过氧化物酶体中修饰蛋白的表达

过氧化物酶体中修饰蛋白的表达
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年5月14日提交的美国临时申请第62/847,769号的权益，将所述美国临时申请在此通过引用以其整体并入。引用电子格式的序列表和表格
2.本技术是与2020年5月7日创建的标题为pbfab001wo2seqlist.txt的电子序列表(其大小为235kb)一起提交的。电子序列表中的信息在此通过引用以其整体并入。领域
3.本文提供了用于基因修饰细胞以产生例如可用于人工材料的蛋白质和蛋白质前体的方法和组合物。背景
4.本领域需要在细胞中产生和修饰蛋白质的改进方法。在细胞中产生和修饰的蛋白质可以以多种方式使用。概述
5.本文描述了用于产生蛋白质的方法，所述蛋白质可以充当材料的前体，如考虑了用于膜显影中产物的底物；用于丸剂的胶囊(药物和保健品中的明胶)；用于食品和合成肉的食品添加剂(例如所有明胶)和胶原，纺织品如合成皮革，美容产品和生物医学材料(支架、缝合线、移植物、扩增细胞、凝胶等)。这种方法的使用还可以提供从目前使用的标准制造方法减少产品碳足迹的材料。
6.考虑了可用于材料生产的蛋白质前体。例如，使用与常规生产的纺织品相比降低温室气体排放的细胞工程和组织工程技术，考虑了下一代织物，如人工制造的纺织品。
7.蛋白质前体可以用作胶原衍生产品，其可以在例如面霜、可注射药物和伤口敷料中找到。
8.本文提供了用于基因修饰细胞以产生蛋白质和蛋白质前体(例如可用于人工材料的那些)的方法和组合物。
9.本文提供的一些实施方案涉及用于制备基因修饰细胞以在过氧化物酶体中产生修饰蛋白的方法和组合物。本文所述的修饰蛋白可用作用于生产材料如纺织品、人造皮肤或其它材料的结构单元。在一些纺织品中发现的蛋白质的生产被考虑用于细胞生产系统。
10.本文提供的一些实施方案涉及制备用于在过氧化物酶体中产生修饰蛋白的细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：提供细胞，将第一核酸引入到细胞中以及将第二核酸引入到细胞中。在一些实施方案中，第一核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的第一序列。在一些实施方案中，第二核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶的第二序列。在一些实施方案中，细胞是细菌或古细菌。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，细胞选自arxula、假丝酵母属(candida)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、komagataella、ogataea、毕赤酵母属(pichia)、酵母属(saccharomyces)或耶氏酵母属(yarrowia)。在一些实施方案中，第一和/
或第二核酸包括启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型或诱导型的。在一些实施方案中，过氧化物酶体靶向序列包含seq id no:1(slk)、seq id no:2(rlxxxxx(h/q)l)或seq id no:3(lgrgrrskl)所示的序列。在一些实施方案中，蛋白质包含标签。在一些实施方案中，标签是可切割的。在一些实施方案中，所述方法还包括将第三核酸引入到细胞中。在一些实施方案中，第三核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的第二异源修饰酶的第三序列。在一些实施方案中，异源蛋白的分子量为1da、5da、10da、20da、30da、40da、50da、60da、70da、80da、90da、100da、200da、300da、400da、500da、600da、700da、800da、900da、1kda、5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、110kda、120kda、130kda、140kda、150kda、160kda、170kda、180kda、190kda、200kda、210kda、220kda、230kda、240kda、250kda、260kda、270kda、280kda、290kda或300kda，或在由任何两个上述值限定的范围内的任何分子量大小。在一些实施方案中，酶产生修饰。在一些实施方案中，修饰是蛋白质的折叠。在一些实施方案中，蛋白质是未折叠的。在一些实施方案中，修饰是蛋白质折叠、羟基化、糖基转移、氧化和/或异构化。在一些实施方案中，所述酶包括脯氨酰羟化酶、糖基转移酶、赖氨酰氧化酶、蛋白伴侣或脯氨酰异构酶。在一些实施方案中，所述酶是糖基转移酶、脯氨酰异构酶、蛋白质二硫化物异构酶、羟基转移酶或脯氨酰羟化酶。在一些实施方案中，蛋白质包括胶原、明胶或丝蛋白。在一些实施方案中，所述酶包括糖基转移酶、脯氨酰羟化酶或脯氨酰异构酶。在一些实施方案中，其中所述蛋白质是胶原，所述胶原被修饰，产生i型异三聚体，i型α同三聚体或iii型同三聚体胶原。在一些实施方案中，胶原包含col1a1或col1a2。在一些实施方案中，脯氨酰-4-羟化酶被基因修饰以具有pdi结构域的缺失。在一些实施方案中，所述酶被基因修饰以改善表达并导入过氧化物酶体中。在一些实施方案中，所述蛋白质被基因修饰以改善表达并导入过氧化物酶体中。在一些实施方案中，核酸经密码子优化用于真核细胞如酵母细胞中的蛋白表达。在一些实施方案中，异源蛋白与过氧化物酶体靶向序列的融合导致异源蛋白靶向过氧化物酶体，从而将异源蛋白与不靶向过氧化物酶体的酶分离。在一些实施方案中，修饰酶与过氧化物酶体靶向序列的融合导致修饰酶靶向过氧化物酶体，从而将修饰酶与不靶向过氧化物酶体的底物或酶分离。在一些实施方案中，异源蛋白包括colsyn1、colsyn2、colsyn3、colsyn4或与colsyn1、colsyn2、colsyn3或colsyn4的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，与未修饰的或天然存在的第一核酸相比，第一核酸被工程化以用异源蛋白中的亲水性或非疏水性氨基酸替代至少一个疏水性氨基酸。
11.本文提供的一些实施方案涉及用于在过氧化物酶体中产生蛋白质的真核细胞，其通过本文提供的任何方法制备。
12.本文提供的一些实施方案涉及用于在过氧化物酶体中产生蛋白质的真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的序列，所述第二核酸编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。
13.本文提供的一些实施方案涉及包含用于产生修饰蛋白的过氧化物酶体的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞能够表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，蛋白质在过氧化物酶体中被修饰。在一些实施方案中，所述细胞是巴斯德氏菌(pastoris)。在一些实施方案中，过
氧化物酶体靶向序列包含seq id no:1、2或3所示的序列。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的第二蛋白的第三核酸。
14.本文提供的一些实施方案涉及在含有过氧化物酶体的真核细胞中产生修饰蛋白的方法。在一些实施方案中，真核细胞表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，所述方法包括：提供通过本文所述的任一种替代方案的方法制备的细胞或本文所述的任一种替代方案的细胞，在真核细胞中表达异源蛋白，以及在使得异源修饰酶在过氧化物酶体中修饰异源蛋白以产生修饰蛋白的条件下培养真核细胞。在一些实施方案中，异源蛋白与过氧化物酶体靶向序列融合。在一些实施方案中，所述方法还包括增加过氧化物酶体的货物。在一些实施方案中，增加过氧化物酶体的货物是通过向真核细胞提供油酸或甲醇进行的。
15.本文提供的一些实施方案涉及在含有过氧化物酶体的真核细胞中产生修饰蛋白的方法。在一些实施方案中，真核细胞表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，所述方法包括在真核细胞中表达异源蛋白，以及在使得异源修饰酶在过氧化物酶体中修饰异源蛋白以产生修饰蛋白的条件下培养所述真核细胞。在一些实施方案中，异源蛋白与过氧化物酶体靶向序列融合。在一些实施方案中，所述方法还包括增加过氧化物酶体的货物。在一些实施方案中，增加过氧化物酶体的货物是通过向真核细胞提供油酸或甲醇进行的。
16.本文提供的一些实施方案涉及产生修饰蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在使得产生修饰蛋白的条件下培养含有过氧化物酶体的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞表达：与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白，以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，异源修饰酶修饰异源蛋白以在培养条件下在过氧化物酶体中产生修饰蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括增加过氧化物酶体的货物。在一些实施方案中，增加过氧化物酶体的货物是通过向真核细胞提供油酸或甲醇进行的。
17.本文提供的一些实施方案涉及提高修饰蛋白产率的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在产生修饰蛋白的条件下培养含有过氧化物酶体的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，异源蛋白的表达在启动子的影响下。在一些实施方案中，异源修饰酶修饰异源蛋白以在培养条件下在过氧化物酶体中产生修饰蛋白，以及通过加入化学诱导物诱导异源蛋白的产生。在一些实施方案中，所述方法还包括增加过氧化物酶体的货物。在一些实施方案中，增加过氧化物酶体的货物是通过向真核细胞提供油酸或甲醇进行的。
18.一些实施方案涉及用于在细胞中的过氧化物酶体中产生修饰蛋白的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：包含gfp-x-epts1或x-flag-epts1的第一核酸构建体以及包含gfp-y-epts1或y-flag-epts1的第二核酸构建体。在一些实施方案中，x是编码待靶向过氧化物酶体的异源蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，y是编码待靶向过氧化物酶体的修饰酶的核酸序列。在一些实施方案中，修饰酶是能够修饰过氧化物酶体中的异源蛋白的酶。附图简述
19.图1显示了代表将蛋白质和酶引导至细胞的过氧化物酶体的实例的示意图。
20.图2显示了根据一些实施方案的基因修饰的酵母的发酵、翻译修饰的蛋白质的纯化的示意图。
21.图3描绘了野生型(上排)或缺失pex5基因修饰(下排)并表达融合蛋白的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株的显微数据的图像。融合物包括与合成胶原肽和胶原修饰酶融合的n-末端gfp和c-末端epts1。
22.图4显示了与gfp和c-末端epts1融合的胶原变体在分别代表不同工业酵母宿主pbh001、pbh002和pbh004的菌株pb000095、pb000163、pb000297中的荧光定位。
23.图5显示了在ypd或yp半乳糖平板上连续稀释的菌株的集落生长。菌株表达gal-sigd1-351-epts1(顶部)或gal-sigd1-351(底部)。
24.图6显示了过氧化物酶体定位的tev-flag-epts1蛋白酶活性对过氧化物酶体定位的rfp-tev-tfp-epts1底物(图面a)或细胞质rfp-tev-yfp底物(图面b)的蛋白质印迹的图像。tev蛋白酶表达由不同的组成型或诱导型启动子和生长条件控制：(1)ptef1，(2)prpl18b，(3)pgal1，被右旋糖抑制，(4)pgal1，被棉子糖和右旋糖抑制，和(5)pgal1，被棉子糖和半乳糖诱导。用抗trfp抗体探测蛋白质印迹以识别全长54kda底物或27kda切割产物。
25.图7显示了在过氧化物酶体中bant p4h羟化酶对胶原的活性。图面a描绘了菌株列表。bant p4h由tdh3启动子表达，以及胶原底物由tef1启动子表达。图面b显示了用geneious软件对来自每个菌株的胶原底物进行比对。共有序列显示了1.pb000224；2.pb000248；和3.pb000249表现出相同的序列(seq id no:71)，以及4.pb000225；5.pb000254；和6.pb000255表现出相同的序列(seq id no:72)。氨基酸下方的灰色框表示通过lcmsms鉴定为被氧化的脯氨酸位置。图面c显示了在每个修饰位点的lcmsms结果的细节。
26.图8显示了在酿酒酵母中与gfp标签融合的epts1标记的全长胶原amcol1a或amcol1a2和与mruby标签融合的epts1标记的bantp4h羟化酶的体内荧光定位。图像分别被显示为用于gfp和mruby检测的单独的fitc和texasred通道。合并的图像是fitc和texasred通道的重叠，意味着两种蛋白质的共定位。详述定义
27.本文提供的题目、标题和小标题不应被解释为限制本公开内容的各个方面。因此，下面紧接着定义的术语通过参考说明书以其整体来更充分地定义。
28.除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
29.在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用重新提及仅在替代方案中多于一项在前的独立权利要求或从属权利要求。此外，除非另有具体说明，否则术语如“要素”或“组分”涵盖包含一个单元的要素和组分以及包含一个以上亚单元的要素和组分。
30.注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该”以及任何措辞的任何单数使用包括复数指示物，除非明确且毫不含糊地限于一个指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列
表中项目的陈述不排除可被取代或添加到所列项目中的其它类似项目。
31.如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
32.单位、前缀和符号以其国际单位制(syst
è
me international de unites，si)接受的形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值应理解为近似的。
33.如根据本公开内容所使用的，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义。
34.如本文所用，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语“约”通常是指本领域普通技术人员将认为等同于所述值(例如，具有相同的函数或结果)的数值范围(例如，所述范围的 /-5-10％)。当诸如“至少”和“约”的术语在数值或范围的列表之前时，该术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语“约”可以包括被舍入到最近的有效数字的数值。
35.当根据说明书阅读时，“过氧化物酶体”具有其一般和普通的含义，并且可以包括但不限于，例如，用于极长链脂肪酸、支链脂肪酸、d-氨基酸和多胺、活性氧物质的还原、缩醛磷脂的生物合成(即，对于哺乳动物脑和肺的正常功能至关重要的醚磷脂)的分解代谢的细胞器。在一些酵母中，过氧化物酶体还可以对乙醛酸循环、糖酵解和甲醇和/或胺氧化和同化起作用。过氧化物酶体也可以具有其自身的天然酶。在没有限制的情况下，所述酶可以包括针对氧化酶(如d-氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶)的过氧化氢酶。在本文的实施方案中，过氧化物酶体可以起制备蛋白质或修饰蛋白质的作用。
36.当根据说明书阅读时，对蛋白质的“修饰”具有其一般和普通的含义。在没有限制的情况下，修饰可以包括蛋白质在一级、二级、三级和四级结构上的改变；加入共价修饰、蛋白质折叠、蛋白质组装成多亚基复合物的四级结构和翻译后修饰。除脯氨酰羟基化之外的其它修饰也可在过氧化物酶体中实现。过氧化物酶体对于许多小分子是天然可渗透的，所述小分子通过修饰酶作为修饰底物。事实上，已经确定过氧化物酶体具有尺寸门控，其中小于约700道尔顿的分子可以自由地扩散进入该细胞器中。不能自由地扩散进入过氧化物酶体的底物必须被运输。运输可以经由靶向过氧化物酶体膜的膜蛋白特异性地或混杂地导入。
[0037]“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(pcr)产生的片段和通过连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(如dna和rna)、或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)、或两者的组合的单体组成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基团替代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间上和电子上类似的结构(如氮杂-糖和碳环糖类似物)替代。碱基部分修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、或其它众所周知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯
(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接到聚酰胺骨架上的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或双链的。在一些替代方案中，提供了包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的序列的核酸序列。在一些替代方案中，核酸是rna或dna。
[0038]“真核”细胞包括但不限于藻类细胞、真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如t细胞)。在一些实施方案中，所述细胞选自由komagataella、毕赤酵母属、汉逊酵母属和ogataea组成的甲基营养型酵母属。在一些实施方案中，所述细胞选自另外的出芽酵母属、arxula、假丝酵母属、kluveromyces、酵母属和耶氏酵母属。
[0039]
当根据说明书阅读时，“细菌细胞”具有其一般和普通的含义。细菌细胞被主要由磷脂制成的细胞膜包围。该膜包裹细胞的内容物，并充当屏障将细胞质的营养物，蛋白质和其它必需成分保持在细胞内。然而，与真核细胞不同，细菌通常在其细胞质中缺乏大的膜结合结构，如细胞核、线粒体、叶绿体和真核细胞中存在的其它细胞器。用于蛋白质表达的细菌可以包括例如大肠杆菌。
[0040]
当根据说明书阅读时，“古细菌”具有其一般和普通的含义。古细菌或古生菌可以在极端环境(如在海底的极热热液喷口)中生活。古生菌和细菌都非常相似。它们都是具有细胞壁和细胞膜的单细胞原核生物。它们之间的主要区别在于它们的化学结构以及它们生活的地方。实例可以包括但不限于嗜热菌、嗜盐菌和产甲烷菌。
[0041]
当根据说明书阅读时，“启动子”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如引导结构基因转录的核苷酸序列。在一些替代方案中，启动子位于基因的5’非编码区，靠近结构基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括rna聚合酶结合位点、tata序列、caat序列、分化特异性元件(dse；mcgehee等人,mol.endocrinol.7:551(1993)；通过引用以其整体并入)、环amp反应元件(cre)、血清反应元件(sre；treisman,seminars in cancer biol.1:47(1990)；通过引用以其整体并入)、糖皮质激素反应元件(gre)和其它转录因子的结合位点，如cre/atf(o'reilly等人,j.biol.chem.267:19938(1992)；通过引用以其整体并入)、ap2(ye等人,j.biol.chem.269:25728(1994)；通过引用以其整体并入)、sp1、camp反应元件结合蛋白(creb；loeken,gene expr.3:253(1993)；通过引用以其整体并入)和八聚体因子(一般参见watson等人编,molecular biology of the gene,第4版(the benjamin/cummings publishing company,inc.1987；通过引用以其整体并入))，以及lemaigre和rousseau,biochem.j.303:1(1994)；通过引用以其整体并入)。如本文所用，启动子可以是组成型活性的、阻抑型的或诱导型的。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导物而增加。相比之下，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导物的调节。在本文的一些实施方案中，所提供的核酸包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子是用于蛋白质翻译的酵母启动子。在一些实施方案中，其中所述细胞是毕赤酵母，所述启动子包含甲醇诱导型启动子p
aox1
或组成型启动子p
gap
。在一些实施方案中，启动子包含paox、pgal、pcup、pgem或pzpm。
[0042]
当根据说明书阅读时，过氧化物酶体靶向信号(pts)具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如受体识别并结合的过氧化物酶体蛋白的区域。含有该基序的蛋白质定位于过氧化物酶体。在本文的一些实施方案中，提供了包含与pts可操作地连接的蛋白质序列的核酸。
[0043]
当根据说明书阅读时，“蛋白质标签”或“标签”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如遗传移植到重组蛋白质上的肽序列。通常，这些标签可以通过化学试剂或通过酶促手段如蛋白质水解或内含肽剪接来去除。出于各种目的，将标签连接到蛋白质上，诸如例如作为用于纯化或增溶的亲和标签。在过氧化物酶体中，为了蛋白质稳定，也可以将标签加入到蛋白质或酶。在本文的一些实施方案中，在过氧化物酶体中为了修饰表达的蛋白质包含标签。在一些实施方案中，标签选自组氨酸(例如his6)、麦芽糖结合蛋白、gst.flag、fc结构域和strep标签。
[0044]
在根据说明书阅读时，“蛋白质”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如包含一个或多个多肽链的大分子。因此，蛋白质可以包含肽，其是通过任何一个或多个氨基酸形成的肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的链。蛋白质或肽可以含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。在没有限制的情况下，氨基酸是例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、焦赖氨酸(pyrolysine)、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鸟氨酸、s-腺苷甲硫氨酸和硒代半胱氨酸。蛋白质也可以包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，通过琥珀密码子抑制进行非天然氨基酸掺入。蛋白质还可以包含非肽组分，诸如例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以由其中产生蛋白质的细胞添加到蛋白质中，并且将随着细胞类型而变化。蛋白质在本文中根据它们的氨基酸主链结构来定义；取代基如碳水化合物基团通常没有具体说明，但是也可以存在。在本文所述的一些替代方案中，提供了在过氧化物酶体中制备修饰蛋白的方法。在一些实施方案中，修饰蛋白包括胶原，明胶或丝蛋白。在一些纺织品中，还考虑了蛋白质，如球蛋白样蛋白质、角蛋白、胶原水解产物、胶原肽和胶原。
[0045]
当根据说明书阅读时，“胶原”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如在皮肤和其它结缔组织中发现的结构蛋白。在本文的一些实施方案中，胶原在过氧化物酶体中被修饰。
[0046]
当根据说明书阅读时，“明胶”具有其一般和普通的含义，并且可以包括，例如，从胶原制备的水溶性蛋白。在一些实施方案中，提供明胶用于在过氧化物酶体中进行修饰。
[0047]
当根据说明书阅读时，“异构酶”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如催化指定化合物转化为异构体的酶。本领域技术人员将理解，存在许多类型的异构酶，诸如例如，消旋酶、差向异构酶、顺式-反式异构酶和分子内转移酶。
[0048]
当根据说明书阅读时，“羟基转移酶”具有其一般和普通的含义，并且可以包括，例如，诸如脯氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶的酶。
[0049]
当根据说明书阅读时，“糖基转移酶”具有其一般和普通的含义，并且可以包括例如建立糖苷键的酶。
[0050]
本领域技术人员将理解基因表达水平取决于许多因素，如启动子序列和调节元件。最大蛋白质选择的另一个因素是转录本基因的密码子对宿主的典型密码子使用的适应性。如针对大多数细菌和酵母细胞所注意到的，例如，trna物质识别小的密码子子集，导致翻译选择，这可能是蛋白质表达的重要限制。在这方面，可以设计许多合成基因以提高它们的蛋白表达水平。密码子优化的设计过程可以是将稀有密码子改变为已知增加最大蛋白表达效率的密码子。在一些替代方案中，描述了密码子选择，其中通过使用本领域技术人员已
知的算法进行密码子选择，以产生针对较高水平的转录和蛋白质产率而优化的合成基因转录物。含有密码子优化算法的程序是本领域技术人员已知的。程序可以包括例如optimumgene
tm
、算法等。另外，合成的密码子优化序列可以例如从integrated dna technologies和其它商业上可获得的dna测序服务在商业上获得。在一些替代方案中，制备蛋白质，使得用于修饰蛋白质的基因经密码子优化以在酵母(诸如例如毕赤酵母)中表达。在一些替代方案中，描述了蛋白质或酶，其中蛋白质或酶的完整基因转录物的基因经密码子优化以在真核细胞(如酵母)中表达，这可以增加在酵母过氧化物酶体中用于修饰的蛋白质的浓度。
[0051]
当根据说明书阅读时，“纯化”具有其一般和普通的含义，并且可以包括，例如，高度纯化的细胞、过氧化物酶体和蛋白质的分离。在细胞纯化的方法中，细胞可以通过其与连接至支持物的配体结合的能力来分离、分开或选择，所述支持物例如塑料或聚碳酸酯表面、珠粒、颗粒、板或孔。细胞可以基于特定的细胞表面标志物结合，这允许它们被纯化。在过氧化物酶体的情况下，本领域技术人员将理解过氧化物酶体纯化的方法，诸如例如离心。蛋白质也可以被纯化。蛋白质纯化的方法是本领域技术人员已知的，诸如例如尺寸排阻和亲和层析。
[0052]
纺织品和配饰是经常购买和最经常更换的消费品。此外，大多数衣服不会穿很久并且需要频繁更换。对于衣服来说，高周转率、大生产量和耗能的使用使得衣服在资源消耗和温室气体排放方面成为重要的产品类别。
[0053]
为了避免与制作衣服相关的问题，将需要解决几个方面，如衣服和配饰的碳足迹。碳足迹可以被描述为由组织、事件、产品或人引起的温室气体排放的总集合。如本文所述的是降低与纺织品生产相关的碳足迹的方法和单元。例如，衣服物品的碳足迹是在该物品的生命周期中排放的二氧化碳(co2)和其它温室气体的总量，以千克的co2当量表示。这包括在原材料的制造、物品的制作、材料和成品的运输、包装、使用阶段(包括多次洗涤和干燥循环)和寿命终止处置中产生的所有温室气体。
[0054]
也考虑了用于其它材料的蛋白质前体。由细胞产生的蛋白质可以是几种材料的前体，如考虑了用于膜显影的产物；用于丸剂的胶囊(药物和保健品中的明胶)；用于食品和合成肉的食品添加剂(例如所有明胶)和胶原，合成皮革，美容产品和生物医学材料(支架、缝合线、移植物、扩增细胞、凝胶等)。
[0055]
为了避免与高碳足迹相关的问题，描述了制造用于生产纺织品的前体的方法。如本文实施方案中所述的是在细胞的细胞器(如过氧化物酶体)中制备修饰蛋白的方法。过氧化物酶体是普遍存在的多功能细胞器，其主要由于其在细胞脂质代谢中的作用而是已知的。过氧化物酶体包括可以催化氧化还原反应作为其正常功能的一部分的过氧化物酶体酶，这些细胞器也日益被认为是氧化应激相关信号传导途径的潜在调节物。
[0056]
为了在过氧化物酶体内进行加工，可以通过信号序列引导蛋白质转运到过氧化物酶体。编码信号传导序列的序列可以与编码蛋白质的序列可操作地连接。在蛋白质翻译后，该蛋白质因此被引导至过氧化物酶体。
[0057]
自从在1965年发现过氧化物酶体以来，已经很好地描述了过氧化物酶体(sabatini等人；pnas august 13,2013.110(33)13234-13235以及purdue等人；annu.rev.cell dev.biol.2001.17:701
–
52；通过引用以其整体并入本文)。过氧化物酶体
是缺乏dna和核糖体的小细胞器并且由单个膜排列。过氧化物酶体蛋白由核基因编码，在胞质中游离的核糖体上合成，然后掺入到预先存在的过氧化物酶体中。在细胞的寿命期间，过氧化物酶体可以通过例如添加蛋白质和脂质而扩大，并且可以最终分裂，形成一个新的过氧化物酶体。
[0058]
过氧化物酶体的大小和酶组成可以变化。然而，过氧化物酶体可能都含有使用分子氧来氧化各种底物，形成过氧化氢(h2o2)的酶。过氧化物酶体因基于h2o2的呼吸以及脂肪酸β-氧化而为人所知。在没有限制的情况下，过氧化物酶体的功能可以包括例如醚脂(ether lipid)(缩醛磷脂)合成和胆固醇合成、发芽种子中的乙醛酸循环(“乙醛酸循环体”)、光呼吸、锥体虫中的糖酵解(“糖体(glycosomes)”)，以及酵母中的甲醇和/或胺氧化和同化。
[0059]
被引导在过氧化物酶体中加工的蛋白质可以具有c-和/或n-末端靶向序列，其引导折叠的蛋白质进入过氧化物酶体基质。在从胞质核糖体翻译和释放后，新合成的靶向过氧化物酶体的蛋白质可以在导入细胞器之前在胞质中折叠成其成熟构象。折叠也可以在伴侣蛋白的帮助下发生。导入过氧化物酶体的蛋白质需要atp水解，然而，与一些运输系统不同，过氧化物酶体膜上没有电化学梯度。先前已经描述了用于运输的标签(purdue等人)。在一些实施方案中，蛋白质在伴侣蛋白的帮助下折叠。
[0060]
靶向过氧化物酶体的一些蛋白质的摄取靶向信号是ser-lys-leu序列(单字母代码中的skl)或在蛋白质c末端的相关序列。skl信号可以结合胞质中的可溶性受体蛋白，如过氧化物酶蛋白(peroxin)。有几类过氧化物酶蛋白(pts)，如pts1和pts2。然后，所得pts1r-过氧化氢酶复合物与受体蛋白结合。已经在过氧化物酶体膜中鉴定了胞质受体，如pts1的pex5p和pts2的pex7p，然后将靶蛋白向内转运到过氧化物酶体中。skl序列在其进入过氧化物酶体后不被过氧化氢酶切割。
[0061]
在没有限制的情况下，基质蛋白可以合成为具有n-末端摄取-靶向序列的前体。具有这种类型的摄取-靶向信号的蛋白质与命名为pts2r的不同胞质受体蛋白结合，其与pts1r一样将前体蛋白护送到过氧化物酶体膜上的pex14p受体。在导入这种蛋白质后，n-末端靶向序列被切割。过氧化物酶体膜蛋白也在游离多核糖体上合成，并在其合成后掺入到过氧化物酶体中。将蛋白质靶向过氧化物酶体膜的信号不包含skl序列，但关于这一摄取过程知之甚少。
[0062]
除了脯氨酰羟基化之外的其它修饰也可在过氧化物酶体中实现。例如，通过用过氧化物酶体导入标签进行标记将糖基转移酶共导入过氧化物酶体，可以使蛋白质底物如胶原糖基化。过氧化物酶体对于许多小分子是天然可渗透的，所述小分子通过修饰酶而充当修饰底物。不能自由扩散进入过氧化物酶体的底物必须被运输。运输可以经由靶向过氧化物酶体膜的膜蛋白特异性地或混杂地导入。
[0063]
修饰也可以发生在过氧化物酶体的细胞质表面。在没有限制的情况下，这些修饰可以包括例如泛素化和磷酸化。
[0064]
伴侣蛋白也可以被标记用于过氧化物酶体转运。因此，伴侣蛋白可用于过氧化物酶体，用于过氧化物酶体中转运蛋白的正确折叠。制备用于产生修饰蛋白的基因修饰细胞的方法
[0065]
在一些实施方案中，提供了制备用于在过氧化物酶体中产生修饰蛋白的细胞的方
法。所述步骤可以包括提供细胞；将第一核酸引入到细胞中，其中所述第一核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的第一序列；以及将第二核酸引入到细胞中，其中所述第二核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶的第二序列。细胞可以是真核细胞。在一些实施方案中，引入在氯化钙存在下进行。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的标准转化技术(如电穿孔)进行引入。
[0066]
在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞，如酿酒酵母、毕赤酵母(pichia pastoris)和汉逊酵母(ogataea polymorpha)。对于巴斯德氏菌细胞，例如，核酸可以具有启动子，该启动子允许在甲醇存在下诱导蛋白质。
[0067]
在一些实施方案中，第一和/或第二核酸包含启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型或诱导型的。
[0068]
在一些实施方案中，过氧化物酶体靶向序列包含seq id no:1(slk)、seq id no:2(rlxxxxx(h/q)l)或seq id no:3(lgrgrrskl)所示的序列。
[0069]
在一些实施方案中，蛋白质包含标签。在一些实施方案中，标签是可切割的。标签可以是允许过氧化物酶体环境中蛋白质的溶解性或蛋白质的稳定性的标签。
[0070]
在一些实施方案中，所述方法还包括将第三核酸引入到细胞中，其中所述第三核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的第二异源修饰酶的第三序列。
[0071]
在一些实施方案中，酶催化选自以下的修饰：选自羟基化、氧化、糖基转移和异构化的一组修饰。
[0072]
在一些实施方案中，所述酶包含糖基转移酶、异构酶(例如脯氨酰和二硫化物)、羟基转移酶(例如脯氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶)。
[0073]
在一些实施方案中，所述酶选自：糖基转移酶、异构酶、脯氨酰异构酶、羟基转移酶或脯氨酰羟化酶。
[0074]
在一些实施方案中，所述蛋白质包括胶原、明胶或丝蛋白。
[0075]
如图1所示，细胞包含编码蛋白质和酶的核酸，所述蛋白质和酶被标记用于在过氧化物酶体中转运。翻译后，c-末端或n-末端标签发信号，使蛋白质和酶转运到过氧化物酶体中，在那里它们被进一步加工。细胞
[0076]
在一些实施方案中，用于在过氧化物酶体中产生蛋白质的真核细胞通过本文所述的任一实施方案的方法制备。在一些实施方案中，所述细胞包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的序列，所述第二核酸编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，所述细胞包含用于产生修饰蛋白的过氧化物酶体，其中真核细胞能够表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。在一些实施方案中，所述细胞包含用于产生修饰蛋白的过氧化物酶体，其中所述真核细胞包含：编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白的第一核酸序列以及编码与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶的第二核酸序列(参见图1)。
[0077]
在一些实施方案中，提供了真核细胞，其包含用于产生修饰蛋白的过氧化物酶体，其中所述过氧化物酶体包含：与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。
[0078]
在一些实施方案中，蛋白质在过氧化物酶体中被修饰。在一些实施方案中，所述细胞是巴斯德氏菌。在一些实施方案中，过氧化物酶体靶向序列包含seq id no:1、2或3所示的序列。所述细胞还包含编码与过氧化物酶体靶向序列融合的第二蛋白的第三核酸。
[0079]
细胞可以用于在标准发酵液中发酵。本领域技术人员将理解使用于蛋白质生产的细胞生长的标准方法。在一些实施方案中，发酵可以在诱导物存在下或在甲醇存在下进行。
[0080]
在一些实施方案中，其中在大规模生产中需要大量蛋白质，细胞在发酵罐中生长。酿酒酵母、毕赤酵母和汉逊酵母的优点是它们可以以多产的生长速率生长。发酵罐可以用于防止由于ph控制、氧限制、营养物限制和温度波动引起的限制。发酵罐不仅通过增加搅拌，而且通过增加空气流，通过用纯氧补充空气流而使溶解氧(do)水平升高。营养物限制也可以最小化，因为发酵罐可以以“进料模式”运行，其中新鲜的培养基或生长限制营养物可以以能够补充耗损的营养物的速率泵入容器。发酵罐还可以控制甲醇流速以调节细胞中甲醇的存在，以及以适当的速率提供甲醇，以允许加入刚好足够的甲醇用于蛋白质合成，同时防止过量的甲醇加入，这可能引起毒性。产生修饰蛋白的方法
[0081]
在一些实施方案中，提供了在含有过氧化物酶体的真核细胞中产生修饰蛋白的方法，其中所述真核细胞表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。所述方法包括提供通过本文任一实施方案中所述的方法制备的细胞或本文任一实施方案中所述的细胞；在真核细胞中表达异源蛋白，其中所述异源蛋白与过氧化物酶体靶向序列融合；以及在使得所述异源修饰酶在过氧化物酶体中修饰异源蛋白以产生修饰蛋白的条件下培养所述真核细胞。
[0082]
在一些实施方案中，提供了在含有过氧化物酶体的真核细胞中产生修饰蛋白的方法，其中所述真核细胞表达与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶。所述方法可以包括以下步骤：在真核细胞中表达异源蛋白，其中所述异源蛋白与过氧化物酶体靶向序列融合；以及在使得所述异源修饰酶在过氧化物酶体中修饰异源蛋白以产生修饰蛋白的条件下培养所述真核细胞。
[0083]
在一些实施方案中，提供了在真核细胞中产生修饰蛋白的方法，其包括产生修饰蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：在使得产生修饰蛋白的条件下培养含有过氧化物酶体的真核细胞，其中所述真核细胞表达：与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶，其中所述异源修饰酶修饰所述异源蛋白以在培养条件下在过氧化物酶体中产生修饰蛋白。
[0084]
在一些实施方案中，提供了在真核细胞中产生修饰蛋白的方法，其包括提高修饰蛋白产率的方法。在一些实施方案中，真核细胞来自酿酒酵母、毕赤酵母或汉逊酵母。所述方法包括在使得产生修饰蛋白的条件下培养含有过氧化物酶体的真核细胞，其中所述真核细胞表达：与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白，其中所述异源蛋白的表达在启动子的影响下；以及与过氧化物酶体靶向序列融合的异源修饰酶，其中所述异源修饰酶修饰所述异源蛋白以在培养条件下在过氧化物酶体中产生修饰蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括通过添加化学诱导物来诱导异源蛋白的产生。在一些实施方案中，所述方法还包括增加过氧化物酶体的货物，其中增加过氧化物酶体的货物是通过向真核细胞提供油酸或甲醇进行的。
[0085]
在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种核酸转化细胞(参见，例如，图2)。在一些实施方案中，允许转化的细胞发酵。在一些实施方案中，在发酵和诱导用于翻译的蛋白质后，进行转运，然后收获细胞。在一些实施方案中，将细胞离心。
[0086]
在一些实施方案中，然后制备细胞用于裂解。匀浆器可以用于破坏酵母细胞。匀浆器可以通过对细胞悬液加压并突然释放压力来裂解细胞。这产生了能够裂解细胞的液体剪切。对于老式匀浆器，弗氏压碎器和manton-gaulin匀浆器的典型操作压力是6000-10,000psi。需要多次(至少3次)通过以实现合理的裂解程度。然而，高操作压力可能导致操作温度的升高。因此，在一些实施方案中，在使用之前将压敏元件(pressure cells)冷却(4℃)。除了温度控制之外，在一些实施方案中应小心以避免通过发泡使蛋白质失活。因此，可以以增量施加压力。在一些实施方案中，裂解也必须在蛋白酶抑制剂存在下进行。
[0087]
现代匀浆器更适于裂解酵母细胞，因为它们可以在高得多的压力下操作。例如，avestin emulsiflex-c5可以用于在30,000psi(200mpa)下裂解毕赤酵母细胞。
[0088]
玻璃珠涡旋也可以用于细胞裂解，其通过与玻璃珠(0.4-0.5mm)一起搅拌来破坏酵母细胞。几个搅拌周期(30-60秒)必须与冰上冷却周期交替进行，以避免细胞悬液的过热。破损率是可变的，但可以远远超过50％(高达95％)。在上面描述了小体积(高达15ml)的方法，但是可以使用专门的设备将其放大到许多升。
[0089]
酶促裂解也可用于裂解细胞。酵母细胞的酶促裂解是基于细胞壁被多种酶消化，如消解酶(zymolase)和溶壁酶是最广泛使用的。
[0090]
在一些实施方案中，裂解后，将上清液旋转减慢(spun down)并且也可以过滤以去除颗粒物质。过氧化物酶体的纯化是本领域技术人员已知的，并且可以在离心机中通过梯度进行。过氧化物酶体也可以通过商业试剂盒(例如sigma aldrich的过氧化物酶体分离试剂盒)分离。
[0091]
过氧化物酶体裂解后，可以针对目的蛋白纯化裂解物。在大批纯化(bulk purification)后，可以将蛋白质与裂解的过氧化物酶体分离。纯化技术是本领域技术人员已知的。根据蛋白质的类型和蛋白质的特征，可以考虑不同类型的纯化技术。为了通过沉淀分离蛋白质，可以进行不受限制的步骤，如硫酸铵沉淀。蔗糖梯度离心也可以用于分离样品中不同大小的分子。尺寸排阻色谱法主要用于非变性或变性条件，这取决于是否存在已知方法来重折叠蛋白质。蛋白质也可以基于它们的电荷或疏水性进行分离。如果蛋白质被标记，也可以通过亲和层析或者固定到柱或树脂上来分离蛋白质。
[0092]
然后可以通过例如质谱来分析目的蛋白的修饰。也可以在活性测定中分析诸如酶的蛋白质。
[0093]
也可以分析过氧化物酶体中转运的蛋白质类型。出于稳定而工程化蛋白质的方法是本领域技术人员已知的。在没有限制的情况下，这可以包括连接可切割的标签以便人工改变蛋白质的ph，或者产生几个突变以便人工改变将被转运到过氧化物酶体中的蛋白质的ph。
[0094]
可以考虑的其它标签是已知转运到蛋白质中的蛋白质的标签，或其结构域。如purdue等人所述，共有序列xx(k/r)(k/r)x
(3-7)
(t/s)xx(d/e)x(seq id no:4)是过氧化物酶体蛋白质中的保守序列，其可以允许蛋白质在过氧化物酶体中的转运或稳定，其中x是任何氨基酸，并且其中x
(3-7)
代表在指定位置的任何氨基酸的3-7个氨基酸的范围。
[0095]
在本文所述的方法、细胞或组合物的一些实施方案中，与过氧化物酶体靶向序列融合的蛋白质如异源蛋白定位于细胞如真核细胞或酵母细胞中的过氧化物酶体。在一些实施方案中，与过氧化物酶体靶向序列融合的酶如修饰酶将与过氧化物酶体靶向序列融合的异源蛋白定位和/或共定位于细胞如真核细胞或酵母细胞中的过氧化物酶体。在一些实施方案中，蛋白质和/或酶与过氧化物酶体靶向信号如pts1或epts1融合。例如，在一些实施方案中，epts1是过氧化物酶体靶向序列。在seq id no:3(lgrgrrskl)和seq id no:12(ttgggaagaggtagaagatccaaattg)中提供了epts1标签和编码epts1标签的核酸序列的实例。
[0096]
各种蛋白质和酶可以通过使用过氧化物酶体靶向序列靶向过氧化物酶体。例如，分子量为1-5、5-10、10-25、25-50、50-75、75-100kda、100-200kda或200-300kda、或更高、或涵盖任何上述kda范围的值的范围的蛋白质和酶可以用过氧化物酶体靶向序列靶向过氧化物酶体。在一些实施方案中，将具有编码待靶向过氧化物酶体的蛋白质和/或酶以及编码过氧化物酶体靶向序列的序列的核酸转移到包含过氧化物酶体的细胞中，以及所述细胞翻译蛋白质和/或酶并将其转运到过氧化物酶体中。可以靶向过氧化物酶体的蛋白质和酶的另外实例包括但不限于结构蛋白、胶原、激酶、磷酸酶、羟化酶、异构酶、切割酶、荧光蛋白和激素。在一些实施方案中，待靶向的蛋白质和/或酶包括标签，如荧光标签(例如gfp、yfp或cfp)，flag标签(例如dykddddk，其中d＝天冬氨酸，y＝酪氨酸，以及k＝赖氨酸，seq id no:5)或组氨酸标签(例如his-his-his-his-his-his,seq id no:6)。这种标签可用于，但不限于，纯化和/或鉴定蛋白质和/或酶的位置。纯化技术可以包括但不限于使用标签进行亲和纯化或使用离子柱如镍柱来纯化蛋白质和/或酶。可以使用的其它标签包括钙调蛋白(krrwkknfiavsaanrfkkisssgal,seq id no:7)、ha(ypydvpdya,seq id no:8)、myc(eqkliseedl,seq id no:9)、sbp(mdekttgwrgghvveglageleqlrarlehhpqgqrep,seq id no:10)和/或strp(wshpqfek,seq id no:11)标签。
[0097]
gfp标签的实例提供在seq id no:13(mrkgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvrgegegdatngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelyk)中。一些实施方案包括编码gfp标签的核酸，如seq id no:14的核酸序列(atgcgtaaaggcgaagagctgttcactggtgtcgtccctattctggtggaactggatggtgatgtcaacggtcataagttttccgtgcgtggcgagggtgaaggtgacgcaactaatggtaaactgacgctgaagttcatctgtactactggtaaactgccggttccttggccgactctggtaacgacgctgacttatggtgttcagtgctttgctcgttatccggaccatatgaagcagcatgacttcttcaagtccgccatgccggaaggctatgtgcaggaacgcacgatttcctttaaggatgacggcacgtacaaaacgcgtgcggaagtgaaatttgaaggcgataccctggtaaaccgcattgagctgaaaggcattgactttaaagaggacggcaatatcctgggccataagctggaatacaattttaacagccacaatgtttacatcaccgccgataaacaaaaaaatggcattaaagcgaattttaaaattcgccacaacgtggaggatggcagcgtgcagctggctgatcactaccagcaaaacactccaatcggtgatggtcctgttctgctgccagacaatcactatctgagcacgcaaagcgttctgtctaaagatccgaacgagaaacgcgatcatatggttctgctggagttcgtaaccgcagcgggcatcacgcatggtatggatgaactgtacaaa)或其片段。
实施例
[0098]
下面论述的实施例旨在纯粹是本发明的示例，而不应被认为以任何方式限制本发明。实施例不旨在代表下面的实验是全部或唯一进行的实验。已经作出努力以确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，以及压力为大气压或接近大气压。实施例1：胶原变体或p4hb在多种酵母宿主中向过氧化物酶体的定位
[0099]
产生gfp-x-epts1构建体，其中包括gfp用于定位的可视化，包括epts1用于靶向过氧化物酶体，并且其中x是目的蛋白。目的蛋白的非限制性实例包括合成的胶原肽colsyn1a、colsyn2、colsyn3、colsyn4、colsyn5和colsyn6，以及蛋白质二硫化物异构酶p4hb(参见表1)。在一些实施方案中，p4hb是bantp4hb、apmip4hb、btaup4ha1、btaup4hb、btp4hb或gfp-b5p4hb-epts1、或其片段或衍生物。编码这些目的蛋白的核酸被包括在单独的构建体中。将构建体产生的具有每种目的蛋白的肽导入野生型(wt)酿酒酵母菌株的过氧化物酶体，其在细胞中可视化为荧光焦点(图3)。在缺乏过氧化物酶体导入受体(pex5δ)的菌株中，仅观察到弥散性细胞质定位。这些结果表明，在一些实施方案中，如本文所述的过氧化物酶体靶向肽可以用于将蛋白质或酶靶向细胞如酵母细胞中的过氧化物酶体。目的蛋白的其它非限制性实例和编码核苷酸序列的一些实例也显示在表1中。在一些实施方案中，目的蛋白或编码核酸由以下组成或包含以下：与seq id no:15-70中的任一个或多个50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同或由任何两个上述百分比限定的范围相同的氨基酸或核苷酸序列。一些实施方案包括可以靶向过氧化物酶体的多种目的蛋白。
[0100]
已经观察到多种胶原变体定位在多种工业酵母宿主中(图4)。全长胶原的非限制性实例包括amcol1a1、amcol1a2、btcol1a1、btcol1a2及其片段。较小胶原片段的非限制性实例包括colsyn1、colsyn2、colsyn3、colsyn4、colsyn、colsyn5和colsyn6、btcol1a1 403-11p和btcol1a1 403-0p。图4显示了gfp胶原变体在三种不同工业酵母宿主pbh001、pbh002、pbh004中的epts1依赖性荧光定位。常见的工业酵母宿主包括但不限于arxula、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、komagataella、ogataea、毕赤酵母属、酵母属或耶氏酵母属。
[0101]
观察到定位于过氧化物酶体的蛋白质大小范围为31kda(gfp-colsyn1)至195kda(btcol1a2)。因此，可以将相当大范围的蛋白质大小导入过氧化物酶体中。表1-示例性核酸/氨基酸序列
表2-表1序列的细节
实施例2：保护免于毒性化合物
[0102]
在一些实施方案中，将蛋白质和/或酶靶向过氧化物酶体通过与另一种酶或底物物理分离而将其区室化。这可以用于防止分离的蛋白质、酶和/或底物之间的相互作用或活性。例如，毒性蛋白或抑制性蛋白如sigd可以被区室化。
[0103]
在一些实施方案中使用酶的过氧化物酶体区室化以将其与其底物物理分离以防止对底物的活性。为了说明区室化活性的能力，当通过将毒性蛋白隔离在过氧化物酶体中而表达该毒性蛋白时，拯救了细胞活力。
[0104]
致病菌沙门氏菌是通过侵入肠粘膜而引起肠胃炎的常见原因。沙门氏菌分泌的致病因子之一是sigd(一种推定的肌醇磷酸酶)，当在酿酒酵母中表达时，其被证明引起严重的生长抑制。毒性与sigd n-末端结构域(sigd1-351)有关，所述sigd n-末端结构域缺乏磷酸酶结构域但影响酵母和人细胞中肌动蛋白细胞骨架的组织(doi:10.1111/j.1462-5822.2005.00568.x)。
[0105]
通过过氧化物酶体区室化去除sigd1-351进入其细胞质肌动蛋白细胞骨架底物，可以保护酿酒酵母免受sigd抑制生长效应。
[0106]
图5是说明当毒性蛋白sigd1-351被隔离在过氧化物酶体中时赋予宿主酿酒酵母
保护的实例。在诱导型gal启动子的控制下，将与sigd1-351-etps1或sigd1-351整合的菌株在ypd平板上连续稀释以抑制表达或在ypgalactose位置连续稀释以诱导表达。当被抑制时，两种菌株生长地同样好。当诱导表达时，具有过氧化物酶体定位毒素(sigd1-351-etps1)的菌株能够生长，但是细胞质表达的毒素(sigd1-351)对宿主是致死的。
[0107]
一个实例包括以下设计：使用具有诱导型gal启动子的表达盒来控制毒性sigd表达，在转化到酵母细胞中的单独表达盒中表达sigd的毒性(sigd1-351)和无毒变体(sigd1-351(118-142δ))，由表达盒产生融合蛋白gfp-x-epts1，其中x是毒性或无毒的sigd变体，以及用以下菌株背景之一转化单独的酵母细胞组：pex5(过氧化物酶体导入)和pex5δ(缺乏过氧化物酶体导入)。在该实例中，进行以下实验室技术：在葡萄糖(阻抑的)和半乳糖(诱导的)板上连续稀释细胞以显示生长缺陷，并通过gfp荧光显示定位。实施例3：酶和底物的共定位以在过氧化物酶体中进行翻译后修饰
[0108]
可以证明在过氧化物酶体中发生各种类型的翻译后修饰(ptm)。在一些实施方案中，通过过氧化物酶体屏障分离酶及其底物或蛋白质底物用于防止酶对底物的活性。因此，可以使用底物或酶的隔离。例如，这可以是保护细胞内容物免受过氧化物酶体隔离的蛋白影响的实例，反之亦然。
[0109]
在一些实施方案中，对另一种蛋白质进行翻译后修饰(ptm)的修饰酶与细胞的过氧化物酶体中的另一种蛋白质共定位。ptm的实例包括但不限于糖基化(或其它糖加成)、异构化、切割、蛋白酶切割、蛋白水解降解、羟基化、蛋白质水解、磷酸化、去磷酸化、泛素化(和泛素样修饰，如neddylation、sumoylation)、甲基化、亚硝基化、乙酰化和脂质化(包括gpi锚定、异戊二烯化、肉豆蔻酰化)。也考虑其它ptm反应。在一些实施方案中，酶、任何酶的辅因子和酶的底物共定位于细胞质和/或过氧化物酶体。
[0110]
在一些实施方案中，酶、任何酶的辅因子和酶的底物共定位于细胞质和/或过氧化物酶体。这在一些实施方案中用于证明当酶和底物共定位在同一区域时，发生修饰。因此，可以使用共定位来执行诸如ptm的修饰。
[0111]
适用于本文公开的方法和组合物中的ptm的实例包括蛋白酶切割、磷酸化、去磷酸化、羟基化、异构化、糖基化和异戊二烯化。在一些实施方案中，蛋白酶切割、磷酸化和去磷酸化中的一种或多种是优选的ptm。
[0112]
图8显示了羟化酶(bantp4h)和胶原底物(amiscol1a1或amis col1a2)在酿酒酵母中的体内共定位。bantp4h含有mruby融合标签以及胶原底物具有gfp融合标签，以通过荧光显微镜监测定位。用epts1过氧化物酶体定位信号观察到荧光焦点，并且合并的图像显示羟化酶和胶原的重叠定位。具有mruby的示例性序列可以包括，例如，seq id no:51-52。实施例4：蛋白质水解
[0113]
在一些实施方案中，tev蛋白酶用于证明肽切割可以发生在过氧化物酶体中。例如，在一些实施方案中，只有当蛋白酶和底物处于同一亚细胞区室(如细胞质或过氧化物酶体)时，才能发生切割。证明tev蛋白酶被隔离在过氧化物酶体中，并且不能切割其在细胞质中靶标的实例显示了细胞质中的其它潜在靶标也不经历tev-切割，因此被保护免受过氧化物酶体区室化的酶。在一些实施方案中，如果表达的蛋白质/酶对细胞有毒，则通过过氧化物酶体区室化将其与其细胞底物分离保护细胞免受蛋白质/酶。底物/蛋白质被隔离在过氧化物酶体中并且不能被细胞质中的tev蛋白酶切割的实例表明，底物也不会经受细胞质中
的其它酶，因此保护底物/蛋白质免受细胞的不需要的修饰，如蛋白质水解降解。因此，在一些实施方案中，选择性靶向一些蛋白质而不是其它蛋白质导致一些蛋白质的期望修饰和/或防止不需要的修饰。
[0114]
在一些实施方案中，在酿酒酵母中，tev蛋白酶和含有用于切割的tev识别位点(tevrs)的底物将由强启动子表达。与yfp或rfp的融合将通过显微镜显示定位于细胞质或过氧化物酶体。通过蛋白质印迹分析底物(yfp-tevrs-igf2-flag)的蛋白质水解。
[0115]
在一些实施方案中，可以靶向过氧化物酶体的其它修饰蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶mmp-1、mmp-2、mmp-8、mmp-13和mmp-14；n-蛋白酶adamts-2、adamts-3、adamts-14；以及c-蛋白酶bmp-1、mtls和tll-1。
[0116]
在一些实施方案中，靶向过氧化物酶体的蛋白质含有tev可切割的标签。作为实例，具有可切割标签的蛋白质的实例是btcol1a2-tev-gfp-his-epts1(seq id no:64)，其中全长牛胶原1型α2蛋白质可以通过tev蛋白酶与可用于过氧化物酶体定位、可视化和纯化的n-末端标签分离。另外的实例可以包括本文公开的任何蛋白质序列与任何标签序列、靶向序列、结构域或其片段或衍生物的组合。这种序列的实例可以包括例如seq id no:57-68。
[0117]
tev蛋白酶是来自烟草蚀纹病毒(tev)的序列特异性半胱氨酸蛋白酶。在本实施例中，为了证明在过氧化物酶体中可以实现异源酶活性，在酿酒酵母中表达tev蛋白酶，其具有n-末端epts1信号序列以引导其定位于过氧化物酶体。通过n末端rfp和c末端yfp侧接tev识别氨基酸序列glu-asn-leu-tyr-phe-gln-ser来产生经产生以用于测试tev活性的底物。在具有epts1序列(图6，图面a)或没有epts1序列(图6，图面b)的情况下表达该底物。当tev蛋白酶和底物都在过氧化物酶体中表达和共定位时，底物被完全切割，如通过蛋白质印迹上54kda全长底物条带的消失和27kda rfp切割产物的出现所证明的(图6，图面a，泳道1、2和5)。然而，当tev蛋白酶的表达被阻抑时，过氧化物酶体定位的底物保持未切割(图6，图面a，泳道3和4)。作为对照，底物在细胞质中表达，但tev蛋白酶靶向过氧化物酶体。观察到不同量的底物切割，并与驱动tev蛋白酶表达的启动子的强度直接相关，prpl18b《ptef1《pgal1(图6，图面b，泳道1、2和5)。这些结果表明tev蛋白酶在细胞质中仍然具有活性，虽然它被导入过氧化物酶体，但其依赖于高表达以接近底物。相比之下，尽管tev蛋白酶的表达水平存在差异，但当底物和蛋白酶共定位在过氧化物酶体中时，tev切割活性是完全的，表明共区室化如何也可以提高底物修饰的效率的实例。实施例5：磷酸化和去磷酸化
[0118]
在一些实施方案中，特异性激酶(如丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶)和/或磷酸酶及其底物被鉴定为共表达。例如，mek及其底物mapk1可以在核酸中或在单独的核酸中编码，以产生mek和mapk1与过氧化物酶体靶向肽的融合肽，从而将mek和mapk1靶向其中mek使mapk1磷酸化的过氧化物酶体。另外，可以加入其它的酶和底物，例如raf-1。实施例6：羟基化
[0119]
在一些实施方案中，证明了在过氧化物酶体中胶原被p4h双加氧酶的羟基化。例如，可以使用具有牛p4h亚基的设计。可选地，可以使用单一细菌p4h(炭疽杆菌(bacillus anthracis)或拟菌病毒(mimivirus))。在一些实施方案中，培养基补充有抗坏血酸和/或α-酮戊二酸和铁(ii)，并且证明如果辅因子和/或补充剂可以进入过氧化物酶体，则可以在那
里发生特定的化学修饰。在这种情况下，通过质谱分析胶原的氧化。在一些实施方案中，使用体外测定来进一步证明酶活性。
[0120]
为了证明在体内过氧化物酶体中可以实现异源羟基化活性，在酿酒酵母中共表达脯氨酰-4-羟化酶(p4h)和胶原底物。先前已经证明来自炭疽杆菌的p4h酶在体外使合成的胶原样肽羟基化(schnicker和dey,2016)，并且在细胞质(bantp4h)或过氧化物酶体(bantp4h-epts1)中表达。胶原螺旋由gxy重复组成，其中g是甘氨酸，x是任何氨基酸但通常是脯氨酸，y是任何氨基酸但通常是脯氨酸。在y位置的脯氨酸优先羟基化以获得螺旋稳定性(gorres和raines,2010)。针对该研究设计的底物是牛胶原1型α1螺旋区的99个氨基酸的片段，其含有11个y-位脯氨酸(btcol1a1 403-11p)。为了控制y位脯氨酸羟基化，将11个脯氨酸突变为丙氨酸或缬氨酸(btcol1a1 403-0p)。在n-末端gfp以及c-末端epts1过氧化物酶体定位序列的情况下表达这些底物以监测体内定位(参见图8)和纯化。
[0121]
使表达bantp4h酶和胶原底物的组合的细胞(图7，图面a)在30c下于带挡板的摇瓶中在ypd中生长至早期对数期，然后收获。细胞裂解后，将底物在gfp-trap珠粒上纯化，在10％page凝胶上运行，用考马斯蓝染色，从凝胶上切下，并送至ms bioworks用于通过lcmsms分析脯氨酸残基的氧化。
[0122]
质谱结果显示，当在过氧化物酶体中共表达时，在胶原底物上的三个位点处的bantp4h特异性氧化。在菌株pb000225、pb000254和pb000255中，btcol1a1 403-11p_epts1底物在p264位(y位脯氨酸)被氧化。btcol1a1 403-0p_epts1对照底物中的相应位置突变为丙氨酸(a264)，并且没有观察到氧化(图7，图面b)。在仔细检查p264处鉴定的修饰后，分别与菌株pb000225(一个修饰的/共38个)和pb000225(两个修饰的/共42个)中的2.6％和4.8％相比，菌株pb000254在该位置存在12.1％的氧化(四个修饰的/共33个)，其中bantp4h共定位于过氧化物酶体中。类似地，仅在菌株pb000254中观察到在两个另外的y-位置脯氨酸p300和p324处的氧化，而在其它5种菌株中没有观察到(图7，图面c)。总之，这些结果显示，当酶和底物共定位于过氧化物酶体时，胶原底物上的三个y位脯氨酸被bant-p4h特异性地羟基化。具有403-0p-epts1或403-11p-epts1的示例性序列包括例如seq id no:53-56和65-68。实施例7：胶原在酵母过氧化物酶体中的表达
[0123]
胶原蛋白经由过氧化物酶体靶向标签导入过氧化物酶体。脯氨酰羟化酶和脯氨酰异构酶使用过氧化物酶体靶向标签类似地导入过氧化物酶体。脯氨酰羟化酶与胶原在过氧化物酶体中的共孵育允许形成适当的三螺旋构象。i型异三聚体、i型α同三聚体和iii型同三聚体胶原均以所述方式产生。对于i型胶原，表达全长col1a1(pro-α1链)和col1a2(pro-α2链)以及n-和c-末端的截短物，以分离olsen等人(2001)所示的teloprotein，用于在酿酒酵母中改善col1a1(α1链)和col1a2(α2链)的表达。类似地，脯氨酰-4-羟化酶表达为全长以及pdi结构域的截短物(toman 2000)，用于改善表达和导入过氧化物酶体中。实施例8：增加过氧化物酶体的货物
[0124]
使用多种常规方案中的任一种使酵母在发酵罐中生长。过氧化物酶体的能力可以通过诱导而增加。在酿酒酵母的情况下，这可以通过使用油酸；对于毕赤酵母和汉逊酵母，这可以通过使用甲醇。期望被区室化和纯化的蛋白质用过氧化物酶体靶向标签pts1、pts2或这些标签的增强形式进行标记。发酵后，酵母细胞的质膜可以使用许多常规的裂解方法，
如弗氏压碎器或使用溶壁酶的细胞壁消化，进行裂解然后均质化。低速离心用于去除细胞核和质膜以及其它细胞碎片。可以通过其它方法如密度梯度离心从所得上清液中进一步纯化过氧化物酶体。过氧化物酶体纯化的替代方法是用亲和标签如链霉亲和素或多组氨酸肽基因标记过氧化物酶体膜蛋白以允许亲和纯化。然后裂解这些纯化的过氧化物酶体；例如，使用渗透裂解(j cell biol.2007apr 23；177(2):289
–
303；通过引用以其整体包括在本文中)。可以经由高速离心去除过氧化物酶体碎片，并收集含有期望货物蛋白的可溶级分。如果需要，可以使用亲和纯化进一步纯化该期望的蛋白质。在没有限制的情况下，货物蛋白可以用多种可用的肽或蛋白质折叠亲和标签中的任一种(诸如例如多组氨酸、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽s-转移酶)进行标记，并使用它们相应的方案进行纯化。可选地，可以使用其它纯化方法，如离子色谱法或凝胶过滤。实施例9：在酵母过氧化物酶体中翻译后修饰蛋白的表达-将各个蛋白定位于过氧化物酶体(基于epts1的靶向)
[0125]
基于大小和功能的不同类别的蛋白质被证明通过使用过氧化物酶体靶向序列定位于典型的酵母细胞中的过氧化物酶体。可以靶向的蛋白质和蛋白质类型的非限制性实例列于表3中。过氧化物酶体靶向的机制是保守的，因此该平台可以用于其它有机体，包括甲基营养型酵母，如毕赤酵母/komagataella phaffii、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)/ogataea parapolymorpha和博伊丁假丝酵母(candida boidinii)。产生了gfp-x-epts1和x-flag-epts1构建体。在构建体中，gfp用于定位的可视化，flag-epts1用于蛋白质表达，并且在gfp干扰功能的情况下，“x”代表待靶向的目的蛋白或酶。一些实施方案的一些构建体序列和细节提供在表1和表2中。表3蛋白质(x)功能大小(kda)tev修饰酶-蛋白酶52rfp-tev修饰酶-蛋白酶rfo融合以显示定位78igf-ii类似于胰岛素的蛋白质激素20.7yfp-tevrs-ifgii蛋白酶底物27gfp 26酪氨酸激酶修饰酶-磷酸化 酪氨酸激酶底物激酶/磷酸酶底物 酪氨酸磷酸酶修饰酶-去磷酸化 btaup4ha1修饰酶-羟化酶59btaup4hb修饰酶-异构酶55胶原肽 5实施例10：二硫键形成
[0126]
在一些实施方案中，修饰是二硫键形成。例如，使用其中异源蛋白和蛋白质二硫化物异构酶(pdi)共表达并靶向过氧化物酶体的设计。在这种情况下，通过质谱分析异源蛋白的二硫化物。
[0127]
为了证明在体内过氧化物酶体中二硫键的形成，表达人胰岛素、α干扰素和mapacalcine的异源基因与pdi一起共表达。通常靶向er的ogataea pdi(ogpdi)被设计为过
表达并靶向过氧化物酶体。使用来自毕赤酵母的优化密码子合成人胰岛素前体(baeshan等人,2014)、α干扰素(shi等人,2007)和mapacalcine(noubhani等人,2015)。构建体设计有三个表达盒，包括目的靶基因的表达盒、修饰酶的表达盒和选择标志物的表达盒。
[0128]
每个盒具有启动子、表达的基因(目的基因或修饰酶基因或可选择标志物基因)和终止子。目的基因和修饰酶基因被设计成分别包括荧光标签gfp和mruby作为翻译融合物。通过在3’端引入epts1序列，目的基因和修饰酶都靶向过氧化物酶体。共表达mapacalcine和ogpdi的完整构建体的序列示出在seq id no:73中。另外的盒包括人胰岛素前体(seq id no:74)、α干扰素(seq id no:75)、mapacalcine(seq id no:76)、ogpdi(seq id no:77)的核酸序列。
[0129]
最初筛选表达这些盒的转基因的荧光标志物以确认靶向过氧化物酶体。通过质谱分析从转基因菌株纯化的目的异源蛋白的二硫化物形成。实施例11：磷酸化
[0130]
在一些实施方案中，修饰是磷酸化。例如，人β-酪蛋白ii(greenberg等人，1984；thurmond等人，1997)和特异性蛋白激酶，即人酪蛋白激酶(voss等人，1991)被鉴定用于共表达，所述人酪蛋白激酶使酪蛋白上的特异性丝氨酸和苏氨酸氨基酸磷酸化。人β-酪蛋白ii的密码子优化序列示出在seq id no:78中，酪蛋白激酶ii亚基β的密码子优化序列示出在seq id no:79中。
[0131]
用于转化的构建体是使用用于证明二硫键形成的相同主链产生的(如实施例10中所示)。酪蛋白用作目的基因，以及酪蛋白激酶用作修饰酶。磷酸化是过氧化物酶体中调节的主要形式，并且在过氧化物酶体中表达的靶标酪蛋白甚至可能不需要酪蛋白激酶的共表达。一旦产生，纯化重组酪蛋白并通过质谱分析苏氨酸和丝氨酸的磷酸化形式。在一些实施方案中，在体外测定磷酸化活性。实施例12：乙酰化
[0132]
在一些实施方案中，所述修饰是n-末端乙酰化。例如，鸡蛋卵清蛋白(ito&matsudomi,2005)和促进n-末端甘氨酸乙酰化的特异性乙酰化复合物natb(rovere等人，2008)被鉴定用于共表达。卵清蛋白的密码子优化序列示出在seq id no:80中，以及对应于酵母natb复合物(naa20和naa25)的两个基因分别示出在seq id no:81和82中。
[0133]
用于转化的构建体是使用用于证明二硫键形成的相同主链产生的(如实施例10中所述)。卵清蛋白用作目的基因，以及natb复合物的两个基因构成修饰酶。酵母中的许多蛋白质在n-末端被乙酰化，并且在过氧化物酶体中表达的靶标卵清蛋白即使在没有酪蛋白激酶的情况下也可以显示n-末端乙酰化。一旦产生，纯化重组酪蛋白并通过质谱分析n-末端甘氨酸的乙酰化。
[0134]
关于本文中复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，本文可以清楚地阐述各种单数/复数排列。
[0135]
本领域技术人员将理解，通常在本文中使用的术语，尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域的技术人员还将理解，如果打算引用
特定数量的权利要求叙述，在权利要求中明确地叙述这种意图，并且在没有这种叙述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个/至少一种”和“一个或多个/一种或多种”来引入权利要求叙述。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”的权利要求叙述的引入将包含这种引入的权利要求叙述的任何特定权利要求限定为仅包含一个这种叙述的实施方案，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/至少一种”和不定冠词如“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”时(例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被解释为意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”)亦如此；对于用于引入权利要求叙述的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确地叙述了所引入的权利要求叙述的具体数目，本领域技术人员也将认识到，这种叙述应被解释为意指至少叙述的数目(例如，没有其它修饰词的“两个陈述”的简单陈述意指至少两个陈述，或者两个或更多个陈述)。此外，在其中使用类似于“a、b和c中的至少一个/至少一种等”的惯例那些情况下，通常这种结构旨在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有a、b和c中的至少一个/种的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起的系统等)。在其中使用类似于“a、b或c中的至少一个/至少一种等”的惯例那些情况下，通常这种结构旨在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有a、b或c中的至少一个/种的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起的系统等)。本领域技术人员将进一步理解，无论在说明书、权利要求或附图中，呈现两个或更多个替代术语的几乎任何反意连接词和/或短语都应该被理解为考虑包括这些术语之一、任一术语、或这两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0136]
此外，在本公开内容的特征或方面是根据马库什组来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开内容也由此根据马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述。
[0137]
一个方面的实施方案的任何特征可应用于本文所确定的所有方面和实施方案。此外，一个方面的实施方案的任何特征可以以任何方式与本文所述的其它实施方案部分地或全部地各自组合，例如，一个、两个或三个或更多个实施方案可以全部或部分地组合。此外，可以使一个方面的实施方案的任何特征对于其它方面或实施方案是可选的。