一种益生元和益生菌的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于食品营养学技术领域，具体涉及一种益生元和益生菌的组合物及其应用。


背景技术：

2.目前，在实际生产组合物过程中，只加入益生菌菌粉，会导致菌粉粘附在条包壁上无法倒出而产生较大的益生菌损耗。鼠李糖乳杆菌mp108是中国卫健委批准的第一株中国自主知识产权的婴幼儿可食用菌株。目前，并没有以鼠李糖乳杆菌mp108和益生元作为组合物进行专利申请，或将此组合物应用到样品产品中的案例。
3.现有益生菌产品的功效都是直接使用原辅料本身高含量时所具有的功能，而并没有针对所生产的产品进行功能验证。在产品生产工程中，不同的原辅料组成后，不能保证产品的功效。目前益生菌产品所具有的功效通常为1～2个，常见的为提高免疫力和缓解便秘，而本专利所构建的配方具有抑菌、缓解特应性皮炎、缓解过敏性哮喘、缓解细菌性腹泻、缓解食物过敏、促进消化以及缓解便秘的七大功效。


技术实现要素：

4.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种益生元和益生菌的组合物及其应用。
5.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
6.所述益生元和益生菌的组合物，所述组合物中所述的益生元为低聚果糖fos、低聚半乳糖gos和抗性糊精；所述益生菌为鼠李糖乳杆菌mp108；所述鼠李糖乳杆菌mp108、低聚果糖fos、低聚半乳糖gos和抗性糊精的重量比为(0.2～3):(5～8):(5～80):(1～30)。
7.优选地，所述益生元中低聚半乳糖gos、低聚果糖fos、抗性糊精的重量比为3:1:2.7；所述的鼠李糖乳杆菌mp108活菌数均为1*10
9-10
12
cfu/g。
8.本发明以balb/c小鼠为研究对象，实验结果表明：本发明所述的益生元和益生菌的组合物具有缓解细菌性腹泻的作用，具有缓解便秘的作用，具有促进消化的作用，具有缓解食物过敏功效的作用，具有缓解过敏性哮喘的作用，具有缓解特定性皮炎的作用，能够抑制其他细菌生长，同时还能耐酸耐胆碱。
9.本发明所述益生元和益生菌的组合物可以用于制备细菌性腹泻缓解剂、便秘缓解剂、消化促进制剂、食物过敏功效评价制剂中的应用、过敏性哮喘缓解剂、皮炎缓解剂中的应用、细菌抑制剂、耐酸耐胆碱制剂。所述益生元和益生菌的组合物每天的食用量为1.5—7.5g/人。
附图说明
10.图1：各组小鼠空肠病理切片(100x)；
11.图2：各组小鼠空肠病理切片(x200)；
12.图3：各组小鼠肺部病理切片；
13.图4：小鼠背部皮损he染色病理切片(100x)；
14.图5：耐酸耐胆盐能力测试；
15.图6：单菌mp108益生元种类的确定第一次试验结果图；
16.图7：单菌mp108益生元种类的确定第二次试验结果图；
17.图8：单菌mp108益生元种类的确定第三次试验结果图。
具体实施方式
18.实施例1益生元和益生菌组合物在缓解细菌性腹泻中的应用
19.1.检测内容
20.以balb/c小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃不同的样品溶液，检测这些样品对腹泻小鼠的粪便含水量、血清免疫炎症因子、空肠组织病理的影响，确定这些样品在缓解细菌性腹泻方面的功效及差异性。
21.2.动物实验方案
22.雄性spf级balb/c小鼠(6周龄，体重18-20g)适应性喂养一周后，小鼠随机分成包括空白对照组、模型组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)，组合物高剂量组(184.5mg/只/d)，组合物样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中，按照表1的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：fos：gos：抗性糊精＝1:4:10:11)。
23.表1
[0024][0025]
第三周开始，在饮用水中加入链霉素(5g/升)处理3天，将小鼠肠道菌群变的紊乱。然后用无菌水代替含有链霉素的水，同时造模前18小时前停止进食。
[0026]
从第三周第4天开始，空白对照组每天灌胃3次生理盐水，模型组先灌胃1次生理盐水，然后每天灌胃2次1.2
×
10
11
cfu/ml的etec o78：k80悬液，每只小鼠每次灌胃0.2ml，连续灌胃四天，每次间隔2小时，灌胃etec后更换鼠笼，不添加垫料，在鼠笼中铺滤纸，每隔2h观察小鼠的腹泻情况和死亡率，持续四天；组合物各剂量组分别先灌胃1次相应样品溶液，然后每天灌胃2次1.2
×
10
11
cfu/ml的etec o78：k80悬液，每只小鼠每次灌胃0.2ml，其余处理同模型组小鼠。
[0027]
实验期间，小鼠自由进食进水，各组小鼠均饲喂标准饲料，饲养屏障内为恒温恒湿环境，温度为25
±
2℃，湿度为50％
±
5％，光照条件为12小时光照，12小时黑夜。
[0028]
3.具体指标：
[0029]
①
粪便含水量：小鼠处死前一天，尽可能多的收集小鼠粪便，冻干之后测量前后的含水量，粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
×
100％；
[0030]
②
血清中炎症因子tnf-α、il-6和il-10的测定：在最后一次灌胃的24h后，从眶静脉丛血样采集，血液静置，4000g离心，10min，离心取血清，置于-80℃冰箱保存，酶联免疫吸附方法测定血清中炎症因子的表达水平
[0031]
③
腹泻相关蛋白的测定：采用酶联免疫吸附测定方法检测小鼠血清中aqp3、st、tlr4和iga的水平
[0032]
④
空肠病理观察
[0033]
4.实验结果
[0034]
4.1粪便含水量
[0035]
长时间的腹泻会导致小鼠体重下降，粪便不成形。因此通过记录小鼠的粪便含水量能够知晓腹泻症状变化，结果见表2。
[0036]
表2各组小鼠的粪便含水量
[0037][0038][0039]
注:*表示与模型组差异显著性(p《0.05)，下同。
[0040]
从表2可知，与空白组相比较，模型组因为腹泻造成粪便不成型，含水量过多成稀状，体重下降严重，说明腹泻模型造模成功。
[0041]
与模型组相比较，a组和a-5组的含水量较模型组有所降低，其中a-5组显著性降低(p《0.05)。
[0042]
说明该组合物有缓解降低粪便含水量的作用，有助于粪便成型。
[0043]
4.2对血清炎症因子的影响(表3)
[0044]
表3各组小鼠血清中炎症因子水平
[0045][0046]
从表3可知，在促炎因子il-6和tnf-α方面，组合物各剂量组与模型组相比较有显著性降低(p《0.05)。细菌性腹泻造成小鼠体内il-6和tnf-α在血清含量的增高，因此可以说明，组合物各剂量组中该炎症因子的含量下降，能缓解腹泻症状。
[0047]
在抗炎因子il-10和tnf-γ水平上，组合物各剂量组与模型组相比较有显著性增高(p《0.05)。说明组合物可提升抗炎因子。
[0048]
4.3对腹泻相关蛋白的影响(表4)
[0049]
表4各组小鼠与腹泻相关蛋白水平
[0050][0051]
在aqp3和iga水平上，各样品组与模型组相比较含量有显著性上升,(p《0.05)。通过aqp3的上调，控制肠道内水分子的吸收，降低粪便含水量。iga增加能增强机体的免疫能力。说明组合物各剂量组有缓解细菌性腹泻的作用，使小鼠在aqp3和iga水平上表达恢复。
[0052]
在st和tlr4水平上，组合物各剂量组与模型组相比较有显著性下降(p《0.05)。st是大肠杆菌肠毒素，tlr4的增加会促进各种炎性细胞的表达，组合物各剂量组有缓解细菌性腹泻的作用，使小鼠在st和tlr4水平上表达恢复。
[0053]
4.4各组空肠的病理分析
[0054]
从图1可知，模型组空肠肠壁变薄，肠壁有空隙，肠绒毛变短，肠通道变宽，形态不完整，有少许炎症细胞。其他各样品组相较与模型组，有一定的恢复作用，肠绒毛长度正常，肠壁空隙恢复，细胞浸润不明显。
[0055]
实施例2益生元和益生菌组合物在缓解便秘方面的应用
[0056]
1.内容
[0057]
以balb/c小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃益生菌，检测这些样品对便秘小鼠的粪便含水量、小肠推进率、首粒排黑便时间的影响，确定样品在缓解便秘方面的功效及差异性。
[0058]
2.方案
[0059]
6周龄spf级balb/c雄性小鼠经过一周的适应期后，按照每组6只小鼠随机分组，包括空白对照组、模型组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)，组合物高剂量组(184.5mg/只/d)，组合物样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中，按照表5的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：fos：gos：抗性糊精＝3:8:5:30)。
[0060]
表5
[0061][0062]
第三周开始，空白对照组每天灌胃无菌生理盐水两次，共灌胃8天；模型组、样品组
每天均先灌胃盐酸洛哌丁胺，1h后样品组灌胃相对应的样品溶液0.2ml，对照组和模型组等量灌胃无菌生理盐水，连续灌胃8天。
[0063]
实验期间，小鼠自由进食进水，各组小鼠均饲喂标准饲料，饲养屏障内为恒温恒湿环境，温度为25
±
2℃，湿度为50％
±
5％，光照条件为12小时光照，12小时黑夜。
[0064]
3.具体指标：
[0065]
①
粪便湿重、粪便颗粒数、粪便含水量的测定；
[0066]
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
×
100％
[0067]
②
首粒排黑便时间的测定；
[0068]
在小鼠灌胃的最后一天(第8天)进行小鼠首粒排黑便时间的检测，检测方法如下：除空白对照组之外，所有组小鼠先灌胃盐酸洛哌丁胺，1h之后，空白对照组和模型对照组用墨汁灌胃，其余组灌胃含有样品的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间，以模型组最后一只小鼠的首粒黑便时间为终止时间，超过模型组首粒黑便时间的处理组则说明无效，比较各个处理组与模型组之间的差异，用于说明各组在缓解便秘方面的差异。
[0069]
③
小肠推进率的测定；
[0070]
小鼠经8天灌胃后，于第8天晚上禁食过夜，第9天给除了空白对照组之外的所有组小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺，30min后，空白对照组和模型对照组用墨汁灌胃，其余组灌胃含有样品的墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，分离肠系膜，剪取上端自幽门，下端至回盲肠的肠管，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照下式计算小肠推进率。
[0071]
小肠推进率(％)＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)
×
100％
[0072]
④
血清ifn-α、tgf-β1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10、il-17a水平；
[0073]
⑤
胃泌素等信号分子检测
[0074]
4.实验结果
[0075]
4.1对墨汁推进率、首粒黑便时间和粪便含水量的影响(表6)
[0076]
表6各组小鼠墨汁推进率、首粒黑便时间和粪便含水量
[0077][0078]
注:*表示与模型组差异显著性(p《0.05)，下同。
[0079]
如表6所示，小肠的墨汁推进率方面，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0080]
在首粒黑便的排便时间方面，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0081]
在粪便含水量方面，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0082]
综上所述，该组合物具有提高小肠蠕动的能力。
[0083]
4.2对血清中信号分子的影响(表7)
[0084]
表7血清中信号分子水平的影响
[0085][0086]
如表7所示，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)小鼠血清中胃动素(mtl)、胃泌素(gas)的含量，降低血管活性肠肽(vip)、生长抑素(ss)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0087]
综上所述，该组合物能通过对mtl、gas的分泌的促进作用，同时对vip，ss的分泌有抑制作用，改善小鼠的便秘症状。
[0088]
实施例3益生元和益生菌组合物在助消化中的应用
[0089]
1.内容
[0090]
以balb/c雄性小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃不同的样品，检测这些样品对小鼠体重增长率、食物利用率、胃蛋白酶活性的影响，确定这些样品在助消化方面的功效及差异性。
[0091]
2.方案
[0092]
选取6-8周龄，18-22g的spf级balb/c雄性小鼠，包括空白对照组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)、组合物高剂量组(184.5mg/只/d)，每组6只小鼠，组合物样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中,按照表8的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：fos：gos：抗性糊精＝3:8:5:30)。
[0093]
表8
[0094][0095]
适应期为1周，饲料原料用锤片式粉碎机粉碎,过80目筛,均匀混合,然后按逐级放大的原则加入0.01％的y2o3指示剂，充分混合均匀后用制粒机制成颗粒饲料，室温风干至恒重，实验期间各组小鼠自由饮水与摄食。空白对照组灌胃生理盐水，其余各组小鼠分别灌胃相应的样品溶液(0.2ml)，实验期间每周利用代谢笼系统测定2次体重和食物摄入量。实验结束时计算体重，体重增重，摄食量，食物利用率，总耗氧量，表观消化率。
[0096]
实验结束前16h禁食不禁水，利用胃瘘法制备小胃提取小鼠的胃液，用于测定胃蛋白酶的活性。
[0097]
3.具体指标
[0098]
①
体重增长率；
②
食物利用率；
③
酶活性
[0099]
4.实验结果(表9)
[0100]
4.1小鼠体重增长率和食物利用率
[0101][0102][0103]
表9各组小鼠体重增长率和食物利用率
[0104][0105]
注:*表示与模型组差异显著性(p《0.05)，下同。
[0106]
由表9可知，组合物各剂量组与空白组相比较小鼠的食物利用率和体重增长率有显著性提高(p《0.05)，说明组合物各剂量组能够提升小鼠的食物利用率，增加小鼠的体重。
[0107]
4.2对小鼠胃蛋白酶活力的影响(表10)
[0108]
表10各组小鼠胃蛋白酶酶活力
[0109][0110][0111]
由表10可知，与空白组相比较，组合物各剂量组的胃蛋白酶酶活力有显著性提高(p《0.05)，可以提升小鼠的消化能力。
[0112]
实施例4益生元和益生菌组合物在缓解食物过敏中的应用
[0113]
1内容
[0114]
以balb/c雌性小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃不同的样品，检测这些样品对小鼠体重变化，腹泻及其他过敏症状评分，肠组织组织病理学观察，肥大细胞及嗜酸性粒细胞计数，血清ova特异性免疫球蛋白水平，th2炎症因子水平的影响，确定这些样品在缓解食物过敏方面的功效及差异性。
[0115]
2方案
[0116]
选取5周龄，体重13～16g的spf级balb/c雌鼠，将小鼠随机分为空白对照组、模型组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)，组合物高剂量组(184.5mg/只/d)，每组8只，组合物样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中,按照下表的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：gos：fos：抗性糊精＝2:80:4:20)。
[0117]
表11
[0118][0119]
致敏液：取3mg ova溶解于6ml生理盐水中，再加入6ml氢氧化铝佐剂，混合均匀。
[0120]
激发液：取2.8g ova溶解于11.2ml生理盐水中，混合均匀。
[0121]
给药方式：致敏阶段为腹腔注射，激发阶段为灌胃。
[0122]
致敏阶段：第3天和第17天使用0.1ml含50μg ova的生理盐水 0.1ml氢氧化铝佐剂腹腔注射致敏。空白组使用等量的生理盐水代替。
[0123]
激发阶段：第31～43天每隔一天使用0.2ml的含50mg ova生理盐水进行灌胃激发过敏，共激发7次。空白组使用等量的生理盐水代替。
[0124]
小鼠在灌胃样品溶液前3h禁食，灌胃1h后进行ova的致敏或激发。
[0125]
实验期间每天观察小鼠的腹泻、过敏症状并进行评分，每周进行称重。最后一天灌胃之后，禁食12h后对其进行麻醉处理，采用1％戊巴比妥钠按照0.5ml/10g体重腹腔注射。麻醉后进行眼眶取血，取血后颈椎脱臼法处死，解剖，取空肠组织进行组织病理分析，取材后迅速将其置于甲醛固定液中固定12h，取出后用pbs冲洗，然后进行脱水、包埋、切片。同时检测小鼠血清ova特异性ige及肠组织炎症因子(il-4、ifn-γ、il-17、tgf-β等)水平。将取血后的血样4℃下静置2h后，3000
×
g离心15min，分离血清于无酶管中，置于-80℃冰箱保存备用。
[0126]
3具体指标(表12)
[0127]
①
小鼠体重变化
[0128]
②
腹泻及其他过敏症状评分
[0129]
表12
[0130][0131][0132]
③
肠组织组织病理学观察
[0133]
④
血清ova特异性免疫球蛋白水平
[0134]
⑤
肠组织炎症因子(il-4、il-5、il-13、ifn-γ、il-17、tgf-β、il-10)水平
[0135]
4实验结果(表13)
[0136]
a)小鼠体重变化
[0137]
表13各组小鼠体重变化率和血清ova-ige水平
[0138][0139]
注:*表示与模型组差异显著性(p《0.05)，下同。
[0140]
如表13所示，体重变化率方面，与模型组相比，组合物组均有所提高。
[0141]
在血清ova-ige水平方面，与模型组相比，组合物组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0142]
b)腹泻及其他过敏症状评分(表14)
[0143]
表14各组小鼠腹泻及其他过敏症状评分
[0144][0145]
如表14所示，在腹泻评分上，与模型组相比较，各组腹泻评分都有显著性降低(p《0.05)。
[0146]
在过敏评分上，与模型组相比较，组合物组的评分显著性降低。
[0147]
c)肠组织中细胞因子水平的影响(表15、16)
[0148]
表15各组小鼠肠组织中il-17、tgf-β1和ifn-γ水平的影响
[0149][0150]
如表15所示，在inf-γ水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0151]
在il-17水平，与模型组相比，组合物各剂量组有所降低。
[0152]
在ifn-γ水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0153]
表16各组小鼠肠组织中il-4、il-5、il-10和il-13水平的影响
[0154]
[0155]
如表16所示，在il-4水平，与模型组相比组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0156]
在il-5水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0157]
在il-10水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0158]
在il-13水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0159]
d)各组空肠的病理分析
[0160]
从图2可知，模型组空肠肠壁变薄，形态不完整，质壁有大量炎症细胞，肠绒毛变短。样品组相较与模型组，有一定的恢复作用，肠绒毛长度正常，肠壁形态恢复正常，细胞浸润不明显。
[0161]
实施例5益生元和益生菌组合物在缓解过敏性哮喘中的应用
[0162]
1.内容
[0163]
以balb/c雌性小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃不同的样品，检测这些样品对小鼠血清特异性igg1水平，肺泡灌洗液中il-5，il-13和il-17a的含量，肺部病理，粪便短链脂肪酸含量的影响，确定这些样品在缓解过敏性哮喘(鼻炎)方面的功效及差异性。
[0164]
2.方案
[0165]
将spf级balb/c雌性小鼠(6周龄)分组，经过一周的适应期后，按照每组6只小鼠随机分组，共分成4组，包括空白对照组、模型组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)，组合物高剂量组(184.5mg/只/d)。各样品组样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中，按照表17的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：fos：gos：抗性糊精＝1.5:6:40:27)。
[0166]
表17
[0167][0168]
实验期间，小鼠自由进食进水，各组小鼠均饲喂标准饲料，饲养屏障内为恒温恒湿环境，温度为25
±
2℃，湿度为50％
±
5％，光照条件为12小时光照，12小时黑夜。
[0169]
实验结束后，麻醉小鼠，眼球采血，静止2h后，于离心机3000rpm离心10分钟，收集血清于干净的离心管中，通过hdm特异性igg1 elisa试剂盒检测血清中hdm特异性igg1的含量；解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1ml注射器吸取0.3ml预冷的pbs，灌洗小鼠左肺，进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的
eppendorf管中。于离心机上，4℃，1000rpm，5min，收集上清液，分装于eppendorf管中，冻存-20℃，通过elisa试剂盒检测肺泡灌洗液中的il-5，il-13和il-17a的含量；然后将琼脂糖溶液注入小鼠左肺后，取下左肺置于4％的多聚甲醛溶液中固定，进行石蜡包埋，he染色，送病理科进行肺部炎症程度评估；通过小鼠血清特异性igg1，肺泡灌洗液中il-5、il-13和il-17a，以及肺部病理炎症程度的变化，全面地评价益生菌对小鼠哮喘症状的影响。
[0170]
3.具体指标
[0171]
①
血清特异性igg1水平；
[0172]
②
肺泡灌洗液中il-4、il-5、il-13、il-17a、ifn-γ、il-10的含量；
[0173]
③
肺部病理
[0174]
4.实验结果
[0175]
4.1对血清特异性igg1水平的影响(18)
[0176]
表18各组小鼠血清中特异性igg1水平
[0177][0178]
注：含*表示与模型组于显著性差异(p《0.05)，下同。
[0179]
由表18可知，在igg1水平上，与模型组相比，组合物各剂量组有都显著性下降(p《0.05)。说明该组合物能通过降低igg1水平，缓解小鼠过敏性哮喘的症状。
[0180]
4.2对肺泡灌洗液中细胞因子水平的影响(表18)
[0181]
表18各组肺泡灌洗液中细胞因子水平
[0182][0183]
由表18可知，在il-4、il-5、il-13、il-17a水平上，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性下降(p《0.05)。
[0184]
在il-10和ifn-γ水平上，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)。
[0185]
本专利组合物可使哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞渗出减少，il-4、il-5、il-13和il-17a的分泌减少，还可以通过分泌免疫负调因子il-10和ifn-γ抑制炎症反应，从而发挥缓解哮喘的作用。
[0186]
4.3肺部病理切片
[0187]
如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠的气管、支气管、肺泡及血管周围可见大量的嗜酸性细胞和淋巴细胞等浸润、黏膜上皮增生明显、气道上皮损伤严重及肺泡间隔增厚等病理表现。
[0188]
组合物各剂量组的病理损伤程度较过敏性哮喘模型组明显减轻，肺组织及周围的炎症细胞浸润明显减少、黏膜上皮轻度增生、气道上皮损伤减轻及肺泡间隔增厚程度减轻，各对应的高剂量组在病理损伤相对低剂量组无明显的差异。
[0189]
实施例6益生元和益生菌组合物在缓解特应性皮炎的应用
[0190]
1、内容
[0191]
以c57bl/6雌性小鼠为研究对象，通过对小鼠灌胃不同的样品，检测这些样品对小鼠耳朵肿胀程度的变化，皮肤病理的变化，血清ige水平，皮肤组织il-4、il-5、il-13、il-10、ifn-γ的水平，确定这些样品在缓解特应性皮炎(湿疹)方面的功效及差异性。
[0192]
2、方案
[0193]
将6周龄雄性c57bl/6j小鼠随机分为4组，每组8只，包括空白对照组、模型组、组合物低剂量组(36.9mg/只/d)，组合物高剂量组(184.5mg/只/d)，各样品组样品均溶于0.2ml无菌生理盐水中，按照表19的要求进行灌胃处理，空白对照组和模型组灌胃0.2ml无菌生理盐水，其中组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：fos：gos：抗性糊精＝2:60:6:20)。
[0194]
表19
[0195][0196]
造模方法具体如下：模型组和组合物组第14天用脱毛器脱去小鼠背部体毛，面积约2.5cm
×
2.5cm。实验第15天各样品组小鼠皮损致敏与激发用0.5％dnfb溶液50μl一次小鼠背部脱毛区及右耳处，然后在第19天，第22天，第25天，第28天在小鼠背部用0.2％dnfb溶液20μl涂搽，右耳处用0.2％dnfb溶液20μl涂搽，空白对照组小鼠背部脱毛区仅涂搽丙酮/橄榄油基质溶液，所有分组均为自由饮水和摄食。
[0197]
3.具体指标
[0198]
①
小鼠耳朵的肿胀程度
[0199]
②
血清ige水平
[0200]
③
皮肤组织il-4、il-5、il-13、il-10、ifn-γ、ccl11、ccl22的水平
[0201]
4.实验结果
[0202]
4.1小鼠耳肿胀率和血清ige水平(表20)
[0203]
表20小鼠耳肿胀率和血清ige水平
[0204][0205]
注:*表示与模型组差异显著性(p《0.05)，下同。
[0206]
如表20所示，耳肿胀率方面，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比有显著性差异(p《0.05)。
[0207]
在血清ige水平方面，与模型组相比，组合物各剂量组有趋势下降(p《0.05)。
[0208]
4.2皮肤组织中细胞因子水平的影响(表21、22)
[0209]
表21各组小鼠皮肤组织中inf-γ、ccl11和ccl22水平
[0210][0211]
如表21所示，在inf-γ水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0212]
在ccl11水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0213]
在ccl22水平，与模型组相比，组合物样品组有提高。
[0214]
表22皮肤组织中il-4、il-5、il-10和il-13水平的影响
[0215][0216]
如表22所示，在il-4水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0217]
在il-5水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0218]
在il-10水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性提高(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0219]
在il-13水平，与模型组相比，组合物各剂量组都有显著性降低(p《0.05)，与空白组相比无显著性差异(p》0.05)。
[0220]
4.3肤组织的病理切片分析
[0221]
如图4，正常组小鼠皮肤切片正常，组织结构基本正常，细胞排列有序形态正常，皮层正常；模型组小鼠皮肤切片可见大量炎症细胞浸润，表皮层角化严重，大量皮质缺失，细胞间，细胞内水肿；各样品组小鼠皮肤可见细胞内水肿不明显，真皮内有少数炎症细胞，皮肤全层完整，表皮层角化减弱。
[0222]
以上结果表明，该专利组合物具有缓解特应性皮炎的作用。
[0223]
实施例7益生元和益生菌组合物在抑菌方面的应用
[0224]
1.内容
[0225]
通过双层平板点样法检测样品抑制致病微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌)的功效。
[0226]
2.方案
[0227]
利用双层平板法进行体外抑菌实验，实验分为3个大组，组合物低剂量组(1.5g)、组合物高剂量组(7.5g)，竞品组(2g)。所述组合物各组分重量比为(鼠李糖乳杆菌mp108：gos：fos：抗性糊精＝1.5:33:6:18)。每个大组都包含4种致病微生物的抑制实验。
[0228]
将样品利用无菌水按照1:3的比例稀释，吸取3μl点样至mrs固体琼脂培养基表面，在37℃的厌氧条件下培养24h。其次，将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆
菌分别在lb液体培养基、盐胱氨酸增菌液、肉浸液肉汤培养基、幽门螺旋杆菌培养基(液体)中培养至对数后期，然后取200μl菌体培养液加至6ml利用无菌水配制的含有0.5％琼脂的半固体培养基中，混匀，然后倾注至制备好的益生菌mrs固体平板上，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在37℃的厌氧条件下培养48h，幽门螺旋杆菌在37℃的三气培养箱中(85％n2，10％co2，5％o2)培养4天，观察抑菌圈直径的大小。
[0229]
3.具体指标
[0230]d抑菌圈
＝d
外圈-d
内圈(样品)
[0231]
4.实验结果(表23)：
[0232]
表23样品抑菌圈直径(mm)
[0233][0234]
注：所有数据表示为平均值
±
标准差(mm)。a-c不同字母表示相同致病菌组在不同样品下差异显著(p《0.05)；a-c不同字母表示在相同的样品中不同致病菌组之间差异显著(p《0.05)。(n＝3)
[0235]
抑菌圈直径越大，则代表该样品对致病菌的生长抑制能力越强。由表23可知，在对大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌的一直作用方面，组合物与目前市售样品的差异不显著。
[0236]
实施例8鼠李糖乳杆菌mp108耐酸耐胆碱能力测定
[0237]
1.实验材料(表24)
[0238]
表24
[0239][0240]
2.实验准备
[0241]
2.1准备培养基(表25)
[0242]
配制足够多的液体和固体mrs培养基，115℃灭菌后放于60℃冰箱备用。
[0243]
表25
[0244][0245]
2.2配制生理盐水
[0246]
普通生理盐水200ml(0.9％w/v的nacl)，灭完菌备用；ph等于8的生理盐水100ml，灭完菌备用；ph等于3的生理盐水100ml，灭完菌备用。
[0247]
2.3配制模拟肠液和模拟胃液
[0248]
2.3.1模拟肠液
[0249]
将胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司，1:250)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，用naoh调ph至8.0)中，使终浓度为1g/l，并加入胆盐(oxoid，lp0055，1391890-02)使终浓度为0.3％。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
[0250]
2.3.1模拟胃液
[0251]
将胃蛋白酶(生工生物工程(上海)股份有限公司，1:10000)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，盐酸调ph至3.0)中，终浓度为3g/l。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
[0252]
在超净工作台中准备适量无菌注射器、0.22μm无菌滤膜、50ml离心管、离心管架进行紫外杀菌30min。准备工作完成后，按照上述的配制方法在实验台称量溶解获得模拟胃液和模拟肠液。将溶解完全的模拟胃液和模拟肠液在超净工作台中用0.22μm无菌滤膜过滤至50ml离心管中，并做好标记。注意：过滤时先吸溶液至注射器中再通过滤膜过滤；不要用手触碰到滤器。
[0253]
3.实验方法
[0254]
3.1菌株活化
[0255]
第一步，从冰箱取出保菌管，化冻；从保菌管吸取3g菌粉/200μl菌液，接种至5ml液体培养基中，在恒温培养箱37℃条件下培养到平台初期(生长曲线不同，所对应的od也不同，实验前提前调研)，获得一代活化菌液；第二步，取一代活化的菌液100μl移入5ml液体培养基中，在恒温培养箱37℃条件下培养到平台初期，获得第二代活化菌液；重复第二步操作，获得第三代活化菌液。
[0256]
3.2胃液/肠液干预
[0257]
将平台期细菌以5000g/min离心5min收集1ml菌体于2个1.5ml离心管内，弃上清，加生理盐水洗2遍，离心，倒掉上清，其中一个离心管菌体重悬于模拟肠液/胃液中(切记用旋涡混合仪混合均匀)，分光光度计调整肠液/胃液od值为1.250(此时菌浓度为109cfu/ml)，得到加入模拟肠液/胃液的量。另一个离心管加入等体积的生理盐水，37℃培养4h后进行平板活菌计数。此时的平板计数建议选取下图所示的稀释度的菌液，每个稀释度做两个
平行。
[0258]
4.实验结果
[0259]
4.1鼠李糖乳杆菌mp108各样品组(表26)
[0260]
表26
[0261][0262]
4.2鼠李糖乳杆菌lgg各样品组(表27)
[0263]
表27
[0264][0265]
4.3数据可视化(图5)
[0266]
5.结论
[0267]
本实验使用ph＝3的模拟胃液和ph＝8的模拟肠液对益生菌mp108和市售益生菌lgg进行了处理，旨在检测益生菌mp108的耐酸耐胆盐能力。结果表明，胃液干预下的mp108与对照组相比并无显著性差异，虽然经模拟肠液处理后mp108活菌数有所下降，但耐胆盐能力明显好于市售益生菌lgg。实验证明益生菌mp108的耐酸耐胆盐能力优良，干预后的菌液浓度均大于106cfu/ml。
[0268]
实施例9单菌mp108益生元种类的确定
[0269]
根据实验结果，建议婴幼儿配方中，gos:fos的添加量为3:1，原因如下：
[0270]
一、针对该方向进行了三次实验，并且每个实验组都包含3个重复。
[0271]
第一次试验结果如图6所示。
[0272]
mp108在抗性糊精上的生长情况：ph值和无糖培养基对照一致。因此，证明抗性糊精在该产品中，不能促进mp108的生长。由于胃肠道的复杂性，无法确认产品在体内的浓度，因此，在不同浓度下的实验结果证明：
[0273]
(1)双益生元和单独的fos能够让mp108更快速的生长；
[0274]
(2)根据12小时计数结果，证明fos能够让mp108快速的生长，但是不能很好的保证活菌的状态；
[0275]
(3)双益生元相较于单独的fos能够更加稳定。
[0276]
第二次试验结果如图7所示。
[0277]
结果证明：当gos:fos＝1:1、3:1以及单独的gos，在培养12h时，活菌数都可以达到10次方。当gos:fos＝9:1、3:1时，培养24h，活菌数都可以达到9次方。
[0278]
第三次试验结果如图8所示。
[0279]
结果证明：gos:fos＝1:1和3:1无显著性差异，但好于9:1。
[0280]
综合以上三次的实验结果，建议产品配方选择gos:fos＝3:1或1:1。
[0281]
二、产品生产限制
[0282]
由于填充条过程中，需要加入40％左右的抗性糊精增加流动性，机器才可以稳定生产。