非洲猪瘟病毒检测用生物材料、试剂盒和非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法

1.本发明属分子检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒检测用生物材料、试剂盒和非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法。


背景技术：

2.非洲猪瘟病毒(asfv,african swine fever virus)是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)下仅有的种，具有传染性和极高的致病性。asfv是所发现的仅有的虫媒dna病毒，主要依靠软体蜱科(argasidae)下钝缘蜱属(ornithodoros)的软壁虱进行传播。非洲猪瘟病毒的检测对于非洲猪瘟疫情控制至关重要。
3.现有技术中，可用于非洲猪瘟病毒检测且不受昂贵仪器限制的常用方法有胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附法(elisa法)。其中，胶体金免疫层析法，操作简单、快速，但该方法的灵敏度较差，还会出现假阴性结果，存在局限性。elisa方法操作简单，灵敏度高，但是特异性有待提高，存在假阳性结果。目前缺少一种灵敏度高且特异性强的非洲猪瘟病毒检测方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供非洲猪瘟病毒检测用生物材料、试剂盒和非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法，本发明的非洲猪瘟病毒检测用生物材料用于非洲猪瘟病毒检测，灵敏度高且特异性强。
5.本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测用生物材料，包括独立包装的第一材料和第二材料；
6.所述第一材料包括非洲猪瘟病毒捕获探针和与所述非洲猪瘟病毒捕获探针化学结合的aunps@znfe2o4@cof材料；所述aunps@znfe2o4@cof材料包括znfe2o4@cof和负载于所述znfe2o4@cof表面的金纳米粒子；
7.所述第二材料包括负载有非洲猪瘟病毒标记探针和辅助探针的cuo2。
8.优选的，所述第一材料的制备方法包括以下步骤：
9.将非洲猪瘟病毒捕获探针与aunps@znfe2o4@cof材料混合，进行化学结合，得到第一材料。
10.优选的，所述第二材料的制备方法包括以下步骤：
11.将非洲猪瘟病毒标记探针、辅助探针和cuo2混合，进行化学结合，得到第二材料。
12.优选的，所述非洲猪瘟病毒捕获探针的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述非洲猪瘟病毒标记探针的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述辅助探针的核苷酸序列如seq id no.3所示。
13.本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒检测用试剂盒，包括上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料和cuo2的显色底物。
14.本发明还提供了一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法，包括以下步骤：
15.1)将上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第一材料和待测样本混合，进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物；
16.2)向所述第一孵育产物中加入上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第二材料，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物；
17.3)向所述第二孵育产物中加入cuo2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在510nm处的吸光值；
18.根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中非洲猪瘟病毒的浓度；所述标准曲线为非洲猪瘟病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
19.优选的，所述步骤1)或步骤2)中，所述去除未结合物的方式包括：
20.对第一孵育或第二孵育后所得孵育液进行磁力吸附分离，得到上清液和下层浊液；
21.对下层浊液进行洗涤。
22.优选的，步骤1)中，所述第一孵育的时间为30～60min。
23.优选的，步骤2)中，所述第二孵育的时间为30～60min。
24.优选的，步骤3)中，所述第三孵育的温度为50～60℃；所述第三孵育的时间为15～30min。
25.本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测用生物材料，包括与非洲猪瘟病毒捕获探针化学结合的aunps@znfe2o4@cof材料以及负载有非洲猪瘟病毒标记探针和辅助探针的cuo2。在本发明中，aunps@znfe2o4@cof为磁性纳米复合材料，具有良好的吸附性，与非洲猪瘟病毒捕获探针通过au-s键化学结合得到cp-aunps@znfe2o4@cof生物材料，结合后的cp-aunps@znfe2o4@cof生物材料能够特异性识别并吸附捕获非洲猪瘟病毒。在本发明中，cuo2具备催化漆酶底物显色的性能，cuo2分别与非洲猪瘟病毒标记探针和辅助探针通过au-s键化学结合得到cuo
2-lp/ap纳米复合材料，结合后的cuo
2-lp/ap纳米复合材料作为信号探针用于显色。本发明的非洲猪瘟病毒检测用生物材料能够特异性结合非洲猪瘟病毒并显色，能够用于检测非洲猪瘟病毒。在本发明中，基于本发明的非洲猪瘟病毒检测用生物材料所构建的非诊断目的非洲猪瘟病毒磁吸附检测方法的检出限(lod)最低可达到10-19.5
mol/l，检出限较低，而且还具有有较好的选择性和抗干扰性，能用于成分复杂的实际样品中非洲猪瘟病毒的检测，此外，该方法无需核酸扩增，检测快速。
附图说明
26.图1为znfe2o4纳米粒子的tem(a)和sem(b)图；
27.图2为znfe2o4@cof的tem(a)和znfe2o4@cof@au的tem(b)图；
28.图3为cuo2的tem图；
29.图4为cuo2的xps图；
30.图5为非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的条件优化结果；
31.图6为非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的线性检测范围；
32.图7表示磁吸附非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的检测原理；
33.图8为本发明实施例的流程图；
34.图9表示实施例8中非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的方法的特异性验证结果。
具体实施方式
35.本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测用生物材料，包括独立包装的第一材料和第二材料；所述第一材料包括非洲猪瘟病毒捕获探针和与所述非洲猪瘟病毒捕获探针化学结合的aunps@znfe2o4@cof材料；所述aunps@znfe2o4@cof材料包括znfe2o4@cof和负载于所述znfe2o4@cof表面的金纳米粒子；所述第二材料包括负载有非洲猪瘟病毒标记探针和辅助探针的cuo2。
36.在本发明中，所述非洲猪瘟病毒捕获探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：5
’‑
tcaaagcaaaggtaatcatcatcgc-3
’‑
(ch2)
6-sh。在本发明中，所述非洲猪瘟病毒标记探针的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：5
’‑
tcgagttacgctaagcactgggttggtattcctcc-3
’‑
(ch2)
6-sh；所述辅助探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为：5
’‑
cttagcgtaactcgaggaggaataccaacccagtg-3’。
37.本发明以b646l基因序列为目标序列，设计了捕获探针(cp)、标记探针(lp)和辅助探针(ap)，目标序列的5’和3’末端分别与cp和lp互补，ap的5’和3’末端具有与lp两个不同区域互补的序列。同时在cp和lp的3’端分别修饰有巯基，以便与aunps@znfe2o4@cof材料和cuo2材料结合形成cp-aunps@znfe2o4@cof复合捕获探针和cuo
2-lp/ap信号探针。p72蛋白是asfv的主要结构蛋白，由b646l基因编码，该基因高度保守，有较强的抗原性，且不同病毒株的氨基酸序列差异不大，相较于asfv的其他结构蛋白有更好的稳定性，是病毒检测中最常用的靶基因。
38.在本发明中，捕获探针cp与标记探针lp对于非洲猪瘟病毒的筛选作用使构建的非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测对非洲猪瘟病毒具有特异性识别的能力，制备得到的非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的线性检测范围是10-19.5
～10-15
mol/l，最低检出限(lod)为10-19.5
mol/l，该lod较低，有望在低病毒浓度(载量)样品检测中应用。
39.在本发明中，所述第一材料的制备方法优选的包括以下步骤：将非洲猪瘟病毒捕获探针与aunps@znfe2o4@cof材料混合，进行化学结合，得到第一材料。
40.在本发明中，所述非洲猪瘟病毒捕获探针与aunps@znfe2o4@cof材料通过au-s键结合；所述金纳米粒子和znfe2o4@cof吸附结合。
41.在本发明中，所述混合优选为将cp水溶液和aunps@znfe2o4@cof材料水溶液混合；所述cp水溶液中cp的摩尔质量浓度优选为8～10μmol/l；所述aunps@znfe2o4@cof材料水溶液中aunps@znfe2o4@cof的质量浓度优选为0.1～5mg/ml；所述cp水溶液和aunps@znfe2o4@cof材料水溶液的体积比为(5～30)：500。在所述进行化学结合后，优选的还包括在所述化学结合的产物中加入1-己硫醇(ht)水溶液，进行孵育；所述1-己硫醇(ht)水溶液中ht的摩尔浓度优选为1mm；所述ht的作用是消除非特异封闭位点；所述孵育的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述孵育的时间优选为15～30min。
42.在本发明中，所述aunps@znfe2o4@cof材料的制备方法优选的包括以下步骤：将znfe2o4@cof和金纳米粒子混合，得到aunps@znfe2o4@cof。在本发明中，所述混合优选为将znfe2o4@cof水悬浮液滴加到金纳米粒子水溶液中；所述将znfe2o4@cof水悬浮液中将znfe2o4@cof的质量浓度优选为0.1～5mg/ml；所述金纳米粒子水溶液中金纳米粒子的摩尔
浓度优选为0.2～1.0mmol/l；所述znfe2o4@cof水悬浮液和纳米粒子水溶液的体积比优选为1：(5～10)。在本发明中，所述混合的过程中进行搅拌；所述混合的时间优选为10～12h；所述混合的温度优选为4℃。
43.在本发明中，所述znfe2o4@cof的粒径优选为200～350nm，更优选为250～300nm。
44.本发明对所述金纳米粒子和znfe2o4@cof的来源没有特殊限制，采用本领域常规方法制备得到即可。在本发明具体实施过程中，所述znfe2o4@cof的制备方法参照li y,et al.acs appl mater interfaces.2019.10.1021/acsami.9b06953；所述金纳米粒子采用柠檬酸钠还原法制备得到。
45.本发明利用aunps@znfe2o4@cof材料的磁吸附性能构建非洲猪瘟病毒检测用生物材料。aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料可以通过cp的连接作用特异性识别非洲猪瘟病毒，并且其具备的磁吸附性能使aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料可以作为优良的探针对非洲猪瘟病毒进行检测。
46.在本发明中，所述第二材料的制备方法优选的包括以下步骤：将非洲猪瘟病毒标记探针、辅助探针和cuo2混合，进行化学结合，得到第二材料。在本发明中，cuo2分别和ap和lp通过au-s键结合。在本发明中，所述混合优选的包括：将cuo2水溶液和lp水溶液第一混合后，再与ap水溶液第二混合；所述cuo2水溶液、lp水溶液和ap水溶液的体积比为500：(5～30)：(5～30)；所述cuo2水溶液中cuo2的质量浓度优选为0.5～5mg/ml；所述lp水溶液中lp的摩尔质量浓度优选为10μmol/l；所述ap水溶液中ap的摩尔质量浓度优选为10μmol/l。在本发明中，所述第一混合的方式优选为搅拌混合；所述第一混合的温度优选为4℃；所述第一混合的时间优选为10～12h。在本发明中，所述第二混合的方式优选为搅拌混合；所述第二混合的温度优选为4℃；所述第二混合的时间优选为1～2h。本发明在所述第一混合或第二混合后，优选的还包括洗去未负载的非洲猪瘟病毒标记探针或辅助探针；在本发明中，所述洗去未负载的非洲猪瘟病毒标记探针或辅助探针的洗涤剂优选为pbst缓冲液，洗涤的次数优选为5次。
47.本发明对所述cuo2的来源没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。在本发明具体实施过程中，所述cuo2的制备方法参考lin et al.,2019.j am chem soc.141,25.doi:10.1021/jacs.9b03457。
48.在本发明中，cuo2纳米材料，该材料具有漆酶活性，可代替天然漆酶催化漆酶底物显色，增加灵敏度，降低成本。
49.本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒检测用试剂盒，包括上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料和cuo2的显色底物。
50.在本发明中，所述cuo2的显色底物为2,4-二氯苯酚(2,4-dp)和4-氨基安替比林(4-ap)。在本发明中，所述2,4-dp和4-ap的质量比优选为1:1。
51.本发明还提供了一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法，包括以下步骤：
52.1)将上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第一材料和待测样本混合，进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物；
53.2)向所述第一孵育产物中加入上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第二材料，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物；
54.3)向所述第二孵育产物中加入cuo2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵
育液在510nm处的吸光值；
55.根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中非洲猪瘟病毒的浓度；所述标准曲线为非洲猪瘟病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
56.本发明首先将上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第一材料和待测样本混合，进行第一孵育，去除未结合物，得到第一孵育产物。在本发明中，所述混合优选的包括将第一材料水溶液和待测样本溶液混合；所述第一材料水溶液中第一材料的质量浓度优选为0.5～5mg/ml；所述第一材料水溶液和待测样本溶液的质量比优选为(50～100)：(35～50)。在本发明中，所述第一孵育的温度优选为25～37℃；所述第一孵育的时间优选为30～60min，更优选为40～50min。
57.得到第一孵育产物后，本发明向所述第一孵育产物中加入上述方案所述的非洲猪瘟病毒检测用生物材料中的第二材料，进行第二孵育，去除未结合物，得到第二孵育产物。在本发明中，所述第二材料以第二材料水溶液的形式加入；所述第二材料水溶液中第二材料的质量浓度优选为0.5～5mg/ml；所述第一材料水溶液的体积和所述第二材料水溶液的体积比优选为1：1。在本发明中，所述第二孵育的温度优选为25～37℃；所述第二孵育的时间优选为30～60min，更优选为40～50min。
58.在本发明中，所述去除未结合物的方式优选的包括：对第一孵育或第二孵育后所得孵育液进行磁力吸附分离，得到上清液和下层浊液；得到下层浊液后优选的还包括采用pbst对下层浊液进行清洗；所述清洗的次数优选为3次。
59.得到第二孵育产物后，本发明向所述第二孵育产物中加入cuo2的显色底物，进行第三孵育，测试所得第三孵育液在510nm处的吸光值；根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中非洲猪瘟病毒的浓度；所述标准曲线为非洲猪瘟病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
60.在本发明中，所述第三孵育的温度优选为50～60℃；所述第三孵育的时间优选为15～30min，更优选为20～25min。
61.英文缩略语和关键术语定义
[0062][0063][0064]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0065]
实施例中所使用的化学试剂，溶剂均为分析纯；所使用的多肽，适配体均为商业化方法获得；电化学检测所使用的仪器为电化学工作站chi 660d；所使用的病毒核酸由云南
农业大学动物疫病疾控中心提供。
[0066]
本发明实施例的流程图参见图8。
[0067]
实施例1：制备和表征znfe2o4@cof的如下：
[0068]
1)znfe2o4纳米粒的制备：称取六水合氯化铁(3.0g)和无水氯化锌(1.0g)，溶解于乙二醇(80ml)中形成透明溶液，随后加入醋酸钠(2.0g)和聚乙二醇20000(0.1g)。混合液剧烈搅拌0.5h后，转移到不锈钢高压釜(容量100ml)中，在200℃条件下反应24h，反应终止后自然冷却至室温得到含有黑色沉淀的悬浊液。将沉淀用乙醇和水清洗数次，黑色产物在60℃真空环境下干燥6h。获得粉末状znfe2o4纳米粒。znfe2o4纳米粒的tem(a)和sem(b)图示(图1)。
[0069]
2)进一步合成znfe2o4@cof：取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(tapb,0.3g)，对苯二甲醛(tpa,0.03g)和znfe2o4(1.0g)，用50ml二甲基亚砜溶解。超声分散30min，超声下加入1.5ml无水乙酸，室温反应15min。磁铁收集znfe2o4@cof，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，得到棕色固体，60℃真空干燥得到znfe2o4@cof棕色粉末。znfe2o4@cof的tem图示(图2中的(a))。
[0070]
实施例2：aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料的制备和表征：
[0071]
1)aunps的制备：在搅拌条件下，将20ml浓度为20mmol/l的haucl4溶液加入150ml沸腾的去离子水中，在110℃下加热搅拌60min，缓慢滴加30ml浓度为50mmol/l的柠檬酸钠溶液，冷凝回流60min，直至溶液变为酒红色，溶液在室温条件下搅拌60min，于4℃下储存。
[0072]
2)将上一步得到znfe2o4@cof的加水配制成浓度为2mg/ml的znfe2o4@cof溶液，取5ml znfe2o4@cof溶液滴加在浓度为0.1mmol/l10ml金纳米粒子溶液中，4℃搅拌8h，磁铁收集，弃上清液，继续用去离子水离心洗涤3次，得到aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料。
[0073]
3)采用透射电镜图像，对aunps@fe3o4@cof纳米复合材料进行了表征：从透射电镜图2中的(a)中可以看出，znfe2o4纳米颗粒外包裹着一层絮状的cof结构，小颗粒状aunps均匀的分布在cof结构中，(图2中的(b))。可以看出，aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料成功制备，并通过扫描电镜图像和透射电镜图像证明。
[0074]
实施例3：在aunps@znfe2o4@cof上修饰捕获探针(cp)：
[0075]
将公司合成的cp按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为10μmol/l，然后将30μl 10μmol/l的非洲猪瘟病毒捕获探针(cp)加入到500μl 1mg/ml的aunps@znfe2o4@cof纳米复合材料溶液中，室温震荡12h，磁铁富集后去除上清液用去离子水洗涤备用。
[0076]
实施例4：cuo2的制备和表征
[0077]
将0.5g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶解在5ml 0.01m cucl2.2h2o的水溶液中。然后，将5ml 0.02mnaoh和100μl h2o2依次加入上述溶液中，搅拌30min后，通过超滤收集pvp包覆的cuo2纳米片并用水洗涤。cuo2纳米粒的tem图示(图3)和xps图示(图4)。可以看出，cuo2纳米材料成功制备，并通过透射电镜图像和xps光电子能谱证明。
[0078]
实施例5：在cuo2上修饰标记探针(lp)和辅助探针(ap)：
[0079]
将合成的lp和ap按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为10μmol/l，将得到的cuo2加水配制成浓度为0.5～5mg/ml的cuo2溶液，然后取500μl cuo2溶液与5～30μl 10μmol/l的非洲猪瘟病毒标记探针(lp)混合，4℃搅拌10～12h，离心洗涤后重悬，再与5～30μl 10μmol/l的辅助探针(ap)4℃共孵育1～2h，离心洗涤备用。
[0080]
实施例6：反应条件优化。
[0081]
(1)设置30℃，40℃，50℃，60℃和70℃五个温度梯度来评估温度对漆酶底物催化的影响，结果表明60℃为最佳反应温度(图5中的a)。
[0082]
(2)缓冲液的ph也对反应体系的成功构建有着较大的影响。分别选择了3.0，4.0，5.0，6.0，6.8，8.0和9.0共7个ph梯度来进行筛选。结果表明反应的最佳ph为6.8(图5中的b)。
[0083]
(3)对cp-aunps@znfe2o4@cof与目标序列的孵育时间进行了优化，设置了15min，30min，45min，60min和90min共5个时间梯度，实验结果表明cp-aunps@znfe2o4@cof与目标序列的最佳孵育时间为30min(图5中的c)。
[0084]
(4)对cuo
2-lp/ap信号探针与目标序列的孵育时间进行了优化，设置了15min，30min，45min，60min和90min共5个时间梯度，实验结果表明cuo
2-lp/ap信号探针与目标序列的最适孵育时间为30min(图5中的d)。
[0085]
实施例7：非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测的方法，具体步骤如下：
[0086]
(1)取100μl 0.5-5mg/ml的cp-aunps@znfe2o4@cof溶液和35-50μl的不同浓度的asfv目标序列溶液置于离心管内，混匀，共孵育30-60min；
[0087]
(2)外加磁铁吸附，弃上清，pbst清洗三次；
[0088]
(3)向上述离心管内加入100μl 0.5～5mg/ml cuo
2-lp/ap溶液，混匀，共孵育30～60min；
[0089]
(4)外加磁铁吸附，弃上清，pbst清洗三次；
[0090]
(5)向离心管内加入适量2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液，2,4-dp，4-ap，总体积300μl，60℃孵育15～30min，观察颜色变化，并使用紫外分光光度计检测510nm处的吸光值，绘制标准曲线，y＝2.1519 0.0879*log
casfv
，(r2＝0.9859)(图6)。非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测检测原理见(图7)。随着病毒浓度增加，紫外分光光度计检测到的吸光度增加，且在10-19.5
～10-15
mol/l的非洲猪瘟病毒浓度范围内具有良好的线性关系。
[0091]
实施例8
[0092]
(1)分别取100μl 0.5～5mg/ml的cp-aunps@znfe2o4@cof溶液和35～50μl的盐溶液(na

、k

)，牛血清蛋白，bsa，谷氨酸(glu)，抗坏血酸(aa)以及同样可以引发猪疾病的病毒(伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒ⅱ型和ⅲ型(pcv2和pcv3)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv))等溶液置于离心管内，混匀，共孵育30～60min；
[0093]
(2)外加磁铁吸附，弃上清，pbst清洗三次；
[0094]
(3)向上述离心管内加入100μl 0.5～5mg/ml cuo
2-lp/ap溶液，混匀，共孵育30～60min；
[0095]
(4)外加磁铁吸附，弃上清，pbst清洗三次；
[0096]
(5)向离心管内加入适量2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液，2,4-dp，4-ap，总体积300μl，60℃孵育15～30min，观察颜色变化，并使用紫外分光光度计检测510nm处的吸光值。均不能检测到相应的吸光值。证明用上述方法构建的磁吸附非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测具有较高的特异性(图9)。
[0097]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。