沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗前列腺增生药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗前列腺增生药物中的应用。


背景技术：

2.沙棘(hippophae rhamnoides l.)别名醋柳、达布尔、拉巴才尔玛等，是一种雌雄异株的落叶性胡颓子科灌木植物，主要生长于我国的华北、西南、西北等地区，在俄罗斯及印度等国家也均有分布。该植物生态适应性强，具有耐旱、耐盐碱等特点，大面积种植可以作为防风固沙及保持水土的优选物种。由于该植物自然资源丰富，因此其开发利用也备受人们的关注。其中，沙棘果是藏族和蒙古族常用药材，蒙古族《认药白晶鉴》中记述“沙棘膏具有祛肺脓肿、活血、祛巴达干之功效”，藏族医典《晶珠本草》提及到“沙棘果挖除肺病、化血并治培根病”，具有健脾消食、止咳祛痰和活血散瘀的功效。《月王药膳》认为沙棘具有“医治培根、增强体阳、开胃舒胸、饮食爽口、容易消化”等功效，在《四部医典》上载有沙棘在临床上可用于“祛痰止咳、利肺、化湿、壮阴及升阳”等，特别是《本草纲目》认为该植物“实、气味酸、温、无毒、主治久痢不瘥及心腹胀满黄瘦、下寸白虫、单捣为末，酒调服之甚效”。至今为止，沙棘果多用于治疗肺病咳嗽、脘腹胀满、痢疾等疾病，而沙棘叶在藏族药中则多用于治疗诸热、胆热、隐热、火烧伤、瘟病和时疫等。1977年，国家卫生部将沙棘纳入《中国药典》。沙棘因富含营养物质和生物活性成分，又为药食同源植物，因此其果实和种子已在食用、药用等方面被广泛利用。近年来的研究证明，沙棘籽提取油脂后的籽粕蛋白含量丰富，是具有较好的营养价值的优质植物蛋白资源，也沙棘活性物质之一，因此对沙棘籽蛋白及籽粕蛋白来源的生物活性肽的研究和应用开发是十分有必要的。
3.生物活性肽是由天然氨基酸按不同的序列和数量组合而成，而氨基酸序列构成决定其生物活性。目前，生物活性肽的制备方法主要包括生物发酵法、控制酶解法、定向合成法和直接从微生物及动植物中提取、分离纯化等多种方法。合成法包括液相法、天然化学连接法、固相多肽合成法，酶合成法、dna重组技术等。但定向合成法技术尚不成熟，成本较高，实现工业化生产难度较大。发酵法主要是利用乳酸菌、曲霉菌等一些微生物发酵过程中产生的蛋白酶水解蛋白质产生活性肽。控制酶解法制备的生物活性肽不仅安全性高、且酶解过程易于控制、水解条件温和，是生产生物活性肽的常用方法。
4.前列腺增生是一种常见的中老年男性泌尿系统疾病，在传统医学中属于“癃闭”范畴。随着全球人口老龄化，前列腺增生发病率呈逐年上升趋势，严重影响中老年男性的身体健康和生活质量。前列腺增生病因复杂，一般认为与体内雌、雄激素调节失衡相关。雄激素在5α-还原酶的作用下转变为双氢睾酮(dihydrotestosterone,dht)，而dht被证明在前列腺增生中起主要作用。此外，近年来的研究发现氧化应激是参与前列腺增生的发生，是前列腺增生的重要影响因素。因此，通过增加前列腺组织的抗氧化能力及改善组织内的氧化还原状态来抑制前列腺细胞的过度增殖，从而达到治疗前列腺增生的目的。目前临床上除晚期重症患者需要手术治疗外，药物治疗仍是最基本的治疗手段。然而，现有的抗前列腺增生
药物不能满足临床需求，亟需开发新型前列腺增生治疗药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗前列腺增生药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗前列腺增生药物中的应用。
7.沙棘籽粕是沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后的固体物，沙棘籽粕中含有丰富的蛋白质、黄体酮和多种微量元素。研究表明，长期食用沙棘籽粕安全可靠，无蓄积性毒害，亦无致癌或促发肿瘤作用，可促进免疫器官生长发育，提高机体抗病能力，并可治疗犊牛腹泻、卡他性肠炎、肠痉挛、皮疹、风湿病。但目前未见其具有预防和治疗前列腺增生的功效的报道。
8.发明人在研究中意外发现沙棘籽粕蛋白肽可用于减轻、改善前列腺增生及临床继发症状，其具备安全性高、可长期服用，无副作用等特点。因此，沙棘籽粕蛋白肽可用于开发预防和治疗前列腺增生的药物，具有广阔的医用前景和经济价值。
9.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述沙棘籽粕蛋白肽在药物中的质量百分比为0.001～100％。
10.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的使用剂量为50～200mg/kg人体重。
11.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的沙棘籽粕蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
12.(1)配制沙棘籽粕蛋白溶液并加入蛋白酶进行酶解，得蛋白酶解液；
13.(2)将沙棘籽粕蛋白酶解液经超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
14.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述步骤(1)的蛋白酶为胰蛋白酶；所述步骤(2)的超滤的滤膜的分子量为10kda。
15.本技术发明人经大量的实验研究发现，采用胰蛋白酶对沙棘籽粕蛋白进行酶解，最终制备的沙棘籽粕蛋白肽具有改善前列腺增生的作用。
16.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括沙棘籽粕蛋白肽和药学上可接受的辅料。
17.作为本发明药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物的使用剂量为50～200mg/kg人体重。
18.作为本发明药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物为口服给药或注射给药的剂型。
19.本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备抑制5α-还原酶的活性的药物中的应用。
20.本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备提高前列腺组织的抗氧化能力的药物中的应用。
21.5α-还原酶可催化睾酮转变为生理活性更强的二氢睾酮，因此通过抑制5α-还原酶的活性，减少二氢睾酮生成，是治疗雄激素依赖性疾病的有效手段，也是前列腺增生非手术治疗的主要途径。本技术发明人通过大量研究发现，沙棘籽粕蛋白肽能有效抑制5α-还原酶
的活性，可用于预防和治疗前列腺增生药物的制备。
22.本发明的有益效果：本发明提供的沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗前列腺增生药物中的应用，其主要通过抑制5α-还原酶活性及改善机体氧化应激状态来预防和治疗前列腺增生，不仅为制备预防和治疗前列腺增生的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了沙棘籽粕蛋白肽新的药用价值。
具体实施方式
23.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
24.实施例1沙棘籽粕蛋白制备方法
25.本实施例的一种沙棘籽粕蛋白制备方法，包括以下步骤：
26.(1)称取100g脱脂沙棘籽粕粉末，加入9倍重量份的水溶解，调节溶液ph至11，于37℃提取40min，重复提取3次，8000
×
g离心25min，收集上清液；
27.(2)调节步骤(1)的上清液ph为5.0，按照原料重量百分比0.2％的量加入植酸酶，酶解3h，8000
×
g离心并收集沉淀，将沉淀加水复溶,调节ph至7.0后冷冻干燥，得沙棘籽粕蛋白；
28.(3)用步骤(2)的沙棘籽粕蛋白配制溶液，调节溶液ph至11，加入0.2％的胰蛋白酶，于50℃进行酶解，酶解结束后将溶液离心，取上清液，得蛋白酶解液；
29.(4)将步骤(3)的沙棘籽粕蛋白酶解液经分子量为10kda及3kda的聚醚砜超滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
30.实施例2对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白、沙棘籽粕蛋白酶解液和沙棘籽粕蛋白肽的分析鉴定
31.(1)采用凯氏定氮法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白的蛋白质含量进行测定，测定结果如表1所示。
32.(2)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液进行氨基酸含量分析，沙棘蛋白酶解液的氨基酸含量测定结果如表2所示。
33.(3)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液的分子量大小进行测定，测定结果如表3所示。
34.(4)采用hplc/ms/ms方法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白肽的氨基酸序列进行鉴定，结果如表4所示。
35.表1沙棘籽粕蛋白的提取率及蛋白含量
[0036][0037]
表2沙棘籽粕蛋白及蛋白酶解产物中氨基酸含量(g/100g)
[0038][0039][0040]
由表2可知，谷氨酸，精氨酸等为沙棘籽粕蛋白的主要氨基酸，其次为天冬氨酸及亮氨酸，沙棘籽粕提取蛋白的酸性氨基酸含量相对较高，说明沙棘籽粕蛋白在自然条件下呈酸性，与其等电点结果相一致。酶解前和酶解后的氨基酸种类相同，酶解之后的水解氨基酸总量降低，这可能由于酶解过程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。
[0041]
表3沙棘蛋白及酶解液的肽分子量分布
[0042][0043]
由表3可知，本发明中胰蛋白酶酶解沙棘籽粕蛋白的肽分子量分布的结果显示，沙棘籽粕蛋白原料的分子量较大，而经过酶解之后，分子量明显降低。胰蛋白酶酶解之后的肽分子量大多在5kda～10kda之间，且具有较多的大分子量的肽段。
[0044]
表4 hplc-ms/ms分析结果
[0045]
[0046]
[0047][0048]
由表4可知，共52个肽序列，其中二肽有14个(约占26.92％)，三肽有20个(约占38.46％)，四肽有13个(约占25％)，五肽有3个(约占5.76％)，六肽和八肽各有1个，肽中含有精氨酸基团为24个，且90％以上的精氨酸在碳端。
[0049]
实施例3沙棘籽粕蛋白肽对小鼠前列腺增生的抑制效果
[0050]
本实施例对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对小鼠前列腺增生的抑制效果进行测定。
[0051]
(1)实验方法：
[0052]
a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2 ℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)， 自由饮食，适应性饲养一周后进行实验。将实验小鼠随机分组，每组10只其中正常对照组：正常对照组每天皮下注射5mg/kg的橄榄油，每天以生理盐水灌胃，持续28天；模型组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以生理盐水灌胃，持续28天；阳性药组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以1.4mg/kg的非那雄胺灌胃，持续28天；沙棘籽粕蛋白组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃，持续28天；棘籽粕蛋白肽低剂量组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，持续28天；棘籽粕蛋白肽中剂量组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，持续28天；棘籽粕蛋白肽高剂量组：小鼠每天皮下注射5mg/kg的丙酸睾酮溶液，并于30min后以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，持续28天。
[0053]
b.各组小鼠在末次给药后禁食不禁水12小时，各组小鼠称重后颈椎脱臼处死，并分离前列腺组织，剥离干净后立即用电子天平称重，并按以下公式计算前列腺指数：前列腺指数＝前列腺湿重/体重(mg/g)。
[0054]
(2)实验结果如表5所示。
[0055]
表5沙棘籽粕蛋白肽对小鼠前列腺指数的影响
[0056][0057]
与正常对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0058]
实施例4沙棘籽粕蛋白肽对5α-还原酶活性的影响
[0059]
本实施例对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对5α-还原酶活性的影响进行测定。
[0060]
(1)实验方法：
[0061]
a.前列腺组织5α-还原酶的提取：在无菌条件下取出7周龄雄性清洁级sd大鼠的前列腺，剪碎前列腺组织，加入5倍体积的缓冲液进行组织匀浆，期间冰浴保持低温环境，4℃条件下10,000
×
g离心1h，去除离心液上层的白色脂肪后收集上清，即得5α-还原酶提取物，采用bca法测定其蛋白含量，分装后置于-80℃冰箱保存备用。
[0062]
b.睾酮标准曲线的制备：准确称取睾酮标准对照品，用甲醇配制成1mg/ml的标准液，稀释成不同浓度，分别取不同浓度标准溶液进样，重复3次。以峰面积均值与浓度作图，绘制标准曲线，并计算回归方程。hplc色谱条件：流动相甲醇-水(80:20v/v)，流速1.0ml/min，检测波长242nm，柱温32℃，进样量20μl。
[0063]
c.反应体系与活性检测：睾酮(60μm)120μl、5α-还原酶提取物60μl、含实施例1所得的沙棘籽粕蛋白肽60μl的nadph(120μm)120μl，反应体系配制混匀后37℃反应15min。反应完成后，hplc进样20μl，将样品中睾酮峰面积代入标准曲线计算相应浓度。将无nadph的样品睾酮浓度作为反应前底物睾酮浓度，求得反应前后底物睾酮浓度差δct。根据酶活力单位(u/l)定义:单位浓度酶液在37℃，ph＝6.2条件下每分钟催化底物使其减少的量为一个酶活力单位。
[0064]
(2)实验结果如表6所示。
[0065]
表6
[0066][0067]
实施例5沙棘籽粕蛋白肽对前列腺组织抗氧化能力的影响
[0068]
本实施例通过氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,orac)实验对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对前列腺组织抗氧化能力的影响进行测定。
[0069]
(1)实验方法：
[0070]
a.前列腺样品预处理：取实施例4中的小鼠前列腺组织利用3％高氯酸溶液制备2％的前列腺组织匀浆液，4℃条件下以10,000
×
g离心15min，取上清液作为测定orac的样品溶液。
[0071]
b.orac实验过程：在96孔板中加入不同组别小鼠的20μl前列腺组织匀浆液，再加入140μl aaph和20μl磷酸盐缓冲液，最后添加20μl荧光素钠后迅速将96孔板置于设置温度37℃的荧光酶标仪中开始测定。每2min测定一个点，共测定2h。orac值以1μmol/l的trolox在荧光衰减曲线上对应的保护积分面积作为标准对照计算。
[0072]
(2)实验结果如表7所示。
[0073]
表7
[0074][0075]
与正常对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0076]
由表5～7可知，沙棘籽粕蛋白肽对小鼠实验性前列腺增生的改善作用，能够有效降低丙酸睾酮所致前列腺增生小鼠的前列腺湿重和前列腺指数；5α-还原酶活性的结果显示沙棘籽粕蛋白肽对前列腺增生的改善作用可能与抑制5α-还原酶活性相关；此外，沙棘籽粕蛋白肽还能提升前列腺组织的抗氧化能力，进而抑制前列腺细胞的增殖。
[0077]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理
解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。