥杀菌作用的， 临床上主要用于治疗革兰氏阴性菌如肠杆菌属、克雷伯菌属、变形菌和铜绿 假单胞菌以及葡萄球菌引起的各种中重度呼吸系统感染、尿路感染、肠道感 染、皮肤及软组织感染等，链霉素和阿米卡星等药物还可以用于结核病的二 线治疗。ags价格低廉且具有良好的抑菌效果，不仅在临床中有着广泛应用， 也被大量用于畜牧业中，作为兽药和生长因子使用。然而ags对人体的肾 毒性和耳毒性等副作用较为明显。若过度使用抗生素，这些抗生素一部分被 排出体外，对环境造成污染，另一部分残留在动物体内，随着食物链累积传 递，最终都进入人体，从而给人体健康带来了巨大危害，而且抗生素的滥用 会加速抗生素耐药性的传播，使人体免疫力降低。鉴于ags残留的危害，目 前许多国家都规定了ags的最高残留限量(maximum residue limit，mrl)。
3.目前肥料、食品、饲料和粮食样品中的氨基糖苷类抗生素检测方法主要 有微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。酶联 免疫吸附分析法(elisa)作为一种重要的免疫分析方法，是目前最受欢迎 的抗生素残留快速检测方法之一。相关学者已经用单克隆抗体直接竞争的方 法测定了动物牛奶和血浆中的新霉素和链霉素残留量，该方法具有较高的特 异性，与其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应，建立了牛奶中快速筛选检测方 法。免疫分析方法虽然操作简单，但检测耗时较长且试验结果误差较大，对 结构类似的抗生素有一定的交叉干扰，容易发生假阳性。高效液相色谱法和 液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点， 是目前常用的方法。但ags是一种极性很强的化合物，在传统的反向液相色 谱中保留性较差，并且ags缺少发色团和荧光团，因此不能直接使用紫外或 荧光检测器进行检测，一般采用衍生法将其衍生后再用紫外检测器或荧光检 测器进行检测。利用衍生器的hplc检测方法使仪器条件更为复杂，额外的 前处理步骤会导致分析物质的损失，过量的试剂和衍生产物也可能会对分析 结果产生干扰。液相色谱串联质谱分析法检测灵敏度高、检测限低、定量准 确，是目前国际上公认的ags定量方法。国内外已经建立了乳制品中链霉素、 卡那霉素等10种ags残留的高效液相色谱串联质谱检测方法。乳制品提取 液经亲水亲脂平衡柱净化后，采用反相离子对高效液相色谱分离，电喷雾串 联四极杆质谱检测。但ags类化合物结构相似导致碎片化后离子相似，
使 ags的定量检测面临重大挑战。此外，使用lc-ms/ms进行ags检测需要 使用挥发性流动相添加剂，这将不利于仪器的长期维护。利用仪器分析法检 测时需要对样品基质进行预处理，ags具有强极性，在水溶液中以聚阴离子 的形式存在，因此提取过程具有诸多困难，通常采用固相萃取(spe)法提 取净化，由于spe法选择性较低，样品在处理后会有一定的损失，不可避免 地为最终定量结果带来误差。因此，建立高选择性、快速有效的样品前处理 技术已成为氨基糖苷类抗生素检测分析中亟需解决的重要问题。发展高选择 性、高效率的吸附剂是目前固相萃取技术的主要研究方向，基于核酸适配体 功能化材料的spe方法具有高选择性和强特异性的特点，近年来受到广泛关 注。
4.适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧 核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)序列(10～100个碱基)。单链的核 酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的 亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)进行多 次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避 免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体 功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究还处于起步阶段，但 是已经表现出一些有别于抗体的优势，如批次间稳定性一致，易修饰，无免 疫原性等。
5.基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利 用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化， 这种吸附是可逆的。适配体亲和柱结合常规仪器分析已成为痕量污染物分析 的一个重要发展方向。
6.目前，国内外报道的适配体亲和柱主要针对赭曲霉毒素和黄曲霉毒素， 且主要针对单一靶标，目前，国内外可以富集净化一类具有共同母核化合物 的适配体亲和柱尚未见报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种氨基糖苷类抗生素适配体，本发明的另一目 的在于提供氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱及其制备方法。本发明的再一目 的在于提供氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱在富集和纯化，以及净化样品中 氨基糖苷类抗生素中的应用。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案 为：
8.一种氨基糖苷类抗生素核酸适配体，其核酸序列如seq id no.1所示。
9.如上所述氨基糖苷类抗生素核酸适配体在制备检测试剂、检测试纸条、 检测试剂盒、亲和柱或在检测中的应用。
10.本发明提供所述适配体的以下任一应用：
11.(1)在制备氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱中的应用；
12.(2)在制备氨基糖苷类抗生素的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中 的应用；
13.(3)在氨基糖苷类抗生素检测中的应用。
14.进一步优选地，如上所述的氨基糖苷类抗生素包括tob(妥布霉素)、 kana(卡那霉素a)、kanb(卡那霉素b)、ami(丁胺卡那霉素)。
15.本发明提供的一种氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱，所述亲和柱的填料 是以n-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将如上所述的核酸适配体 (seq id no:1)与载
90％和100％丙酮溶液清洗，再用二氧六环清洗数次(优选5-8次)，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到三角瓶(优选100ml具塞三角瓶)中，加入10-15ml二氧六环、1-5gnhs和1-5gn,n-二环己基碳酰亚胺(dcc)，25-30℃振荡反应8-12h；最后依次用二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到nhs修饰的琼脂糖(作为载体)，于异丙醇中避光贮存备用；
32.2)氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体的制备
33.在核酸适配体的3’端通过共价键连接c7间接臂-(ch2)
7-，然后在c7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体；
34.3)nhs修饰的琼脂糖的洗涤：取300-500μl所述nhs修饰的琼脂糖于离心管(优选容积1.5-2ml的离心管)中，用1-1.5mm盐酸(优选1mm)洗涤数次(优选2-5次)，每次1-2ml，得到洗涤后的载体；
35.4)适配体复性：取1-5od所述氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体溶于na2hpo4缓冲液200-1000μl中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min，得到复性的适配体溶液；其中，所述na2hpo4缓冲液为含200mmna2hpo4和5mmmgcl2的水溶液，ph8.0；
36.5)偶联：向步骤3)洗涤后的载体中加入步骤4)复性的适配体溶液200-1000μl，于25-35℃(优选30℃)摇床震荡过夜；
37.6)封闭：步骤5)所得偶联产物离心去上清后，加入1-5ml封闭缓冲液，于30-40℃摇床震摇反应2-5h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；其中，封闭缓冲液为含有0.2％bsa，0.1mmes和0.15mnacl的水溶液，ph值为6.0。
38.7)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液洗涤数次(优选3-5次)，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1-5ml结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，清洗缓冲液为含有50mm的tris-hcl，0.15m的nacl的水溶液，ph值为7.2；结合缓冲液为含有10mm的trishcl，120mm的nacl，5mm的kcl和1mm的mgcl2的水溶液。
39.8)装柱：取容积1-5ml的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-2cm(优选1cm左右)，加入0.02-0.05％w/vnan3(优选0.05％w/v)溶液0.5-3ml，于4-10℃(优选4℃)保存。
40.优选地，前述方法中步骤1)-8)如下：
41.1、nhs修饰的琼脂糖的制备
42.①
将10ml琼脂糖凝胶4ff水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用琼脂糖凝胶5倍体积的100％二氧六环洗涤5次，抽干，转移到100ml具塞三角瓶中，加入10ml二氧六环、100μl烯丙基缩水甘油醚和300μl三氟化硼乙醚，35℃下140rpm水浴摇床中反应45min。反应后的基质依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用大量去离子水洗涤干净，得到活化基质。
43.②
巯基乙酸羧化：取10ml活化基质，加入1.20ml巯基乙酸、10ml去离子水、0.25g过硫酸铵，60℃下反应8h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶。
44.③
nhs基团的偶联：取10ml巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30％、90％和100％丙酮溶液清洗，再用100％二氧六环清洗5次，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到100ml带塞三角瓶中，加入10ml二氧六环、1gnhs和1gdcc，25℃振荡8h；最后依次用大量二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到nhs修饰的琼脂糖
他复杂样本中氨基糖苷类抗生素的净化和富集，一次净化能够除去绝大部分 干扰物，净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测，具有广阔 的应用前景。
65.本发明充分利用了核酸适配体的高特异性、高亲和力的优点，利用氨基 糖苷类抗生素适配体特异性结合样品中的氨基糖苷类抗生素，一次净化可识 别具有相同共有基团的一类化合物，亲和柱的净化效率大幅度提高。核酸适 配体受操作环境和有机溶剂的影响较小，尤其适合极性较强氨基糖苷类化合 物的纯化。相比之下，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂的 存在常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂可能 导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可 以耐受有机溶剂，可反复多次使用，大幅度降低了使用成本。
66.本发明提供的核酸适配体通过体外化学合成法获得，以核酸适配体代替 抗体作为识别元件，与传统的免疫亲和柱相比，能够保证序列的正确性、批 间的一致性，大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下，不同批次的抗体 来自于不同的小鼠或兔子，导致抗体间质量差异较大，从而使免疫亲和柱的 质量存在批间差。本发明提供的氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体dna 与n-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖发生共价偶联，偶联产物稳定，且偶联率 高。
67.本发明以筛选到的氨基糖苷类抗生素dna适配体作为亲和元件，制备 用于净化富集氨基糖苷类抗生素的适配体亲和柱。在实际样品检测前用于去 除样品中的杂质，降低了前处理成本和时间，提高前处理的效率，在基层和 实验室检测中有广泛的应用前景。
68.样品提取液经本发明的适配体亲和柱净化后，所得氨基糖苷类抗生素纯 度高，后续无需再做其他纯化处理，可以直接用于高效液相色谱等仪器检测， 节省了操作者的时间，并降低了检测的费用。
附图说明
69.图1为亲和柱结构示意图；
70.图2为适配体亲和柱制备和工作原理；
71.图3为不同ph的上样液的回收结果(n＝3)；
72.图4为含不同乙腈浓度的洗脱液洗脱效果(n＝3)；
73.图5为含不同甲酸浓度的洗脱液洗脱效果(n＝3)；
74.图6为ags-aac对目标物的承载能力；
75.图7为ags-aac不同使用次数的回收结果(n＝3)；
76.图8为ags-aac对氨基糖苷类抗生素的特异性。
具体实施方式
77.本发明的构思如下：将高特异性、高亲和力的氨基糖苷类抗生素适配体 通过c7或c6间接臂进行氨基化修饰后与n-羟基琥珀酰亚胺修饰的载体通 过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到氨基糖苷类抗生素特异性亲和柱填 料，装柱后制成高亲和力的适配体亲和柱。
78.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在 不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于 本发明的范畴。
79.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
80.实施例1利用氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体制备适配体亲和柱
81.1、nhs修饰的琼脂糖的制备
82.①
将10ml琼脂糖凝胶4ff水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用琼脂糖凝胶5倍体积的100％二氧六环洗涤5次，抽干，转移到100ml具塞三角瓶中，加入10ml二氧六环、100μl烯丙基缩水甘油醚和300μl三氟化硼乙醚，35℃下140rpm水浴摇床中反应45min。反应后的基质依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用大量去离子水洗涤干净，得到活化基质。
83.②
巯基乙酸羧化：取10ml活化基质，加入1.20ml巯基乙酸、10ml去离子水、0.25g过硫酸铵，60℃下反应8h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶。
84.③
nhs基团的偶联：取10ml巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30％、90％和100％丙酮溶液清洗，再用100％二氧六环清洗5次，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到100ml带塞三角瓶中，加入10ml二氧六环、1gnhs和1gdcc，25℃振荡8h；最后依次用大量二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到nhs修饰的琼脂糖载体，于异丙醇溶液中避光贮存备用。
85.2、氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体的制备
86.本发明的核酸适配体，其序列seqidno.1:cgtcatgccaaatgtgcccttggtctgcgttttgtg是以卡那霉素模板分子作为靶标，采用capture-selex的方法筛选获得的适配体。在核酸适配体(核酸序列如seqidno.1所示)的3’端通过共价键连接c7间接臂-(ch2)
7-，然后在c7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体。
87.3、nhs修饰的琼脂糖的洗涤：取300μl上述获得的nhs修饰的琼脂糖置于1.5ml离心管中，用1mm的盐酸洗涤2次，每次1ml，得到洗涤后的载体。
88.4、适配体复性：取1od所述氨基修饰的氨基糖苷类抗生素适配体溶于na2hpo4缓冲液500μl中，于95℃复性5min，然后室温放置30min，得到复性的适配体溶液。其中，na2hpo4缓冲液为：含有200mmna2hpo4，5mmmgcl2的水溶液，ph值为8.0；
89.5、偶联：向步骤3洗涤后的载体中加入步骤4复性的适配体溶液500μl，于30℃摇床震荡过夜，得到偶联产物。
90.6、封闭：步骤5所得偶联产物离心去除上清后，加入1ml封闭缓冲液，于30℃摇床震摇反应2h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶。其中，封闭缓冲液为含有0.2％bsa，0.1mmes,0.15mnacl的水溶液，ph值为6.0。
91.7、洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液洗涤5次，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1ml结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液(作为柱填料)准备装柱。其中，清洗缓冲液为含有50mm的tris-hcl，0.15m的nacl的水溶液，ph值为7.2；结合缓冲液为含有10mm的trishcl，120mm的nacl，5mm的kcl和1mm的mgcl2的水溶液，ph8.0。
92.8、装柱：将上述偶联胶悬液用5ml结合缓冲液重悬，然后装入空的spe柱管中。具体地：
93.(1)取空的1mlspe柱管，垫好下方筛板(孔径10μm)，然后加入1ml结合缓冲液，使
aac几乎能够有效的保留全部 目标物，且柱容量达到最大值；当总加载量超出8μg时，过多的目标物未能 被ags-aac完全捕获。因此，ags-aac的最大承载量为8μg。
107.(五)ags-aac重复使用次数的考察
108.选择三个新的ags-aac，将500ng/ml的4种ags混合标准品(四种 ami，tob，kanb和kana分别是500ng/ml)分别加载到亲和柱上连续 进行25次的提取净化。在每一次富集净化结束后，加入5ml的结合缓冲液 使ags-aac再生。结果ags-aac重复使用23次后，4种ags的回收率均 很高，平均回收率为77.29％～115.83％，rsd为0.82％～14.39％，结果见图7。 结果表明，ags-aac可重复使用20余次而不影响适配体对目标物的亲和力。
109.(六)ags-aac特异性的考察
110.抗生素种类众多，按结构不同主要分为β-内酰胺类、大环内酯类、四环 素、喹诺酮类、氨基糖苷类等。氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通 过苷键链接起来的苷类抗生素，拥有共同的母核结构(2-脱氧链霉氨的环己 六醇)，链霉素除外，链霉素含有链霉氨(2个氨基取代的环己六醇)。本 发明为考察ags-aac对ags类别的特异性，选取了几种具有代表性的抗生 素分别加载到ags-aac上。将诺氟沙星(nfx)、四环素(tc)、头孢西 丁(ceft)、磺胺对二甲氧嘧啶(smx)、磺胺喹噁唑啉(sqx)、磺胺 间二甲氧嘧啶(smm)、罗红霉素(rtm)、链霉素(str)、庆大霉素(gen)、 kana、kanb、tob、ami各500ng/ml分别加载到ags-aac上，并分 别收集上样液(含有10mm的tris hcl，120mm的nacl，5mm的kcl 和1mm的mgcl2的水溶液)、淋洗液(含有10mm的tris hcl，120mm 的nacl，5mm的kcl和1mm的mgcl2的水溶液)、洗脱液(5％甲酸的 乙腈-水(40：60，v/v))，测定各组分回收率。结果如图8所示，除ags外 其他类别抗生素均在上样及淋洗部分检出，即未能被ags-aac有效捕获。 链霉素由于结构中不具备kana-aptamer识别的母核结构，不能有效保留， 其余4种卡那霉素a、卡那霉素b、妥布霉素、丁胺卡那霉素ags洗脱液组 分中回收率较高(》70％)。因此可以得出结论，ags-aac对氨基糖苷类抗 生素类别特异性良好，可用于富集和纯化样品中氨基糖苷类抗生素中的应用。
111.实施例3利用氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱纯化牛奶样品中的氨基 糖苷类抗生素及其检测
112.本实施例通过向牛奶样品中定量加入氨基糖苷类抗生素标准品，然后用 实施例1制备的氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱进行净化，净化后用超高效 液相色谱三重四极串联质谱仪检测，测定回收率。
113.将牛奶样品中氨基糖苷类抗生素提取，具体如下：
114.1、牛奶样品处理
115.1)量取牛奶样品5ml于离心管中加入结合缓冲液(结合缓冲液为含有 10mm的tris hcl，120mm的nacl，5mm的kcl和1mm的mgcl2的水 溶液)定容至50ml，混匀。
116.2)振荡提取10min，8000r/min离心10min。
117.3)取上清液于另一干净离心管中，用1mol/l的naoh溶液调节样品溶 液ph 6.5左右，待净化。
118.4)取上述上清液10ml用于上样净化，检测。
119.2、取出按实施例1方法制备的氨基糖苷类抗生素适配体亲和柱，打开进 样口塞，用5ml结合缓冲液(10mm tris，120mm nacl，5mm kcl和1mmmgcl2，ph 7.5)平衡亲和柱，将
上述上清液10ml加入亲和柱中，进样口与 注射器针筒连接，使液体以1-2滴/秒的流速流出，直至样品全部流出亲和柱。
120.3、用1ml结合缓冲液洗涤亲和柱，向柱中注入2～3ml空气。
121.4、加入用1ml含体积分数为5％甲酸的乙腈-水(40：60，v:v)进行洗 脱，收集洗脱产物，向柱中注入2～3ml空气。
122.5、再次加入1ml甲醇，该洗脱产物不进行收集。
123.6、取上述收集的洗脱产物，于45℃氮吹仪中氮吹干后，1ml 70％乙腈 水溶液溶解并定容，经0.2μm滤膜后装入带有塑料内衬管的进样瓶中，待 uplc-ms/ms检测。
124.7、色谱及质谱条件
125.色谱柱为acquity uplc beh amide柱(2.1
×
100mm，1.7μm)；流动 相为0.2％甲酸5mm乙酸铵(a相)和乙腈(b相)。梯度洗脱程序如下： 0-3min，a相从5％-80％a；3-5.5min，80％a；5.5-6min，80％-5％a；6-7 min，5％a，柱温：40℃；进样量：5μl；流速：0.3ml/min。以三重四极 杆质谱仪作为检测器，检测方式为多反应监测(mrm)，正离子模式。电喷 雾离子源(esi)温度是150℃，毛细管电压为3.5kv，脱溶剂气温度为 500℃，流速为800l/h。4种氨基糖苷类抗生素的保留时间(rt)，定性及 定量离子对(m/z)、锥孔电压(cone)、碰撞能量(ce)等参数见表1。
126.表1 4种化合物的mrm离子对及质谱条件参数
[0127][0128]
注：*为定量离子
[0129]
在牛奶中分别加入不同含量的tob、kana、kanb、ami按照上述方 法进行加标回收检测，结果见表2。
[0130]
表2 4种ags的样品加标回收率结果(n＝6)
[0131][0132]
从表2结果可见，加标牛奶(分别添加相当于100、200、500ng/ml含 量水平的tob、kana、kanb、ami标准工作液)，每个质量浓度水平制 作6组平行样品，按上述所建立的方法进行样品处理与测定，外标法定量， 计算回收率和相对标准偏差。结果表明(表2)，牛奶样品中4种目标待测 物的平均回收率为85.86％～96.69％，rsd小于10％。方法的准确度和精密度 良好，满足牛奶中4种(tob、kana、kanb、ami)ags检测的要求。