一种全人源抗人红细胞RhD全分子IgG及其制备方法和应用与流程

一种全人源抗人红细胞rhd全分子igg及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于免疫学领域，具体涉及一种全人源抗人红细胞rhd全分子igg及其制备方法和应用。


背景技术：

2.红细胞表面具有抗原性的分子称为红细胞血型抗原，红细胞血型抗原及其相应的体内抗体是临床输血，器官移植，新生儿溶血等临床治疗和检测的重要指标，也是血型相关疾病研究的基础。目前根据国际输血协会对人类红细胞表面抗原的命名原则，目前发现并证实有368个红细胞血型抗原，可以归类为39个血型系统，5个血型集合和2个血型系列(低频抗原700系列：17个抗原；高频抗原90
·
系列：7个抗原)。在39个血型系统中，最主要的血型系统就是abo血型系统，其编码基因位于9号染色体，其他血型系统还包括mns、p1pk、rh、lu、kel、le、fy、jk、di等血型系统。其中rh血型系统最为复杂，编码基因位于1号染色体，因为基因的重组和突变产生很多不同的抗原，在常见的d、c、c、e、e抗原之外，还表达有很多罕见抗原，例如hrb、bea、evans等抗原，而在其中rhd的抗原性最强。
3.由于首次发现rh血型系统抗原是在恒河猴(rhesus monkeys)红细胞上，因此以其首字母rh命名。其主要抗原d，c、c、e、e是由rhd基因和rhce基因编码表达的。rhd基因表达在1号染色体1p
34.3-36.1
,全长57295bp。rhd基因和rhce基因串联排列，方向相反，两基因仅相隔30kb，rhd蛋白有417个氨基酸，ⅳ型跨膜蛋白，共跨膜12次，具有6个胞外区结构。
4.抗rhd的抗体极少在自然状态下产生，一般是由于rhd阴性个体妊娠rhd阳性血婴儿，或者因误输rhd阳性血等明确接触的情况下产生。个体产生rhd抗体后，会导致血管内溶血及血管外溶血，因红细胞的破坏，产生新生儿溶血性疾病(haemolytic disease of the fetus and newborn,hdfn)，可能导致胎儿的溶血，贫血，高胆红素血症，甚至死亡。为避免hdfn及迟发型溶血性输血反应的发生，预防性使用rhd抗体，是临床必要的治疗手段。同时在特发性血小板减少性紫癜疾病中，rhd抗体也具有治疗性作用，是其治疗的联合用药的一种。
5.目前用于临床检验用抗人rhd蛋白抗体多为恒河猴杂交瘤或多克隆抗体。同时，针对新生儿溶血性疾病、特发性血小板减少性紫癜(itp)、以及rhd(-)个体输血错误的治疗中，多需要使用抗人rhd蛋白抗体。为避免种属差异造成的排斥反应，临床应用过程中多要求相关治疗性抗体为人源性。而目前，国内外使用的针对人rhd蛋白的治疗性抗体多为分离、纯化自rhd蛋白阳性表达的捐献者外周血，数量有限，无法工业化生产。
6.现有的抗体开发技术制备抗rhd抗体遇到很多问题和缺陷。例如通过重复免疫rhd抗原阴性红细胞而产生高滴度血清来制备鼠源、兔源多克隆抗体，存在不同个体间血源传播病毒或其他病原体风险，并且不同批次之间的效价不稳定，质控成本较高。而经典的杂交瘤单克隆抗体制备的方法，需要免疫原性较高的抗原免疫小鼠。rhd蛋白不仅分子量大，空间结构复杂，而且天然的rhd蛋白存在大量的糖基化位点修饰，因此，采用基因合成和人工表达的方式制备重组人rhd蛋白非常困难。因此，小鼠难以产生有效免疫应答。若采用噬菌
体表面展示抗体库技术，需要大量的rhd阳性b细胞样本用于噬菌体建库，同时需要反复多次的富集、筛选、扩增，才能筛选到较合适的抗体，工艺繁琐，成本昂贵，其次噬菌体筛选获得抗体的轻、重链可变区是随机配对，抗体的亲和力较差，后期需要利用抗体工程技术进行亲和力成熟改造，而导致抗体容易具有较强抗原性，影响临床治疗应用。单细胞转录组测序技术也被应用到单克隆抗体开发，可以快速获得高通量的b细胞转录组遗传信息，包括配对的抗体可变区基因序列。但是针对人红细胞表面抗原rhd蛋白，其应用受到限制。红细胞表面抗原系统复杂，常见的abo抗原系统与rhd抗原系统共表达，因此，即无法通过细胞分选获得可分泌rhd抗体的b细胞，也无法对rhd抗原阳性的红细胞进行测序(红细胞不含转录组遗传信息)。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种具有特异性识别人红细胞rhd抗原的全人源全分子抗体及其制备方法和应用，属于生物制药领域。
8.本发明公开了一种具有特异性识别人红细胞rhd抗原的全人源全分子抗体，该抗体轻链可变区的核酸序列为seq id no.1所示，抗体重链可变区的核酸序列为seq id no.2所示；抗体轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.3所示，抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.4所示；抗体轻链全长核酸序列(含恒定区)为seq id no.5，氨基酸序列为seq id no.7所示；抗体重链全长核酸序列(含恒定区)为seq id no.6，氨基酸序列为seq idno.8所示；抗体轻链抗原互补区cdr的核酸序列依次为seq id no.9，seq id no.10，seqid no.11所示；氨基酸序列依次为seq id no.15，seq id no.16，seq id no.17所示；抗体重链抗原互补区cdr的核酸序列依次为seq id no.12，seq id no.13，seq id no.14所示；氨基酸序列依次为seq id no.18，seq id no.19，seq id no.20所示。
9.本发明公开了一种具有特异性识别人红细胞rhd抗原的全人源全分子抗体的制备方法。该方法包括：招募rhd抗体检测为阳性的捐献者获取外周血，并分离pbmc；分选获得特异性b细胞；利用表型差异的红细胞筛选及富集可特异性表达抗人红细胞rhd抗原的b细胞；通过单b细胞bcr建库pcr测序及生物信息分析，获得配对的全人源抗rhd抗体轻、重链可变区基因序列；采用基因工程抗体技术，在真核细胞中表达全人源抗rhd全分子抗体。
10.本发明还公开了含有编码所述的全人源抗人红细胞rhd全分子igg的dna分子的表达载体，以及包含所述表达载体的细胞。
11.一种制备所述全人源抗人红细胞rhd全分子igg的方法，包括培养上述包含所述表达载体的细胞，及从细胞培养物回收所述全人源抗人红细胞rhd全分子igg的步骤。
12.一种组合物，包含本发明所述的全人源抗人红细胞rhd全分子igg或抗原结合片段和药学上可接受的载剂。
13.一种治疗对象的以红细胞rhd抗原暴露成为特征的病理病况的方法，包括向所述对象施用有效量的述的组合物。
14.所述的全人源抗人红细胞rhd全分子抗体或其抗原结合片段，其与治疗剂缀合。
15.所述的全人源抗人红细胞rhd全分子抗体或其抗原结合片段，其与标记缀合。其中所述标记选自由以下组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
16.本发明所述的全人源抗人红细胞rhd全分子igg或其抗原结合片段在检测来自人
外周血的样品中的红细胞rhd蛋白的应用。
17.一种检测来自人外周血的样品中的红细胞rhd蛋白的方法，所述方法是通过使所述的全人源抗人红细胞rhd全分子抗体或其抗原结合片段与所述样品接触以及检测结合至所述红细胞rhd蛋白的所述全人源抗人红细胞rhd全分子抗体来进行。其中所述全人源抗人红细胞rhd全分子抗体或其抗原结合片段被用于红细胞凝集分析中或elisa分析中。
18.本发明所述的全人源抗人红细胞rhd全分子igg在制备用于预防新生儿溶血性疾病、治疗特发性血小板减少性紫癜(itp)或防止在错误地将rhd( )血输入至rhd(-)个体后对恒河猴d抗原的致敏作用的药物中的应用。
19.上述方法的优势和创新性在于，所制备的抗rhd抗体为全人源，临床治疗使用中不会产生种属特异性造成的排斥反应，符合临床用药安全性的要求，避免传统鼠源抗体人源化的工艺开发流程。同时，该方法制备、筛选获得的抗体基因序列中，抗体可变区重、轻链属于天然配对，具有较高的亲和力和稳定性，与噬菌体展示技术相比，不需要抗体的亲和力成熟的开发步骤。
20.本发明公开了一种具有特异性识别人红细胞rhd抗原的全人源全分子抗体在临床诊断和临床治疗中的应用的应用。该全人源抗人红细胞rhd全分子抗体可有效识别人体红细胞表面rhd抗原，可用于人红细胞rhd抗原相关的红细胞凝集分析或elisa分析；可用于预防新生儿溶血性疾病、治疗特发性血小板减少性紫癜(itp)或防止在错误地将rhd( )血输入至rhd(-)个体后对恒河猴d抗原的致敏作用。
附图说明
21.图1是b细胞磁珠分选富集流式检测图。其中：a为pbmc，b为淋巴细胞群中cd19 b细胞群占比9.57％；c为磁珠富集后的b细胞群，d为cd19 b细胞群占比83.3％。
22.图2是rhd抗体阳性b细胞流式分选图。其中：a为淋巴细胞群，b为cd19 /igg b细胞群，占比3.64％，c为和红细胞结合的cd19 /igg b细胞群，igg /cd19 /cd235a/b rbc/b细胞群为0，83％。
23.图3是聚类分析筛选图。对抗体序列聚类分析，共分为五个cluster，每一cluster中选取一例作为候选抗体基因序列，分别为g9，g11，d7，d3，e。
24.图4是抗体表达纯化uv图。可见蛋白纯化uv图，前期抗体蛋白吸附于protein a柱上，后期洗脱抗体见高尖吸收峰。
25.图5是抗体表达纯化上清蛋白电泳染色图其中：a为考蓝染色，b为银染)。input泳道见抗体重轻链条带以及其他无关蛋白条带，flow through泳道仅见无关蛋白条带，在elution泳道可见明显的抗体重轻链条带,无其他蛋白条带，抗体蛋白被纯化富集。
26.图6是抗体针对红细胞抗原特异性检测。克隆号为d7抗体的可以特异性凝集rhd阳性红细胞，和rhd阴性红细胞不发生凝集现象。
27.图7是抗体致红细胞凝集效价检测图。结果提示上述制备全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)(0.1mg/ml)凝集rhd阳性红细胞的效价，强阳性达到1：512以上，弱阳性达到1：2048。
28.图8是抗体免疫共沉淀蛋白电泳银染图。采用银染法检测目标蛋白的表达，在40kda可见一特异性蛋白条带，经质谱检测，可确认为人rhd蛋白。
29.图9抗体介导红细胞裂解检测。rhd阳性红细胞组od值相对阴性对照组明显升高(p
《0.05)，提示全人源全分子抗体(d7)识别结合红细胞后，促进了单核细胞对红细胞的破坏，上清中血红蛋白含量高，od值增大。
30.图10是抗体介导红细胞裂解的流式检测。a为未致敏rhd阳性红细胞和单核细胞孵育的结果图；b为全人源全分子抗体(d7)和rhd阴性红细胞孵育后，和单核细胞再孵育的结果图；c图为全人源全分子抗体(d7)和rhd阳性红细胞孵育后，和单核细胞再孵育的结果图，结果提示单核细胞和全人源全分子抗体(d7)结合的rhd阳性红细胞孵育后，红细胞比例比对照组明显增多。
31.图11是全人源抗rhd抗体保护性实验检测。说明在红细胞输注9h后，可见实验组小鼠体内人红细胞低于对照组(p《0.05)，全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)可介导o型rhd 红细胞的清除。
具体实施方式
32.实施例1：可分泌rhd抗体b细胞的富集
33.实施例2：红细胞表型差异筛选
34.实施例3：单b细胞bcr区建库pcr测序
35.实施例4：全人源rhd抗体基因筛选及分析
36.实施例5：全人源rhd抗体的表达及纯化
37.实施例6：全人源抗rhd抗体特性分析
38.实施例7：全人源抗rhd抗体adcc作用检测
39.实施例8：全人源抗rhd抗体保护性实验检测
40.实施例1：可分泌rhd抗体b细胞的富集
41.招募rhd抗体检测为阳性的捐献者(血清抗体效价》1:128)，获取外周血，并进行血型鉴定。
42.提取pbmc：
43.1. 37℃预热1640培养基和淋巴细胞分离液；
44.2.取15ml淋巴细胞分离液于50ml离心管中；
45.3.提取rhd抗体阳性外周血15ml至新的50ml离心管中，同等体积的1640培养基稀释，颠倒混匀；
46.4.将稀释后的外周血(1:1稀释)加入到放有淋巴细胞分离液的离心管中(稀释后的外周血：淋巴细胞分离液＝2:1)，用移液管移取时应缓慢轻柔，避免破坏液体界面；
47.5. 800g/min离心，20min，设置离心机启动与刹车加速度为1；
48.6.匀速吸除离心管上层液体，当距白膜层2-3cm时停止吸取；
49.7.吸取白膜层细胞，转移至新的50ml离心管中，使用1640培养基补充体积至45ml；
50.8.上下颠倒混匀清洗细胞，300g/min离心5min；
51.9.弃上清后，使用1640培养基重悬，500g/min离心处理，5min；离心5min；
52.10.使用rpmi1640 10％fbs 1％p/s完全培养基重悬细胞沉淀，并计算细胞数量，分装冻存于液氮。
53.b细胞富集：
54.1.取分离获得的pbmc细胞(至少107细胞)，重悬于40ul pbs bsa缓冲液中；
55.2.根据b cell isolation kit(miltenyi)操作步骤，将b细胞和生物素标记混合抗体各10ul在2～8℃条件下，孵育10min；
56.3.在混合物中加入30ul缓冲液，20ul抗生物素微磁珠，2～8℃条件下孵育10min；
57.4.将磁力柱放在合适的macs分离器磁场中，使用缓冲液预冲洗磁力柱；
58.5.将pbmc细胞悬液加入到磁力柱中，收集上样后的细胞流穿液；
59.6.使用细胞计数仪进行细胞计数；
60.7.孵育抗人cd19-apc/cyanine7(biogend)后，用流式细胞仪检测(图1)。
61.图1流式结果检测，a为pbmc，b为淋巴细胞群中cd19

b细胞群占比9.57％；c为磁珠富集后的b细胞群，d为cd19

b细胞群占比83.3％。
62.实施例2：红细胞表型差异筛选
63.1.在磁珠富集的总b细胞中加入1ml细胞培养液重悬；
64.2.取a，b，o型rhd阴性洗涤红细胞各三份进行等体积混和，用生理盐水洗涤三次，再改用细胞培养基洗涤一次；
65.3.把1ml混合红细胞加入到总b细胞悬液中，充分混匀后，37℃孵育1h，中间每15min轻柔震荡混匀；
66.4.取5ml淋巴细胞分离液于15ml离心管中；将孵育后的细胞混合物缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层(2ml样本，可加入等体积培养基)；
67.5.移取完毕后800g/min，离心20min；
68.6.收取上层未结合红细胞的b细胞至新的离心管中，加入细胞培养液洗涤一次；
69.7.收集o型rhd阳性洗涤红细胞3份，用生理盐水洗涤三次，再改用细胞培养基洗涤一次；
70.8.将上一步获得的b细胞用1ml细胞培养基重悬，加入o型rhd阳性洗涤红细胞1ml，充分混匀后，37℃孵育1小时，中间每5min轻柔震荡混匀；
71.9.细胞混合物中分别加入抗人cd19-apc/cyanine7(biogend)，抗人igg-brilliant violent 421(biolegend)，抗人cd235a/b-pe(biogend)流式抗体孵育，洗涤后通过流式细胞仪检测；
72.10.使用流式细胞仪先筛选cd19

/igg

的b细胞，在此b细胞群中筛选cd235

的b细胞，即结合红细胞的b细胞(图2)；
73.11.将筛选标记的igg

/cd19

/cd235a/b

的细胞按照1个/孔，分选至96孔细胞培养板中。
74.图2a为淋巴细胞群，b为cd19

/igg

b细胞群，占比3.64％，c为结合红细胞的b细胞群，igg

/cd19

/cd235a/b

rbc/b细胞群为0，83％。
75.实施例3：单b细胞bcr区建库pcr测序和筛选
76.1.在96孔板中加入细胞裂解液，oligo-dt捕获mrna；
77.2.通过mrna反转录获得一链cdna全长，在template-switch oligo上引入index，96孔板上的每一行，共用一个index序列。
78.3.配制pcr master mix加入96孔板中，通过oligo-dt以及template switch oligo上的universial pcr primer进行cdna富集。
79.4.cdna质量检测，将96孔板上的每一列cdna富集产物进行pooling，纯化。通过
qubit检测cdna浓度，毛细管电泳检测cdna的片段分布。
80.5.bcr富集，通过半巢式pcr，在bcr重链、轻链的恒定区(c区)分别设计两条pcr primer。
81.6.通过两轮特异性富集(半巢式pcr)增加bcr富集产物的特异性。
82.7.扩增建库，根据bcr第二轮特异性富集引物上添加的pcr handle序列，设计primer用于pcr扩增建库。
83.8.每个文库根据index拆分后，独立进行bcr组装后通过可变区聚类分析，通过筛选和排除冗余数据，获得抗体有效的重轻链可变区核酸序列。
84.实施例4：全人源rhd抗体基因筛选及分析
85.1.测序获得有效配对的抗体重轻链可变区核酸序列78对，去除缺损和重复，相似序列，并翻译为氨基酸序列；
86.2.对缺损序列剔除，拼接高相似序列，获得42对抗体重轻链序列；
87.3.通过discovery studio分子模拟rhd抗原和42个抗体可变区的3d结构，评估抗原抗体对接的能量；
88.4.对抗体序列聚类分析，共分为五个cluster，每一cluster中选取一例作为候选抗体基因序列，分别为g9，g11，d7，d3，e5(图3)，候选抗体g9，g11，d7，d3，e5的氨基酸序列如下：
89.[0090][0091]
实施例5：全人源rhd抗体的表达及纯化
[0092]
1.上述5对抗体(g9，g11，d7，d3，e5)可变区序列核酸合成，分别重组到含有人抗体恒定区序列的真核表达载体pfuse-chig-hg1、pfuse-clig-hl、pfuse-clig-hk上(载体质粒均购自美国invitrogen公司)；
[0093]
2.表达载体转化感受态细菌，摇菌扩增，提取表达载体的质粒；
[0094]
3.上述质粒测量浓度后，分装冻存；
[0095]
4.抗体表达质粒转染293f细胞表达体系：
[0096]
1)在8％co2，37℃，120g/min条件下摇床培养箱培养293freestyle细胞，细胞活性达到98％以上；
[0097]
2)给293freestyle细胞更换新鲜培养基，培养体系为30ml，细胞浓度为1
×
106/ml；
[0098]
3)将20ug的重链质粒和20ug的轻链质粒取出，用opti-mem培养基稀释到600ul，为a液；
no.2，其中轻链可变区中cdr1为seq id no.9，cdr2为seq id no.10，cdr3为seq id no.11；重链可变区中cdr1为seq id no.12，cdr2为seq id no.13，cdr3为seq id no.14。
[0121]
抗体效价检测
[0122]
1.吸取pbs 100ul加入到u型96孔板中，共加入24孔；
[0123]
2.吸取全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)200ul(0.1mg/ml)加入到上述u型板中空白孔，
[0124]
3.吸取其中100ul加入到含pbs孔中；
[0125]
4.从第一孔中吸取100ul抗体稀释液加入到含pbs第二孔中混合；
[0126]
5.依此类推，抗体倍比稀释到24孔中；
[0127]
6.吸取标准rhd阳性红细胞(sanquin)100ul加入到上述u型板孔中，37℃，孵育30min；
[0128]
9.吸取50ul上述红细胞抗体混合物，加入到抗人免疫球蛋白抗体凝胶血型卡中，血型卡在37℃，孵育10min；
[0129]
10.血型卡放置于卡式离心机中离心900g/min，离心2min,1200g/min，离心3min；
[0130]
11.观察血型卡凝集情况(图7b)；
[0131]
12.u型板中加入抗人二抗50ul(1:5000稀释)，37℃，孵育30min
[0132]
13.u型板在灯下观察红细胞凝集情况(图7)。
[0133]
图7a为u型板红细胞凝集结果，图7b为抗人球蛋白微柱微柱凝胶结果，结果提示上述制备全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)(0.1mg/ml)凝集rhd阳性红细胞的效价，强阳性达到1：512以上，弱阳性达到1：2048。
[0134]
抗体结合蛋白分析
[0135]
1.把上述制备抗体和protein a磁珠4℃孵育过夜；
[0136]
2.生理盐水洗涤rhd阳性红细胞和rhd阴性红细胞；
[0137]
3.ack裂解液裂解洗涤红细胞，获得裂解红细胞膜；
[0138]
4.蛋白裂解液ripa(beyotime)裂解红细胞膜蛋白；
[0139]
5.把protein a磁珠-抗体复合物与rhd阳性红细胞和rhd阴性红细胞膜蛋白分别混合，4摄氏度孵育1小时；
[0140]
6.在磁力架上吸附protein a磁珠-抗体-蛋白复合物，pbs洗涤三次；
[0141]
7. 98℃加热上述复合物，于磁力架上去除磁珠，获得抗体-蛋白复合物；
[0142]
8.复合物进行蛋白电泳；
[0143]
9.采用银染法检测目标蛋白的表达(图8)；
[0144]
10.在实验组泳道中，相对对照组，在40kda可见一蛋白条带，切胶回收并进行蛋白质谱分析；
[0145]
质谱分析结果显示，实验组中可检测到全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)结合的特异性rhd抗原的蛋白胞外区多肽片段(ylpgccnr，fphlavgf，yfddqvfwk)，相关序列与ncbi的基因数据库，gene id:6007，rhd rh blood group d antigen[homo sapiens(human)]的胞外区氨基酸序列一致。
[0146]
实施例7：全人源抗rhd抗体adcc作用检测
[0147]
1.单核细胞thp-1以2
×
106个/ml的细胞浓度，每孔100ul加入到96孔板，于培养箱
培养过夜，使得细胞半贴壁并活化；
[0148]
2. 200ul 5％的rhd阳性rbc和200ul的上述制备抗体(0.1mg/ml)进行预敏化，即在37℃孵育1h，
[0149]
3.对照组用rhd阴性红细胞和全人源全分子抗体(d7)进行孵育；
[0150]
4.取50ul浓度为5％上述致敏红细胞或对照红细胞加入到thp-1培养板中进行培养；
[0151]
5. 24小时后吸取细胞上清，加入luminal显色液检测上清中血红蛋白含量。
[0152]
6.用酶标仪检测细胞上清od值(图9)；
[0153]
7.采用单核细胞thp-1分孔培养，每孔106个细胞；
[0154]
8.培养过夜使得单核细胞生长稳定，部分细胞半贴壁并活化；
[0155]
9.分别把致敏和未致敏红细胞加入到单核细胞培养孔中，(每孔0.5ul的红细胞压积)进行培养；
[0156]
10. 24小时后，洗涤培养上清中多余红细胞；
[0157]
11.单核细胞，吞噬红细胞单核细胞及结合红细胞单核细胞均通过淋巴细胞分离液分离去除未结合红细胞；
[0158]
12.上层单核细胞洗涤后，加入红细胞标记物cd235a/b-pe抗体和人源igg-bv421抗体，常温避光孵育20min；
[0159]
13.用pbs洗涤单核细胞，流式细胞仪检测(图10)。
[0160]
图9提示rhd阳性红细胞组od值相对阴性对照组明显升高，提示全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)识别结合红细胞后，促进了单核细胞对红细胞的破坏，上清中血红蛋白含量高，od值增大；图10a为未致敏rhd阳性红细胞和单核细胞孵育的结果图；b为全人源全分子抗体(d7)和rhd阴性红细胞孵育后，和单核细胞再孵育的结果图；c图为全人源全分子抗体(d7)和rhd阳性红细胞孵育后，和单核细胞再孵育的结果图，提示单核细胞和全人源全分子抗体(d7)结合的rhd阳性红细胞孵育后，红细胞比例比对照组明显增多，说明本研究抗体对单核细胞识别吞噬红细胞具有促进作用。
[0161]
实施例8：全人源抗rhd抗体保护性实验检测
[0162]
1.饲养nod-scid小鼠，收取其尾静脉血，12000g/min，离心10min；
[0163]
2.离心后分层，吸取上层血清；
[0164]
3.通过elisa检测试剂盒，检测其血清中igg浓度，
[0165]
4.剔除浓度》10ng/ul的小鼠；
[0166]
5.通过腹腔注射10mg igg和5ug全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)，对照组仅注射10mg人重组igg；
[0167]
6. 24小时后通过尾静脉注射o型rhd 红细胞5ul及o型rhd-红细胞35ul；
[0168]
7.在尾静脉注射红细胞后4h和9h，通过尾静脉取血；
[0169]
8.获得血液中红细胞，生理盐水反复洗涤三次，获得洗涤红细胞，
[0170]
9.红细胞孵育抗人cd235-pe(biogend)流式抗体；
[0171]
10.用流式细胞仪检测小鼠体内残余人红细胞的比例，结果见图11。
[0172]
图11说明在红细胞输注9h后，可见实验组小鼠体内人红细胞低于对照组(p《0.05)，全人源抗人红细胞rhd抗体(d7)可介导o型rhd 红细胞的清除。