用于检测胞内或囊内生物分子相互作用的人工跨膜蛋白的制作方法

1.本发明属于人工跨膜蛋白领域，特别是用于检测胞内或囊内生物分子相互作用。本发明还涉及用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置，其包含人工跨膜蛋白，以及涉及用于检测细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分中的胞内或囊内生物分子相互作用的方法。


背景技术：

2.检测装置例如在各种各样的应用中用作生物传感器。一个特别的应用是检测或监测结合亲和力或过程。例如，在这种生物传感器的帮助下，可以执行检测靶样品与结合位点的结合的各种测定。典型地，在布置在生物传感器表面上的二维微阵列中的点处，在生物传感器上执行大量这样的测定。微阵列的使用为在高通量筛选中同时检测不同靶样品的结合亲和力或过程提供了工具。为了检测靶样品与特定结合位点结合的亲和力、靶分子与特定捕获分子结合的亲和力，将大量捕获分子在生物传感器外表面上固定在各个点处(例如通过喷墨点样或光刻)。每个点为预定类型的捕获分子形成单独的测量区。检测靶分子与特定类型的捕获分子的结合，并用于提供关于靶分子相对于特定捕获分子的结合亲和力的信息。
3.一种用于检测靶样品的结合亲和力的已知技术利用荧光标记。荧光标记能够在激发时发出荧光。发出的荧光具有特征发射光谱，其识别特定点处的当前荧光标记。被识别的荧光标记指示被标记的靶分子已经结合到存在于该点处的特定类型的结合位点。
4.在文章"zeptosens' protein microarrays: a novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis", proteomics 2002, 2, s. 383-393, wiley-vch verlag gmbh, 69451 weinheim, germany中描述了用于检测标记的靶样品的传感器。其中描述的传感器包括布置在衬底上的平面波导。平面波导具有能够在其上附着多个结合位点的外表面。此外，平面波导具有多个入耦合线，用于以这样的方式将相干光束耦合到平面波导中，使得相干光束沿着平面波导传播。相干光在全内反射下通过平面波导传播，其中相干光的倏逝场沿着平面波导的外表面传播。倏逝场在平面波导的外表面处穿透到较低折射率介质中的深度是通过平面波导传播的相干光的波长的几分之一的数量级。倏逝场激发被标记的靶样品的荧光标记，所述被标记的靶样品结合到被布置在平面波导表面上的结合位点。由于倏逝场穿透到平面波导外表面处的光学较薄介质中的深度非常小，所以只有结合到固定在平面波导外表面上的结合位点的被标记样品被激发。由这些标记发出的荧光然后在ccd摄像机的帮助下被检测到。
5.虽然使用荧光标记检测结合亲和力原则上是可能的，但该技术的缺点在于检测到的信号是由荧光标记产生的，而不是由结合配偶体本身产生的。此外，标记的靶样品需要额外的准备步骤。此外，标记的靶样品相对昂贵。另一个缺点是由于荧光标记在靶样品上的空间位阻导致结果的歪曲，这可能会干扰靶样品与捕获分子的结合。进一步的缺点是由于标签的光漂白或淬灭效应导致的结果的歪曲。此外，荧光标记可能会显著影响感兴趣的化合
物的化学、生物学、药理学和物理特性。因此，仅依靠荧光标记的测量可能会因此类标记的存在而被歪曲。此外，荧光光谱法需要标记任何感兴趣的化合物或细胞成分。因此，只能观察到与标记的特定化合物的相互作用，而不能观察到任何进一步的相互作用。


技术实现要素：

6.分析生物样品的一个关键要求是区分感兴趣的化合物或结构部分与结合位点的特异性结合与非特异性结合。解决此问题的已知策略，例如表面等离子共振(spr)或mach zehnder干涉测量强烈依赖于参考测量，且仅适用于静态条件下的测量。因此，此类技术通常不适用于复杂环境的测量，例如检测活细胞内的生物分子相互作用。spr测量传感器表面附近受体-配体结合时的折射率变化。然而，该技术的缺点是它容易受到传感器表面附近的任何折射率变化的影响。因此，非特异性结合仍然是一个重大问题。特别是，折光传感器无法区分实际与感兴趣的靶标结合的分子与仅存在其他化合物以及影响折光率的附加效应。
7.由于g蛋白偶联受体(gpcr)与许多疾病(诸如疼痛、哮喘、炎症、肥胖和癌症)的发展和进展有关，因此它们已经发展成为候选药物的特别突出的靶标，非常期望对活细胞中的这些受体进行详细分析。用于确定gpcr活性的全细胞测定传统上依赖于检测不同的胞内第二信使(camp，ca
2
)、荧光标记蛋白的再定位(抑制蛋白募集到受体或受体内化)或在gpcr激活的信号传导级联控制下的报道基因的表达。然而，如上所述，荧光标记需要大量的生物分子修饰，诸如蛋白的过表达或荧光标记的引入，这并不总是可能的或合期望的，因为这些会改变细胞生理学或药物药理学。此外，gpcr通常调制多于一种效应子，这可能导致这些分析中的交叉敏感性。
8.无标记细胞测定，如共振波导光栅生物传感器，不需要任何分子标记(参见paulsen等人, photonics nanostruct. fundam. appl. 2017, 26, 69)。通常，这种折射传感器通过传播的倏逝波监测传感器芯片上方的折射率，该传播的倏逝波通过其穿透深度限定传感体积。在这个传感体积内重新分布细胞内容会导致折射率的整体变化，从而产生广受好评的动态质量重新分布(dmr)的整体图景。反过来，dmr本质上是交叉敏感的，这意味着不同的gpcr介导的信号通路不能被传感器在时空上解卷积。
9.作为光学无标记全细胞分析(例如spr)的替代方法，基于共振波导光栅(rwg)的动态质量再分布、对称波导传感器和定量相位成像已被用于研究药物发现的形态变化和表型细胞反应。然而值得注意的是，这些方法只能提供有关胞质质量、溶质浓度和体积变化的信息，而不能监测胞内或囊内过程。
10.因此，本发明的总体目的是改进关于检测胞内或囊内相互作用的现有技术，从而优选地完全或部分地避免现有技术的缺点。
11.在有利的实施例中，提供了一种人工跨膜蛋白，其可以被具体地工程化以使其被配置用于与特定的胞内或囊内成分相互作用并且同时能够监测与所述囊内或胞内成分的直接或间接相互作用。
12.在进一步有利的实施例中，提供了能够进行单细胞测量的人工跨膜蛋白。
13.总体目标一般通过独立权利要求的主题来实现。进一步的有利和示例性实施例从描述和附图中得出。
14.根据本发明的第一方面，总体目标通过用于检测胞内或囊内生物分子相互作用的
生物分子检测装置中的人工跨膜蛋白来实现。人工跨膜蛋白包含胞外或囊外结合结构、疏水性跨膜结构域和包含胞内或囊内受体结构的胞内或囊内结构域。受体结构被配置为与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分相互作用，并且其中胞外或囊外结合结构被配置为与沿生物分子检测装置的多条预定线布置的膜识别元件结合。应当理解，受体结构与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分的相互作用是指生物分子意义上的相互作用。因此，这种相互作用可以例如是化合物与受体的结合。胞内或囊内受体结构可以被具体设计，例如通过基因工程，以与任何给定的感兴趣的胞内或囊内成分相互作用。因此，人工跨膜蛋白是仿生膜受体，其通过现有的生物技术程序设计用于特定目的。
15.优选地，可与根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白组合用于检测感兴趣的生物分子相互作用的生物分子检测装置包括倏逝照明器，其具有配置用于在倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光产生倏逝场的光学耦合单元。倏逝照明器的第一表面包含模板纳米图案，该模板纳米图案包含多条预定线的相干布置，沿着这些预定线布置有用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白、优选地横向可扩散人工跨膜蛋白的结合结构的膜识别元件。横向可扩散的跨膜蛋白是可以在细胞或囊泡的膜内扩散的跨膜蛋白。膜识别元件被配置为结合横向可扩散人工跨膜蛋白的结合结构，用于通过局部锁定人工跨膜蛋白，基于倏逝照明器的模板纳米图案在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被与膜识别元件结合的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射。如本领域技术人员所理解的，倏逝照明器是能够从光源的相干光产生倏逝场的元件。倏逝照明器上的预定线布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测位点相长干涉，其中光程长度的差异是相干光的预定波长的整数倍。如本领域技术人员所理解的，光程长度是指光通过给定系统所遵循的路径的几何长度与其传播通过的介质的折射率的乘积。由于人工跨膜蛋白的胞外或囊外结合结构被配置为与沿生物分子检测装置的多条预定线布置的膜识别元件结合，因此生物分子检测装置的模板纳米图案通过选择性结合可在细胞内横向扩散的跨膜蛋白转移到活细胞中，从而产生细胞本身中的跨膜纳米图案。通常，多个不同的预定线的膜识别元件与相同的细胞结合，即多于一种的膜识别元件与单个细胞、囊泡或细胞或囊泡成分结合或被配置为与单个细胞、囊泡或细胞或囊泡成分结合。
16.由于胞外或囊外结合结构被配置为与沿生物分子检测装置的多条预定线布置的膜识别元件结合，并且受体结构可以通过例如基因工程特别设计以与任何给定的感兴趣的胞内或囊内成分相互作用，人工跨膜蛋白提供了对感兴趣的生物分子检测具有特异性的检测窗口。生物分子检测装置的模板纳米图案允许通过选择性结合可在细胞内横向扩散的人工跨膜蛋白将生物分子检测装置的模板纳米图案转移或复制到活细胞膜中。结果，可以选择性地检测涉及人工跨膜蛋白相互作用的任何生物分子相互作用，甚至胞间过程。在膜识别元件和人工跨膜蛋白的结合结构之间结合后，倏逝光在预定的检测位点被散射并相长干涉。散射光的相长干涉与所有结合的跨膜蛋白有关，并产生测量强度相对于跨膜蛋白数量的二次标度。重要的是，未与分子识别元件结合的背景分子的随机散射在建设性和破坏性方面均具有相同的概率。结果，交叉灵敏度显著降低。令人惊讶的是，即使活细胞和同样囊泡在纳米尺度上包含高度不平坦的表面，由于任何细胞散射，特别是膜散射，几乎没有观察到任何交叉敏感性。虽然活细胞的测量可能很容易受到压制在结合膜识别元件处散射的光
的信号的干扰，但没有观察到灵敏度的显著损失，并且仅观察到聚焦衍射信号的轻微失真。
17.通常，相干光具有预定波长并且优选地是单色的，特别是在单一波长处。通常，可以使用可见光或近红外光。倏逝场的一部分被由来自细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子组成的散射中心相干地散射，其与在不同预定线上布置的膜识别元件结合。任何位置的散射电场都可以通过将每个散射中心的贡献相加，且然后通过对所得相量求平方来计算强度来确定。散射强度的最大值位于预定检测位置，因为预定线被布置成使得在预定检测位置处，被不同散射中心散射的光的光程长度相差该光的波长的整数倍。在检测位置增加可检测信号的任何散射光都满足相长干涉的要求。预定检测位置处的强度图案优先形成但不限于衍射受限的艾里斑。本质上，傅里叶光学可访问的任何形状都是可能的。对于任何形状，使用匹配滤波器可以最好地恢复信号。
18.孤立的膜识别元件
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折射率为nr的跨膜复合物嵌入在平面偏振光中折射率为n0的介质中的散射为：其中r是感兴趣的化合物到检测位点的距离λ是真空波长ir是入射在人工跨膜复合物上的平面极化场的强度vr人工跨膜复合物的体积；并且其中mr是人工跨膜复合物的摩尔质量，na是阿伏伽德罗常数，是感兴趣的化合物的折射率增量。
19.总质量密度γ
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并且通过简单的操作，还可以通过在预定检测位置处艾里斑中心处测量的强度计算受体的数量：其中na是圆形模板纳米图案的数值孔径是制造的模板纳米图案的分析物效率
d是圆形模板纳米图案的直径是入射在受体集合上的平均强度是艾里斑中心、即预定的检测位置处的强度。
20.因此，根据实验设计，散射光的强度变化提供了获得相互作用配偶体的分子质量、总结合质量或在涉及人工跨膜蛋白的生物分子相互作用期间涉及的受体数量的途径。例如，如果某种信使化合物与人工跨膜蛋白结合，则可以计算出相应的质量增加。例如，胞内或囊内受体结构可以被配置为与具有已知分子质量的生物分子相互作用的第一成分a相互作用。在结合成分a时，观察到衍射强度的变化。这种强度变化可用于计算与成分a相互作用的受体数量。当第二成分b与成分a或同样受体结构结合时，观察到强度的进一步变化。当成分a和/或b随后从受体结构上脱离时，相应复合物的质量再次降低，且信号强度发生变化。假设b结合的与a结合的结合位点数量相同，则可以在任何给定的测量时间计算复合物的分子质量以及b的分子质量，从而允许随时间实时监测生物分子相互作用。由于质量差异，可以获得与人工跨膜蛋白直接或间接结合或未结合的任何化合物的信息。
21.在一些实施例中，人工跨膜蛋白还包含接头结构域(linker domain)，所述接头结构域被配置为促进所述胞内或囊内受体结构与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分之间的相互作用，其中所述接头结构域布置在所述胞内或囊内受体结构和疏水性跨膜结构域之间。优选地，接头结构域不含可能干扰蛋白折叠的大体积疏水残基，例如色氨酸。因此，接头结构域可由氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和苯丙氨酸组成或仅由甘氨酸组成。诸如甘氨酸的小氨基酸可以提供接头结构域的更高灵活性。极性残留物，例如谷氨酰胺增加了接头在水中的溶解度。接头结构域通常可具有4至25个残基、优选地4至20个残基的长度。
22.在进一步的实施例中，胞外或囊外结合结构被配置为与沿生物分子检测装置的多条预定线布置的膜识别元件建立共价键。例如，胞外或囊外结合结构可以包含能够产生共价键的化学部分，例如亲电体、亲核体、亲二烯体、二烯、1,3-偶极子或亲偶极体。
23.在某些实施例中，胞外或囊外结合结构包含亲核体，优选硫醇或硫醇盐。
24.在进一步的实施例中，胞外或囊外结合结构包含snap标签或clip标签或由其组成。snap标签是182个残基的多肽并且接受o
6-苄基鸟嘌呤衍生物(19.4 kda, crivat等人, trends in biotechnology. 30 (1): 8-16. doi: 10.1016/j.tibtech.2011.08.002; juillerat等人, chemistry and biology. 10 (4): 313-317, doi: 10.1016/s1074-5521(03)00068-1; molliwtz等人, biochemistry. 51 (5): 986-994. doi: 10.1021/bi2016537)。clip标签与snap标签相关并且被设计成接受o
2-苄基胞嘧啶衍生物作为底物，而不是o
6-苄基鸟嘌呤(gautier等人, chemistry and biology. 15(2): 128-136. doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007)。
25.在一些实施例中，人工膜蛋白是单程跨膜蛋白。
26.在进一步的实施例中，人工跨膜蛋白是(a) i型，其中胞内或囊内结构域与c末端相邻布置且胞外或囊外结构域与n末端相邻布置；或(b) ii型，其中胞内或囊内结构域与n末端相邻布置且胞外或囊外结构域与c末端
相邻布置。
27.在i型人工跨膜蛋白中，n末端被配置为面向细胞外部，而c末端被配置为保留在胞质溶胶中。相反，在ii型人工跨膜蛋白中，n末端被配置为保留在胞质溶胶中，而c末端被配置为面向细胞外部。
28.在i型的更具体的实施例中，从n末端到c末端的结构域顺序可以是：胞外或囊外结合结构，优选地带有snap或clip标签，然后是疏水性跨膜结构域，其后任选地是接头结构域，然后是具有胞内或囊内受体结构的胞内或囊内结构域。优选地，带正电荷的氨基酸布置在接头结构域之前。任选地，胞外或囊外结合结构包含可切割的信号肽，其可以优选地布置在snap或clip标签的前面，即最接近n末端。
29.在ii型的更具体的实施例中，从n末端到c末端的结构域顺序可以是：具有胞内或囊内受体结构的胞内或囊内结构域，其后任选地是接头结构域，然后是疏水性跨膜结构域，然后是胞外或囊外结合结构，优选地带有snap或clip标签。任选地，胞内或囊内结构域可以包含可切割的信号肽，其可以优选地布置在受体结构的前面。
30.在一些实施例中，人工跨膜蛋白属于i型或ii型，并且胞内或囊内结构域包含比胞外或囊外结构域更高量的带正电荷的氨基酸残基。特别地，带正电荷的氨基酸可以选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选地赖氨酸。特别是，这些氨基酸在胞内或囊内的出现频率可能是人工跨膜蛋白的其余部分的3到4倍。较高量的带正电荷的氨基酸能够使人工跨膜螺旋在膜内更有效地定向。
31.在进一步的实施例中，胞内或囊内受体结构被配置为与camp通路中的蛋白激酶的β亚基相互作用或与受体酪氨酸激酶(rtk)相互作用。如果胞内或囊内受体结构被配置为与rtk相互作用，则受体结构可以包含grb2蛋白。
32.在一些实施例中，胞内或囊内受体结构可以包含荧光蛋白，例如eyfp。
33.在一些实施例中，胞内或囊内受体结构是设计的受体、人工结合物或其他功能性分子，例如抗体、抗体片段、纳米抗体、亲和物等。
34.在进一步的实施例中，人工跨膜蛋白包含与人工跨膜蛋白的n末端相邻的可切割信号肽，用于与蛋白转运系统相互作用并控制人工跨膜蛋白的易位。
35.通常，可切割信号肽由18-26个氨基酸组成，这可形成带正电荷的n端n区、中心疏水h区和极性c端c区。优选地，切割位点包含在c区中并且被配置为被信号肽酶识别。
36.在一些实施例中，胞外或囊外结合结构包含亲和标签，其被配置为与生物分子检测装置的膜识别元件相互作用，优选地选择性地相互作用。例如，亲和标签可以是ha(人流感血凝素)、flag或6his亲和标签。亲和标签的使用是有益的，因为蛋白构象可以通过分子相互作用改变，这可以限制或阻止充当膜识别元件的抗体识别人工跨膜蛋白的胞外或囊外结合结构。这可以通过胞外或囊外结合结构中的亲和标签来避免。
37.在一些实施例中，人工跨膜蛋白包含胞内或囊内荧光蛋白或配置用于与其他胞内元件(例如生物分子标签)相互作用的蛋白。例如，对于胞内分选酶介导的蛋白固定。优选地，蛋白被配置为与其他胞内元件特异性相互作用。
38.在一些实施例中，跨膜蛋白是无标记的，特别是无荧光标记的。优选地，跨膜蛋白不含可在照射时被激发的人工标记部分。如本文所用的无荧光标记跨膜蛋白是不含荧光小分子的跨膜蛋白，即分子量低于900da的分子。
39.根据另一方面，本发明涉及一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分，其包含根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白或编码根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白的核酸序列。核酸序列可以被引入，优选地在体外，进入细胞并在其中表达，以用于生物分子检测装置。根据另一方面，本发明涉及包含至少一个编码根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白的核酸序列的重组核酸分子。
40.根据另一方面，本发明涉及一种载体，优选地质粒载体，其包含如本文任何实施例中所述的重组核酸分子。
41.根据另一方面，本发明涉及根据本文所述的任何实施例的载体用于体外表达人工跨膜蛋白的用途，包括：提供细胞并在细胞中引入根据本文所述的任何实施例的载体，并表达人工跨膜蛋白。
42.在一些实施例中，该用途进一步包括从人工跨膜蛋白切割信号肽的步骤。
43.根据另一方面，本发明涉及用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置，其包含根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白，所述生物分子检测装置包括具有光学耦合单元的倏逝照明器，该光学耦合单元被配置用于在倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光产生倏逝场，倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案，包含多条预定线的相干布置，沿所述多条预定线布置有用于人工跨膜蛋白、细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的结合结构的膜识别元件，其中膜识别元件被配置为结合人工跨膜蛋白的结合结构，用于基于倏逝照明器的模板纳米图案在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被与膜识别元件结合的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射，且其中预定线布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测位点相长干涉，其中光程长度的差异是相干光的预定波长的整数倍。
44.模板纳米图案允许将生物分子检测装置的模板纳米图案转移到活细胞中，通过选择性结合可在细胞内横向扩散的跨膜蛋白，从而产生细胞本身中的跨膜纳米图案。通常，多个不同的预定线的膜识别元件与相同的细胞结合，即多于一种的膜识别元件与单个细胞、囊泡或细胞或囊泡成分结合或被配置为与单个细胞、囊泡或细胞或囊泡成分结合。结果，可以选择性地检测涉及跨膜蛋白相互作用的任何生物分子相互作用，甚至胞间或胞内过程。在膜识别元件和跨膜蛋白的结合结构之间结合后，倏逝光在预定的检测位点被散射并相长干涉。散射光的相长干涉与所有结合的跨膜蛋白有关，并产生测量强度相对于跨膜蛋白数量的二次标度。重要的是，未与分子识别元件结合的背景分子的随机散射在建设性和破坏性方面均具有相同的概率。结果，有效地抑制了交叉灵敏度。令人惊讶的是，即使活细胞和同样囊泡在纳米尺度上包含高度不平坦的表面，由于任何细胞散射，特别是膜散射，几乎没有观察到任何交叉敏感性。虽然活细胞的测量可能很容易受到压制在结合膜识别元件处散射的光的信号的干扰，但没有观察到灵敏度的显著损失。这是令人惊讶的，因为细胞、囊泡或细胞或囊泡成分明显大于纳米图案的预定线之间的距离。因此，通常在本文所公开的实施例中，多个不同预定线的膜识别元件与相同细胞结合。通常，两个直接相邻的预定线之间的距离是单个细胞的1/2到1/100，优选地1/30到1/100。
45.在一些实施例中，倏逝照明器包括或者是具有布置在托架表面上的平面波导的托架和作为光耦合单元的光耦合器，其用于将预定波长的相干光耦合到波导中，使得相干光
传播通过具有沿平面波导的第一表面传播的相干光的倏逝场的平面波导，并且其中平面波导的第一表面包括模板纳米图案。
46.在一些实施例中，倏逝照明器是全内反射系统，其被配置为通过光学耦合单元，特别是通过棱镜或任何其他合适的光学元件，将预定波长和预定角度的相干光束提供到倏逝照明器的第一表面上。
47.在一些实施例中，多条预定线包括具有曲率的曲线，该曲率被配置为使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或囊泡或细胞成分或其生物分子散射的倏逝场的光在预定检测位点干涉。
48.优选地，模板纳米图案的整体形状可以是圆的，特别是圆形。
49.在优选的实施例中，曲线布置成在光的传播方向上相邻线之间的距离减小，用于将由细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光聚焦到预定检测位点。备选地，多条预定线可以包括与耦合到倏逝照明器的光的传播成预定角度布置的直线。可以使用附加的耦合器将衍射光聚焦到预定检测位点。
50.在进一步的实施例中，多条预定线以这样的方式布置在倏逝照明器的外表面上，使得它们在xj,yj坐标中的位置由以下等式几何定义：其中λ是传播光的真空波长；n为平面波导中导模的有效折射率；n取决于平面波导的厚度、托架的折射率、平面波导的第一表面上的介质的折射率和导模的偏振；在全内反射系统的情况下，n可以通过全内反射的角度来表示ns是托架的折射率f为预定检测位置的焦距；a0是一个整数，取值接近于乘积折射率ns和托架的预定检测位置f的焦距除以波长λ；j是一个连续整数，表示相应行的索引。
51.选定的整数a0在具有负j值的线的中心分配负x值，且在具有正j值的线的中心分配正x值。或者换句话说，整数a0定义了x,y坐标系的原点，其用于在倏逝照明器的外表面上定位线；选择的a0值将检测位置置于x=0, y=0, z=-f。
52.在一些实施例中，至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分通过人工跨膜蛋白的结合结构与膜识别元件结合。
53.根据另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白，或根据本文所述的任何实施例的细胞，或根据本文所述的任何实施例的重组核酸分子，或根据本文所述的任何实施例的载体，以及根据本文所述的任何实施例的生物分子检测装置。
54.在一些实施例中，试剂盒还包含被配置用于胞内或囊内生物分子相互作用的感兴
趣的蛋白，其中感兴趣的蛋白包含高质量部分，特别是金纳米颗粒。使用这种高质量的部分是有益的，因为较高的分子量对获得的信号强度有有益的影响，因此甚至可以进行单细胞测量。如技术人员所理解的，高质量部分通常具有比人工跨膜蛋白显著更大的分子量。例如，高质量部分也可以是蛋白或过表达的蛋白聚集体。优选地，高质量部分的质量可以是至少150 kd。
55.根据另一方面，本发明涉及使用根据如本文所述的任何实施例的生物分子检测装置来检测细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分中的胞内或囊内生物分子相互作用的无标记方法，该方法包括以下步骤：
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任选地提供包含根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白的细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分或囊泡成分；
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将细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分应用于生物分子检测装置的膜识别元件或提供具有至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置通过人工跨膜蛋白的结合结构结合到膜识别元件；
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在相对于多条预定线的预定光束产生位置产生相干光束，相干光束具有预定波长并以入射相干光束的衍射部分在相对于多条预定线在预定检测位点相长干涉的方式入射在具有结合的跨膜蛋白的膜识别元件上，其中光程长度的差异是相干光的预定波长的整数倍，以提供代表膜识别元件的信号，在预定检测位点与其结合有细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白；
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测量代表膜识别元件的信号，其中结合有细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白。
56.用于检测细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分中的胞内或囊内生物分子相互作用的无标记方法是不依赖于光源的光、特别是相干光的光与标记之间的相互作用的方法。这种标记例如是可以在辐射时被激发的人工标记部分，例如荧光标记。常用的荧光标记是荧光小分子，即分子量在900 da以下的荧光分子。
57.在一些实施例中，该方法进一步包括提供与人工跨膜蛋白的受体结构或与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分相互作用的物质的步骤，例如药物、候选药物、小分子或抗体。
58.在某些实施方案中，包含人工跨膜蛋白的细胞或细胞成分是通过用根据本文所述的任何实施例的载体体外转染细胞、在细胞中表达人工跨膜蛋白和为了提供细胞成分任选地去除细胞的部分膜来提供。
59.在一些方面，本发明由以下条款描述：条款1：一种用于检测胞内或囊内生物分子相互作用的生物分子检测装置中的人工跨膜蛋白，所述人工跨膜蛋白包含胞外或囊外结合结构、疏水性跨膜结构域和具有胞内或囊内受体结构的胞内或囊内结构域，其中受体结构被配置为与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分相互作用，并且其中胞外或囊外结合结构被配置为与沿生物分子检测装置的多条预定线布置的膜识别元件结合。
60.条款2：根据条款1所述的人工跨膜蛋白，进一步包括接头结构域，其被配置为促进胞内或囊内受体结构与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分之间的相互作用，其中所述接头结构域布置在胞内或囊内受体结构和疏水性跨膜结构域之间。
61.条款3：根据条款1或2中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述胞外或囊外结合结构被配置为与沿所述生物分子检测装置的多条预定线布置的所述膜识别元件建立共价键。
62.条款4：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述胞外或囊外结合结构包含亲核体，优选地硫醇或硫醇盐。
63.条款5：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述胞外或囊外结合结构是snap标签或clip标签。
64.条款6：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述人工跨膜蛋白是(a) i型，其中胞内或囊内结构域与c末端相邻布置，且胞外或囊外结构域与n末端相邻布置；或(b) ii型，其中胞内或囊内结构域与n末端相邻布置，且胞外或囊外结构域与c末端相邻布置。
65.条款7：根据条款7所述的人工跨膜蛋白，其中所述人工跨膜蛋白是ii型并且其中所述胞内或囊内结构域包含比所述胞外或囊外结构域更高量的带正电荷的氨基酸残基。
66.条款8：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述胞内或囊内受体结构是设计的受体或其他功能分子，例如抗体、抗体片段、纳米抗体或亲和物。
67.条款9：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，进一步包含与所述人工跨膜蛋白的n末端相邻的可切割信号肽，用于与蛋白转运系统相互作用并用于控制所述人工跨膜蛋白的易位。
68.条款10：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述胞外或囊外结合结构包含配置用于与所述膜识别元件相互作用的亲和标签。
69.条款11：根据前述条款中任一项所述的人工跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白是无标记的，特别是无荧光标记的。
70.条款12：一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分，其包含根据条款1至11中任一项所述的人工跨膜蛋白或编码根据条款1至10中任一项所述的人工跨膜蛋白的核酸序列。
71.条款13：一种重组核酸分子，其包含至少一个编码根据条款1至10中任一项所述的人工跨膜蛋白的核酸序列。
72.条款14：一种载体，优选地质粒载体，其包含根据条款12所述的重组核酸分子。
73.条款15：一种根据条款13所述的载体用于在体外表达人工跨膜蛋白的用途，包括：提供细胞和将根据条款13所述的载体引入细胞，并表达人工跨膜蛋白。
74.条款16：根据条款14所述的用途，进一步包括从人工跨膜蛋白切割信号肽的步骤。
75.条款17：一种用于分析包含根据条款1至10中任一项所述的人工跨膜蛋白的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置，所述生物分子检测装置包括具有光学耦合单元的倏逝照明器，所述光学耦合单元被配置为在所述倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光产生倏逝场，倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案，该模板纳米图案包含多条预定线的相干布置，用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白的结合结构的膜识别元件沿所述多条预定线布置，其中膜识别元件被配置为结合人工跨膜蛋白的结合结构以基于倏逝照明器的模板纳米图案在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射，且其中预定线被布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测
位点相长干涉，其中光程长度的差异是相干光的预定波长的整数倍。
76.条款18：根据条款17所述的生物分子检测装置，其中至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分通过人工跨膜蛋白的结合结构与膜识别元件结合。
77.条款19：一种试剂盒，包括：a．根据条款1至11中任一项所述的人工跨膜蛋白，或根据条款12所述的细胞，或根据条款13所述的重组核酸分子，或根据条款14所述的载体，和b．根据条款16或17所述的生物分子检测装置。
78.条款20：根据条款19所述的试剂盒，进一步包括配置用于胞内或囊内生物分子相互作用的感兴趣的蛋白，其中感兴趣的蛋白包含高质量部分，特别是金纳米颗粒。
79.条款21：一种使用根据条款16或17所述的生物分子检测装置检测细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分中的胞内或囊内生物分子相互作用的无标记方法，该方法包括以下步骤：
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提供包含根据条款1至11中任一项所述的人工跨膜蛋白的细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分；
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将细胞、细胞成分或囊泡或囊泡成分应用于生物分子检测装置的膜识别元件；
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在相对于多条预定线的预定光束产生位置产生相干光束，相干光束具有预定波长并且以入射的相干光束的衍射部分在相对于多条预定线的预定检测位点相长干涉的方式入射在具有结合的跨膜蛋白的膜识别元件上，其中光程长度的差异是相干光的预定波长的整数倍，以提供代表膜识别元件的信号，其中在预定检测位点与其结合有细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白；
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用与其结合的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的人工跨膜蛋白测量代表膜识别元件的信号。
80.条款22：根据条款21所述的方法，进一步包括提供与人工跨膜蛋白的受体结构或与待检测的生物分子相互作用的胞内或囊内成分相互作用的物质的步骤。
81.条款23：根据条款21或22所述的方法，其中包含人工跨膜蛋白的细胞或细胞通过用根据条款14所述的载体体外转染细胞、在细胞中表达人工跨膜蛋白和为了提供细胞成分任选地去除细胞膜的部分来提供。
附图说明
82.图1显示了根据本发明的一个实施例的生物分子检测装置的示意图。
83.图2显示了根据本发明的另一实施例的生物分子检测装置的示意性截面图。
84.图3a显示了根据本发明的一个实施例的用于检测camp通路的胞内相互作用的人工跨膜蛋白。
85.图3b显示了在检测camp通路以及使用g蛋白敲除细胞的对照实验期间预期来自野生型细胞的信号。
86.图3c显示了在检测camp通路以及使用g蛋白敲除细胞的对照实验期间从野生型细胞获得的信号。
87.图4a显示了根据本发明的其他实施例的用于检测erk通路的胞内相互作用的两种不同的人工跨膜蛋白。
88.图4b显示了与人工跨膜蛋白相关的信号，该信号是在通过生长因子激活erk通路时在检测erk通路期间获得的。
89.图4c显示了与人工跨膜蛋白相关的信号，该信号是在erk通路下游激酶抑制后在检测erk通路期间获得的。
90.图5a和5b显示了根据本发明的另一实施例的生物分子检测装置的示意图。
91.图6a和6b显示了根据本发明的另一实施例的生物分子检测装置的示意图。
具体实施方式
92.图1示出了根据本发明的实施例的生物分子检测装置1。生物分子检测装置1包括具有表面的托架2，平面波导3布置在该表面上。检测装置还包括光耦合器4，用于将预定波长的相干光l耦合到平面波导3中，使得相干光通过平面波导传播，其中相干光的倏逝场沿着平面波导3的第一表面传播。平面波导的第一表面是背离托架2的表面，即在图1中可见的表面。除了光耦合器4之外，波导3的第一表面还包括模板纳米图案5，该模板纳米图案5包含多条预定线，膜识别元件沿着这些预定线布置(图1中未示出)。通常，光源6用于朝向光耦合器4提供相干光l的入射光束。光耦合器4将相干光l耦合到平面波导3中，在平面波导3上，相干光l沿着图1所示的箭头方向朝向模板纳米图案5传播。如果膜识别元件通过根据本文所述的任何实施例的人工跨膜蛋白结合到细胞、囊泡或细胞或囊泡成分，则光被散射，并且由于预定线，其被布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测位点7处相长干涉。在所示的特定实施例中，预定线是具有曲率的曲线，该曲率被配置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的倏逝场的光在预定检测位点7处干涉。模板纳米图案5的每个膜识别元件和检测位点7之间的距离被称为光程长度。
93.图2示出了沿着光l通过平面波导3的传播方向通过模板纳米图案5的生物分子检测装置1的示意性横截面。装置1包含托架2，其中波导3布置在其表面上。布置在平面波导3的第一表面之上的是活细胞8。此外，模板纳米图案5包括脊51和凹槽52。脊51是膜识别元件沿其布置的区域。凹槽52是不包含任何膜识别元件的区域。因此，细胞8的跨膜蛋白的结合结构只能在相应的脊处与纳米图案5结合。一般而言，如本文所述的人工跨膜蛋白在细胞膜或囊泡膜内是可横向扩散的。因此，人工跨膜蛋白横向扩散通过膜，直到它们非常靠近膜识别元件，在其上可以形成共价键以在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内建立纳米图案。应当注意，单元、纳米图案、波导和托架的宽度不提供它们的实际宽度或宽度比的任何指示。
94.附图3a显示了环amp(camp)通路的示意图，其根据本发明的一个实施例用人工跨膜蛋白进行监测。camp通路是一种g蛋白偶联受体触发的信号级联，其在细胞反应中起基本作用。在静息细胞中，g蛋白与gpcr的胞内位点结合。外部配体激活gpcr后，g蛋白的α亚基离开gpcr复合物并激活腺苷酸环化酶(ac)，一种具有胞内活性位点的膜结合酶。反过来，ac将三磷酸腺苷(atp)转化为环磷酸腺苷(camp)，细胞的最常见的第二信使之一。此外，ac在放大信号方面发挥作用，因为外部配体的攻击需要在几秒钟内合成数千秒的信使分子。camp浓度的增加刺激了camp依赖性蛋白激酶(pka)。pka是由两个调节亚基(i型和ii型)组成的
四聚体，针对每个亚基和两个(α和β)催化亚基结合两个camp分子。camp分子的结合导致两个催化亚基的磷酸化，且从而导致它们从两个调节二聚体中解离。这些磷酸化亚基激活范围广泛的靶标，这些靶标可能是其他信号蛋白以及效应蛋白。眼前选择camp通路的最后一步作为根据本发明的人工跨膜蛋白的工作原理的概念证明。为了探测gpcr触发后催化b亚基的解离，构建了一种人工跨膜，其具有胞内或囊内结构域，其中胞内或囊内受体结构在其胞质位点呈现pka类型ii-β调节亚基(r2)。如从图3b中可以看出，预计信号强度会降低，这与催化β亚基解离时复合物的质量降低有关(虚线)。同时，在g蛋白敲除细胞中不应检测到信号变化，因为g蛋白的缺失导致ac活性没有激活，且因此催化β亚基没有解离。图3c显示了实验获得的her293细胞(野生型)和g蛋白敲除细胞的信号。虽然敲除细胞的信号不提供任何信号变化，但野生型在催化β亚基解离时显示信号强度降低。
95.图4a显示了erk信号通路的示意图，该通路已被两种不同的人工跨膜蛋白监测。erk通路由结合酪氨酸激酶受体(rtk)的外部配体启动，其是最常见的酶联表面受体类型之一。通常，无活性的rtk受体由两个单程单体组成，一旦配体与胞外结构域结合，它们就会被激活并二聚化。二聚化涉及特定酪氨酸残基上的反式自磷酸化(一个单体磷酸化另一个，反之亦然)。磷酸化酪氨酸增加rtk的激酶活性并充当特定胞内蛋白的结合位点。发生结合事件是因为这些蛋白能够识别磷酸化酪氨酸及其周围的rtk构象。与rtk相关的蛋白继而通常通过sh2结构域与衔接蛋白grb2相关。grb2还有两个其他sh3结构域用于与其他蛋白相互作用。sh3结构域之一经常与sos相互作用，一种促进gtp与ras结合的gdp交换的蛋白。当sos激活ras时，在不活动时与gdp绑定的单体gtpase用gtp代替gdp，且继而ras在正反馈电路中进一步激活sos。ras激活raf，且raf继而又通过级联机制通过mekthe胞外信号调节激酶(通常称为erk模块)激活。erk蛋白处于活化或失活状态，其分别对应于其磷酸化和非磷酸化形式。磷酸化的erk易位进入细胞核并作用于基因调节蛋白。erk模块通常被erk本身关闭，其通过负反馈使raf失活。为了监测生长因子沿erk通路的早期级联效应，第一人工跨膜蛋白设有grb2蛋白作为受体结构。此外，通过第二人工跨膜蛋白监测下游效应，其包含人工结合物作为磷酸化erk成分的受体结构。图4b显示了当erk级联被生长因子刺激激活时，第一人工跨膜蛋白(虚线)和第二人工跨膜蛋白(实线)预期的信号。图4c显示了抑制下游激酶后第一人工跨膜蛋白(grb2，虚线)和第二人工跨膜蛋白(人工结合物，实线)预期的信号，这将导致仅从第二人工跨膜蛋白获得的信号减少。
96.首先测试作为第一人工跨膜蛋白受体结构的grb2蛋白的sh3结合结构域是否具有功能性。在这种情况下，包含具有grb2作为受体结构的人工跨膜蛋白的细胞和包含具有eyfp(增强型黄色荧光蛋白)的人工跨膜蛋白的细胞用特异性靶向grb2的蛋白处理。如从图4d可以看出，在注射肽后信号在基线内保持约20分钟。此后，观察到具有含有grb2作为受体结构的人工跨膜蛋白的细胞的反应增加，而具有含有eyfp作为受体结构的人工跨膜蛋白的细胞的信号在基线保持恒定。注射和反应变化之间的滞后可能是由于肽扩散穿过细胞膜并结合grb2 sh3结构域所需的时间。因此，该方法允许实时监测活细胞内的胞内生物分子相互作用。此外，这些结果表明，grb2靶向肽特异性结合活细胞内的grb2受体结构，而其不结合非特异性受体结构，例如eyfp。
97.图5a和5b示出了根据本发明的实施例的生物分子检测装置1'。装置1'包括具有光耦合单元4'的倏逝照明器2'，该光耦合单元4'被配置成用于在倏逝照明器2'的第一表面上
从具有光源6'的预定波长的相干光生成倏逝场9'。倏逝照明器2'的第一表面5包括模板纳米图案5'，该模板纳米图案5'包含多条预定线的相干布置，沿着这些预定线，用于细胞8'的跨膜蛋白81的结合结构的膜识别元件。如可以看到的，通过在膜识别元件和可横向扩散的跨膜蛋白81之间建立化学键，倏逝照明器2'的纳米图案5'被转置到细胞中作为跨膜纳米图案。在图5a的实施例中，光源6'和检测单元7'是物理上分离的部件，而在图5b中所示的实施例中，它们是倏逝照明器2'的一体部分。
98.图6a和6b示出了根据本发明的生物分子检测装置1''的替代实施例。生物分子检测装置1包括倏逝照明器，在这些特定实施例中，该倏逝照明器是全内反射系统，该全内反射系统被配置成借助于光耦合单元4''以预定角度从光源6''将处于预定波长的相干光束提供到倏逝照明器的第一表面上。这些实施例中的光耦合单元是棱镜。在图6a中所示的实施例中，倏逝照明器包括折射率匹配介质11''和包含模板纳米图案5''的载片12''，所述折射率匹配介质诸如是折射率匹配油、dmso、甘油、水混合物、水凝胶等。替代地，如图6b中所示，倏逝照明器可以没有折射率匹配介质11''和载片12''。在这种情况下，纳米图案5''直接设置在光耦合单元4''、即棱镜的第一表面上。
99.方法和材料编码不同人工跨膜蛋白的dna质粒购自thermo fisher scientific的invitrogen geneart gene synthesis服务。所有合成基因均由合成寡核苷酸和/或pcr产物组装而成，并插入到pcdna3.1 ( )载体骨架中。从转化的细菌中纯化质粒dna，通过紫外光谱确定浓度，并由制造商通过测序验证最终构建体。插入位点内的序列同一性为100%。质粒以约1 mg/ml的浓度在te缓冲液中递送，并在-80℃下以工作等分试样储存。
100.所测试的三种信号肽列于表3.1，而其他氨基酸序列可在表1中找到。
101.表2显示了编码测试的一些人工跨膜蛋白的质粒载体的结构特征：。
102.细胞培养和转染hek293野生型和g蛋白敲除细胞在完全培养基(含有10%胎牛血清的dmem培养基)中于37℃在带有5% co2的细胞培养箱中培养。为了生成人工跨膜蛋白表达细胞，根据制造
商的方案使用lipofectamine 3000转染试剂转染细胞。
103.为了建立稳定的细胞系，瞬时转染的细胞在添加了1 mg/ml g418的完全培养基中生长大约20天。之后，使用snap-surface 649染料对新霉素抗性细胞进行染色，并通过流式细胞术进行选择。
104.对于荧光成像，将细胞以50%的汇合度接种在24玻璃底孔板上，并如前所述在24小时后转染。12小时后用完全培养基更换转染培养基。使用olympus fluoview fv3000共聚焦激光扫描显微镜在转染后12、24、36和48小时对细胞进行成像。在成像之前，将细胞与snap-surface 649染料一起孵育30分钟，且然后用温pbs洗涤3次。在成像期间，将细胞以5% co2保持在37℃。eyfp和snap-surface 649通道与20倍物镜同时采集，针对绿色通道使用514 nm激发/527 nm发射波长，且针对红色通道使用651 nm激发/667 nm发射波长。
105.生物分子检测装置zeptosens的薄膜光波导采用标准程序(gatterdam等人, nature nanotechnology, 12(11): 1089-1095, 2017年9月)处理，以用接枝paa-g-peg聚合物对其进行涂层。聚合物的胺基受到光敏phsnppoc基团的保护，以便允许进一步加工。之后，使用前面描述的反应性浸没式光刻工艺在光波导上形成分子图图案。简而言之，聚合物涂层的波导芯片安装在一个定制的支架上，该支架允许相位掩模的对齐。在将相位掩模放置到支架上之后，以405nm波长以2000mj/cm2剂量照射芯片，以从纳米图案的脊上切下光敏基团。将活化的胺位点与bg-gla-nhs或bc-gla-nhs底物一起温育，以分别结合snap-tag或clip-tag。之后，在紫外光下进行全场照明，以从凹槽和周围去除剩余的光敏基团。所得胺基用grgdspgsc肽官能化。
106.测量将细胞接种到平面波导上100%融合，并在完全培养基中附着2-3小时，同时将平面波导保持在细胞培养箱内。之后，将培养基更换为hepes缓冲的完全培养基或hepes缓冲的hbss，调节至ph 7.4。在f3000 zeptoreader上进行测量，在35℃下以5% co2保持。以介于0.1秒和1秒之间的曝光时间使用635 nm激光每15秒采集一次图像。在建立10分钟基线(30幅图像)后，在芯片上进行药理学操作。
107.氨基酸序列