一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒及检测方法与流程

1.本技术属于生物信息检测技术领域，更具体地说，是涉及一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.鸭甲肝病毒（duck hepatitis a virus, dhav）是小 rna 病毒科、禽肝病毒属成员，有三个基因型：dhav-1、dhav-2、dhav-3，dhav基因组为单股正链rna，dhav-1 和 dhav-3 具有高度同源性，主要感染 20日龄以内雏鸭，并引起肝脏病变导致雏鸭死亡，且在中国大陆广泛流行，常呈现混合感染。成年鸭不发病，但能持续排毒，而近年来该病毒出现新的致病型（或亚型）dhav-3 的也日益流行，给临床诊断及防控带来较大困难，严重影响我国水禽业的健康发展。
3.鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis, dvh）是一种对雏鸭造成急性、高度接触性的传染病，病原除了鸭甲肝病毒（duck hepatitisavirus,dhav）外，还包括鸭星状病毒（duck astrovirus, dastv）。现有研究表明鸭群中存在 4 种鸭星状病毒（dastv），即鸭星状病毒 1 型（dastv-1）、dastv-2、dastv-3 和 dastv-4，其中 dastv-3 是近年来在我国鸭群中新发现的感染率和发病率均较高的星状病毒，流行的地区越来越广。
4.鸭副黏病毒病（鸭源新城疫）是由鸭副黏病毒（鸭源新城疫病毒）引起的一种急性败血性传染病。该病以腹泻和神经症状，腺胃黏膜局灶性出血或溃疡，肠道黏膜出血及胰腺或脾脏有白色坏死点为主要特征。鸭发病日龄多集中在 5-8 周龄，发病率和死亡率分别可达 20%-60%和 10%-15%，个别鸭群两者均高达 90%以上。一般认为副黏病毒主要通过病禽的胴体、内脏、排泄物或分泌物以及污染的饲料、水源、草地、用具等经消化道、呼吸道或眼结膜进行水平传播。
5.现阶段对鸭源病原体主要通过临床症状、分离培养及免疫检测等常规手段进行诊断及病原体排查。分离培养耗时耗力，需要严格的实验室环境、通常需要3天才能确诊；而免疫检测灵敏度低，且存在“窗口期”，感染后3-7天才能检测出相应的抗原或抗体。


技术实现要素：

6.本发明就是为了解决上述背景技术的不足，提供了一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒及检测方法，所述试剂盒内包含4种常见的鸭源病原体检测，为鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒，通过四重荧光pcr反应，一次反应能够覆盖四种病原体检测并将其准确区分。
7.为此，本发明提供了一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒，包含反应试剂，所述反应试剂包括鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物及探针、鸭星状病毒特异性引物及探针、鸭副黏病毒特异性引物及探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂，鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒特异性引物均包括上游引物和下游引物，鸭甲型肝炎1型上游引物序列如seqid no:1所示，鸭甲型肝炎
1型下游引物序列如seqid no:2所示，鸭甲型肝炎1型探针序列如seqid no:3所示；鸭甲型肝炎3型上游引物序列如seqid no:4所示，鸭甲型肝炎3型下游引物序列如seqid no:5所示，鸭甲型肝炎3型探针序列如seqid no:6所示；鸭星状病毒上游引物序列如seqid no:7所示；鸭星状病毒下游引物序列如seqid no:8所示，鸭星状病毒探针序列如seqid no:9所示；鸭副黏病毒上游引物序列如seqid no:10所示，鸭副黏病毒下游引物序列如seqid no:11所示，鸭副黏病毒探针序列如seqid no:12所示。
8.优选的，鸭甲型肝炎病毒1型探针、鸭甲型肝炎病毒3探针、鸭星状病毒探针、鸭副黏病毒探针的5'端包括 fam、hex、rox或cy5 的荧光报告基团，3'端包括 bhq1、bhq2 的荧光淬灭基团。
9.优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品包含鸭甲型肝炎病毒1型质粒、鸭甲型肝炎病毒3型质粒、鸭星状病毒质粒、鸭副黏病毒质粒及冻干保护剂；所述阴性对照品包含te水。
10.优选的，鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒的上下游引物浓度均为600nmol/l，鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒的探针浓度均为150nmol/l。
11.优选的，所述缓冲液包含30mmol/l ph为8.8的tris，120mmol/l kcl和1%dmso、300μmol/l dntps和3.5mmol/l mgcl2。
12.优选的，所述酶混合液为5uhs-taq酶和2.5u m-mlv酶。
13.优选的，冻干保护剂为5%甘油，2.5%蔗糖和1%甘氨酸 的混合物。
14.优选的，所述反应试剂和阳性对照品均为冻干粉状试剂。
15.同时，本发明提供了一种检测多种常见鸭源病毒的检测方法，具体步骤如下：s1.对待测样本进行核酸提取；s2.将鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物及探针、鸭星状病毒特异性引物及探针、鸭副黏病毒特异性引物及探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂混合，-20℃预冻6小时，真空干燥，2-8℃避光保存；s3.以鸭甲型肝炎病毒1型质粒、鸭甲型肝炎病毒3型质粒、鸭星状病毒质粒、鸭副黏病毒质粒及冻干保护剂作为阳性对照品，-20℃预冻6小时，真空干燥，2-8℃避光保存，以te水作为阴性对照品；s4.分别使用鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物及探针、鸭星状病毒特异性引物及探针、鸭副黏病毒特异性引物及探针进行多重荧光定量pcr检测；s5.通过收集的荧光曲线和ct值判定结果；所述检测多种常见鸭源病毒的检测方法不用于疾病诊断或治疗。
16.优选的，pcr扩增条件为：50℃逆转录 20min，93℃预变性 2min； 93℃ 变性10s，55℃检测信号35s，循环40次。
17.本发明的有益效果为：（1）本发明首次建立鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒的多重荧光pcr检测方法，本发明中的试剂盒为单管多重实时荧光定量rt-pcr检测方法，可一次实现四个靶标基因的检测，从而直接实现同时检测甲型肝炎病毒1型、鸭甲型
肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒，降低检测成本，极大缩短了检测时间，提高用药准确率，降低病死率，减少养殖户经济损失。
[0018] (2)本发明的检测试剂盒配合多重荧光pcr法检测，只需一次扩增即可得到检测结果，免去后续测序或电泳检测步骤，减少实验步骤并降低检测成本，能够在短时间内区分致病性禽流感分型，提高检测效率，具有极高的特异性和灵敏度，检测灵敏度可以达到100copies/ml。
[0019]
（3）本发明中的试剂盒为冻干粉试剂盒，相较于普通液体试剂盒于-20℃保存而言，本发明的冻干粉试剂盒更加稳定，可在常温下长时间保存，具有良好常温保存稳定性。
附图说明
[0020]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]
图1为实施例3中特异性结果图；图2为实施例3中重复性结果图；图3为实施例3中线性灵敏度结果图；图4为实施例6中鸭甲型肝炎1型病料部分检测结果图；图5为实施例6中鸭甲型肝炎3型病料部分检测结果图；图6为实施例6中鸭星状病毒病料部分检测结果图；图7为实施例6中鸭副黏病毒病料检测结果图。
具体实施方式
[0022]
为了使本技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
[0023]
实施例1一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒本实施例利用多重荧光pcr法检多种常见鸭源病毒的试剂盒，包括反应试剂、阳性对照品和阴性对照品。
[0024]
（1）反应试剂：取10ml容量瓶，分别加入0.5mol/ltrizma
®
hcl96μl，0.5mol/ltrizma
®
base504μl，1mol/lmgcl235μl，1mol/lkcl1200μl，dmso100μl，dntps135μl，50μmol/l的鸭甲型肝炎1型上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭甲型肝炎1型探针30μl，50μmol/l的鸭甲型肝炎3型上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭甲型肝炎3型探针30μl，50μmol/l的鸭星状病毒上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭星状病毒探针30μl，50μmol/l的鸭副黏病毒上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭副黏病毒探针30μl，hs-taq酶1μl，m-mlv酶0.5μl，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl。用双重蒸馏水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀。将液体转移到10ml烧杯中，按25μl/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
[0025]
其中，本发明利用生物信息学方法，根据病毒的发现时间与地点进行分类，而后获
得其保守序列，具体如下：鸭甲型肝炎1型基因序列如seqidno:13所示：鸭甲型肝炎3型基因序列如seqidno:14所示：鸭星状病毒基因序列如seqidno:15所示；鸭副黏病毒基因序列如seqidno:16所示。
[0026]
在此基础上，比对分析，设计鸭甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒特异性引物及探针，具体如下：鸭甲型肝炎1型特异性引物，其上游引物为5'-tggatctccgtaccaacaca-3'（seqidno:1），其下游引物为5'-cattgccatgtcggtacttg-3'（seqidno:2）；鸭甲型肝炎1型探针为5'-fam-aaattgaccttgtggtccca-bhq1-3'（seqidno:3）；鸭甲型肝炎3型特异性引物，其上游引物为5'-ttagacgctggcagattgtg-3'（seqidno:4），其下游引物为5'-ctattgccaggggtcactgt-3'（seqidno:5）；鸭甲型肝炎3型探针为5'-hex-ggtgattttcagtgggctaa-bhq1-3'（seqidno:6）；鸭星状病毒特异性引物，其上游引物为5'-taaacgttcgcctcaaatcc-3'（seqidno:7），其下游引物为5'-gccatgccttggaagttaaa-3'（seqidno:8）；鸭星状病毒探针为5'-rox-ctgcaggccttgagaaggt-bhq2-3'（seqidno:9）；鸭副黏病毒特异性引物，其上游引物为5'-cagctgttgcagcctatcaa-3'（seqidno:10），其下游引物为：5'-atgaaccgcggctgtatatc-3'（seqidno:11），鸭副黏病毒探针为5'-cy5-accttattggctgatggtgg-bhq2-3'（seqidno:12）。
[0027]
（2）阴性对照品：取100ml容量瓶，加入te水定容至100ml，将液体转移到10ml烧杯中，按500
µ
l/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
[0028]
（3）阳性对照品：取10ml容量瓶，分别加入5.0
×
105copies/ml鸭甲型肝炎1型、鸭甲型肝炎3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒质粒各100
µ
l，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
103copies/ml的阳性对照品。将液体转移到10ml烧杯中，按50
µ
l/支分装到离心管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将离心管取出，盖上管盖，2-8℃保存备用。
[0029]
实施例2一种检测多种常见鸭源病毒的检测方法本实施例中多种常见鸭源病毒的多重荧光pcr法检测方法，包括以下具体步骤：1.主要试剂盒：采用实施例1的试剂盒。
[0030]
2.核酸提取：采用合格的核酸提取试剂盒对待测样本进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其od260/od280应在1.6-2.0之间。
[0031]
3.加样上机（1）阳性对照品溶解：取250μl阴性对照品加入至阳性对照冻干粉中，混匀后备用。
[0032]
（2）加样：取出反应试剂八联管，分别加入25μl样本核酸、25μl阳性对照品或25μl阴性对照品。将管盖或封膜密封后，稍微离心后置入荧光pcr扩增仪内。
[0033]
（3）上机检测：a.循环条件设置：50℃逆转录20min，93℃预变性2min；93℃变性10s，55℃检测信号35s，循环40次。
[0034]
b.仪器检测通道选择：荧光通道设定为fam、rox、hex和cy5。
[0035]
4.有效性判断：阴性对照品应无ct值或者为0，阳性对照品ct值应≤38，否则，本次
实验结果无效。
[0036]
5.结果判读：待测样本根据下表进行结果判读：实施例3特异性、重复性和灵敏度检测1.特异性检测（1）特异性样本：准备10份特异性样本，其中特异性样本1-样本4为生理盐水、样本5为鸡新城疫病毒样本、样本6为经典呼肠孤病毒样本、样本7为新型呼肠孤病毒样本、样本8为鸭坦布苏病毒样本、样本9为鸭圆环病毒样本、样本10为鸭腺病毒样本。
[0037]
（2）实验过程：利用实施1的试剂盒，采用实施例2中多重荧光pcr检测方法，分别检测以上10份特异性样本，检测结果如下表1和图1所示：图1中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表ct值。
[0038]
表1特异性样本1-10四个荧光通道的检测结果（3）实验结果：由表1和图1所知，10份特异性样本检测结果皆为阴性，说明本发明的试剂盒对四种鸭源性病毒（鸭甲型肝炎1型、鸭甲型肝炎3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒）具有较好的特异性，无交叉反应情况。
[0039]
2.重复性检测（1）重复性样本：取10ml容量瓶，分别加入5.0
×
107copies/ml鸭甲型肝炎1型、鸭甲型肝炎3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒质粒各10
µ
l，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
104copies/ml的重复性样本。
[0040]
（2）实验过程：采用实施例1的试剂盒，利用实施例2的多重荧光pcr检测方法，重复检测重复性样本10次，测试结果如表2和图2所示：图2中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表ct值。
[0041]
表2重复性样本10次检测结果表3中
①‑⑩
表示第一次检测-第十次检测的重复性样本的ct值。
[0042]
（3）实验结果：通过表2和图2可知，重复性样本的批内变异系数（cv值）＜5%，表明本发明的试剂盒的重复性好。
[0043]
3.灵敏度检测（1）灵敏度样本：取10ml容量瓶，分别加入5.0
×
107copies/ml鸭甲型肝炎1型、鸭甲型肝炎3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒质粒各1ml，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
106copies/ml的灵敏度样本1#。
[0044]
取10ml容量瓶，加入灵敏度样本1#1ml，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
105copies/ml的灵敏度样本2#。
[0045]
取10ml容量瓶，加入灵敏度样本2#1ml，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
104copies/ml的灵敏度样本3#。
[0046]
取10ml容量瓶，加入灵敏度样本3#1ml，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
103copies/ml的灵敏度样本4#。
[0047]
取10ml容量瓶，加入灵敏度样本4#1ml，用te水定容至10ml，得到浓度为5.0
×
102copies/ml的灵敏度样本5#。
[0048]
（2）实验过程：采用实施例1的试剂盒，采用实施例2的多重荧光pcr检测方法，重复检测以上灵敏度样本，测试结果如表3和图3所示：图3中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表ct值。
[0049]
表3灵敏度样本1#-5#四个荧光通道检测结果（3）实验结果：通过表3和图3可知，浓度为5.0
×
102copies/ml灵敏度样本5#仍然检测为阳性，说明本发明中的试剂盒及多重荧光pcr法的检测灵敏度为5.0
×
102copies/ml。
[0050]
实施例4四种引物探针之间干扰性测试（1）干扰样本：采取8份干扰样本，其中样本1为5.0
×
105copies/ml鸭甲型肝炎病毒1型、样本2为5.0
×
103copies/ml鸭甲型肝炎病毒1型、样本3为5.0
×
105copies/ml鸭甲型肝炎病毒3型、样本4为5.0
×
103copies/ml鸭甲型肝炎病毒3型、样本5为5.0
×
105copies/ml鸭星状病毒样本、样本6为5.0
×
103copies/ml鸭星状病毒样本、样本7为5.0
×
105copies/ml鸭副黏病毒样本、样本8为5.0
×
103copies/ml鸭副黏病毒样本。
[0051]
（2）反应试剂配制：分别配制如下四种反应试剂，每种反应试剂有且只有1组引物及探针。
[0052]
a.鸭甲型肝炎病毒1型反应试剂：取10ml容量瓶，分别加入0.5mol/ltrizma
®
hcl96μl，0.5mol/ltrizma
®
base504μl，1mol/lmgcl235μl，1mol/lkcl1200μl，dmso100μl，dntps135μl，50μmol/l的鸭甲型肝炎1型上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭甲型肝炎1型探针30μl，hs-taq酶1μl，m-mlv酶0.5μl，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl。用双重蒸馏水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀，将液体转移到10ml烧杯中，按25μl/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，
将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
[0053]
b.鸭甲型肝炎病毒3型反应试剂：取10ml容量瓶，分别加入0.5mol/ltrizma
®
hcl96μl，0.5mol/ltrizma
®
base504μl，1mol/lmgcl235μl，1mol/lkcl1200μl，dmso100μl，dntps135μl，50μmol/l的鸭甲型肝炎3型上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭甲型肝炎3型探针30μl，hs-taq酶1μl，m-mlv酶0.5μl，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl。用双重蒸馏水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀。
[0054]
将液体转移到10ml烧杯中，按25μl/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
[0055]
c.鸭星状病毒反应试剂：取10ml容量瓶，分别加入0.5mol/ltrizma
®
hcl96μl，0.5mol/ltrizma
®
base504μl，1mol/lmgcl235μl，1mol/lkcl1200μl，dmso100μl，dntps135μl，50μmol/l的鸭星状病毒上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭星状病毒探针30μl，hs-taq酶1μl，m-mlv酶0.5μl，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl。用双重蒸馏水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀。
[0056]
将液体转移到10ml烧杯中，按25μl/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
[0057]
d.鸭副黏病毒反应试剂：取10ml容量瓶，分别加入0.5mol/ltrizma
®
hcl96μl，0.5mol/ltrizma
®
base504μl，1mol/lmgcl235μl，1mol/lkcl1200μl，dmso100μl，dntps135μl，50μmol/l的鸭副黏病毒上下游引物各120
µ
l，50μmol/l鸭副黏病毒探针30μl，hs-taq酶1μl，m-mlv酶0.5μl，甘油500μl，10%的蔗糖2500μl，10%的甘氨酸1000μl。用双重蒸馏水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀。
[0058]
将液体转移到10ml烧杯中，按25μl/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
[0059]
（3）实验过程：a.核酸提取：采用已备案的核酸提取试剂盒对上述8份干扰样本进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其od260/od280应在1.6-2.0之间。
[0060]
b.加样上机：将提取的8份25μl样本核酸分别加入上述四种反应试剂的八联管内，将管盖或封膜密封后，稍微离心后置入荧光pcr扩增仪内。pcr扩增条件和检测模式同实施例2，得到检测结果如表4所示：表4干扰样本1-8四个荧光通道的检测结果（3）实验结果：通过表4可知，鸭甲型肝炎病毒1型反应试剂、鸭甲型肝炎病毒3型反应试剂、鸭星状病毒反应试剂、鸭星状病毒反应试剂四种反应试剂只能检测出各自对应的病毒样本阳性，其他样本皆为阴性，充分表明本发明的试剂盒中不同引物探针之间不存在相互干扰的情况。
[0061]
实施例5冻干粉试剂保存稳定性测试
pcr检测方法，可一次实现四个靶标基因的检测，从而直接实现同时检测甲型肝炎病毒1型、鸭甲型肝炎病毒3型、鸭星状病毒、鸭副黏病毒，降低检测成本，极大缩短了检测时间，提高用药准确率，降低病死率，减少养殖户经济损失。
[0069]
本发明的检测试剂盒配合多重荧光pcr法检测，只需一次扩增即可得到检测结果，免去后续测序或电泳检测步骤，减少实验步骤并降低检测成本，能够在短时间内区分致病性禽流感分型，提高检测效率，具有极高的特异性和灵敏度，检测灵敏度可以达到100copies/ml。
[0070]
本发明中的检测试剂盒为冻干粉试剂盒，相较于普通液体试剂盒于-20℃保存而言，本发明的冻干粉试剂盒更加稳定，可在常温下长时间保存，具有良好常温保存稳定性。
[0071]
以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。