一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物及分离培养方法与流程

1.本发明属于原代细胞分离培养技术领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物及分离培养方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，起源于中胚层，可以分化为中胚层的间质组织。从上世纪60年代，msc首次在骨髓中发现并成功分离培养以来，后续研究者用多种不同的分离培养方法从脂肪、胎盘、脐带、牙髓等组织分离得到间充质干细胞，并发现间充质干细胞在体内外可以分化各种组织细胞，比如骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，还可以刺激组织生长和修复。
3.羊膜是胎盘的最内层，其光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02～0.5mm，在电镜下，其分为五层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，haec)和人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells，hamsc)。羊膜干细胞具有三胚层细胞分化的潜能：外胚层(神经)、中胚层(骨骼肌、心肌、内皮等)、内胚层(胰腺、肝)。相比其他干细胞，羊膜间充质干细胞产量高、增殖能力强，免疫原性低，治疗范围广，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
4.羊膜间充质干细胞原代细胞常用的分离培养方法是酶消化法，但是如何快速、充分提取纯度较高的羊膜间充质干细胞，并且保持细胞的良好干性仍然是目前研究的重点和难点。常规的酶消化法由于提取过程中机械剪切力及消化酶的双重破坏，增殖能力较差，并且组织块的消化时间在大规模生产过程中难于统一量化。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人羊膜间充质干细胞原代细胞的分离用蛋白酶组合物及分离培养方法，可获得大量且纯度较高的原代细胞的同时，保持较高的增殖能力。
6.本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物，包括胰蛋白酶和复合型胶原酶。
7.优选的，所述复合型胶原酶的比活力为0.3～0.4u/ml。
8.本发明提供了一种人间充质干细胞原代细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
9.将羊膜组织细化，经胰蛋白酶消化，得到消化后的羊膜组织块；
10.所述消化后的羊膜组织块经复合型胶原酶消化，加入生理盐水，吹打混匀，分离细胞得到人间充质干细胞原代细胞。
11.优选的，胰蛋白酶的酶液与组织块的体积比为(1～1.5):1；
12.优选的，所述胰蛋白酶的酶液经过预热处理；所述预热处理的温度包括36～38℃。
13.优选的，所述复合型胶原酶的酶液和消化后的羊膜组织的体积比为(0.5～2)：1；
14.所述复合型胶原酶的酶液的酶活力为0.3～0.4u/ml。
15.优选的，所述复合型胶原酶的酶液和消化后的羊膜组织的体积比为(1～1.5)：1。
16.优选的，所述复合型胶原酶消化的时间为75～100min。
17.优选的，所述复合型胶原酶消化的时间为80～90min。
18.本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物，包括胰蛋白酶和复合型胶原酶。本发明采用胰蛋白酶去除羊膜组织中杂质细胞(羊膜上皮细胞)，保证间充质干细胞的纯度；复合型胶原酶主要作用是消化组织，对间充质干细胞损伤较小，首次就能获得大量间充质干细胞原代细胞。实验表明，采用胰蛋白酶和复合型胶原酶配合分离间充质干细胞原代细胞，获得大量的原代细胞，具体为1
×
106个/g羊膜组织～10
×
106个/g羊膜组织。
19.同时获得的原代细胞纯度较高，通过检测间充质干细胞表面抗原，结果表明细胞表面各抗原的阳性率均较高，细胞纯度为98.22％以上，杂细胞率控制在1.2％以下。同时获得的原代细胞形态正常，呈典型的梭形，且细胞生长无异常，增殖能力更强。
20.本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞的分离培养方法，本发明先采用胰蛋白酶消化去除羊膜上皮细胞，再经温和性复合型胶原酶消化，分离得到细胞纯度高且产量较高的间充质干细胞。进一步的，本发明通过调整胰蛋白酶和复合型胶原酶的用量，进一步优化得到产量更高、细胞活性更好且细胞纯度更高的间充质干细胞。此外，针对胰蛋白酶和复合型胶原酶的用量进一步优化得到两次消化的时间，在保证细胞数量和质量的前提下，获得更短的消化时间，有利于缩短分离周期，提高分离效率。
附图说明
21.图1为本发明实施例中胰蛋白酶不同添加体积对细胞细胞形态的影响；
22.图2为本发明实施例中1倍胰蛋白酶添加体积组流式检测结果图；
23.图3为本发明实施例中1.5倍胰蛋白酶添加体积组流式检测结果图；
24.图4为本发明实施例中复合型胶原酶不同添加体积对细胞形态的影响；
25.图5为本发明实施例中0.5倍复合型胶原酶添加体积流式检测结果图；
26.图6为本发明实施例中1倍复合型胶原酶添加体积流式检测结果图；
27.图7为本发明实施例中1.5倍复合型胶原酶添加体积流式检测结果图；
28.图8为本发明实施例中2倍复合型胶原酶添加体积流式检测结果图；
具体实施方式
29.本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物，包括胰蛋白酶和复合型胶原酶。
30.在本发明中，所述胰蛋白酶和复合型胶原酶的配比没有限制，以相对于组织块的相对添加体积为准。本发明对所述胰蛋白酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的胰蛋白酶的来源即可。在本发明实施例中，所述胰蛋白酶购自美国invitrogen公司。鉴于羊膜组织中包含人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，haec)和人羊膜间充质
干细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells，hamsc)。所述胰蛋白酶的作用是消化羊膜组织中的上皮细胞，使上皮细胞从羊膜组织中去除，以便后续采用复合型胶原酶进行酶解时，获得较高细胞纯度的间充质干细胞。
31.在本发明中，所述复合型胶原酶的比活力优选为0.3～0.4u/ml，更优选为0.4u/ml。所述复合型胶原酶中含有的酶的种类包括胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iv等。
32.本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
33.将羊膜组织细化，经胰蛋白酶消化，得到消化后的羊膜组织块；
34.所述消化后的羊膜组织块经复合型胶原酶消化，加入生理盐水，吹打混匀，分离细胞得到人间充质干细胞原代细胞。
35.本发明将羊膜组织细化，经胰蛋白酶消化，得到消化后的羊膜组织块。
36.本发明对所述羊膜组织的来源为人源羊膜组织。所述羊膜组织的获取时间优选为离体24h内的组织。羊膜组织在细化前，优选清洗，去除污物和消毒。
37.在本发明中，所述细化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细化方案即可，例如搅碎，剪切等。细化的程度优选为达到规格为1～2cm
×
1～2cm的组织块即可。所述细化优选在无菌环境下进行。
38.在本发明中，胰蛋白酶的酶液与组织块的体积比优选为(1～1.5):1。胰蛋白酶的用量直接影响消化效果，当胰蛋白酶添加量较高(2倍体积的组织块)或较低(0.5倍体积的组织块)时，均会影响最终分离的间充质干细胞原代细胞的数量，使之达不到生产规模，同时降低原代细胞的增殖能力，此外，胰蛋白酶添加量较低还会导致后续复合型胶原酶的消化时间延长，增加时间成本，且影响细胞质量(高代次细胞增殖变慢)。而本技术保护的添加量范围，不仅控制了后续消化时间，而且保证获得大量的质量合格的原代细胞。
39.在本发明中，所述胰蛋白酶的酶液优选经过预热处理；所述预热处理的温度优选包括36～38℃。预热处理有利于调整胰蛋白酶达到较佳的消化状态，提高消化效率。所述消化时，体系的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述消化时优选伴随振荡，所述振荡的速度优选为200～250rpm，更优选为225rpm。
40.胰蛋白酶消化时间结束后，优选用生理盐水清洗，沥干水分，再次进行胰蛋白酶消化，操作方法与第一次相同，在此不做赘述。
41.得到消化后的羊膜组织块后，本发明将所述消化后的羊膜组织块经复合型胶原酶消化，加入生理盐水，吹打混匀，分离细胞得到人间充质干细胞原代细胞。
42.在本发明中，所述复合型胶原酶的酶液和消化后的羊膜组织的体积比优选为(0.5～2)：1，更优选为1～1.5:1。所述复合型胶原酶的酶液的酶活力优选为0.3～0.4u/ml。所述复合型胶原酶消化以组织块消化至透明的时间为准。实验表明，所述复合型胶原酶消化的时间优选为75～100min，更优选为80～90min，最优选为85min。所述复合型胶原酶消化的时间过长或过短均会影响原代细胞的获得数量，并且会降低获得的原代细胞的增殖能力以及细胞纯度等品质。
43.在本发明中，采用上述分离培养方法制备的间充质干细胞，形态正常，呈梭形，具备典型的细胞表面标志物，具有较强的增殖能力，细胞纯度较高，达到98％以上，获得量较高，能够满足临床需要，而且上述分离培养方法大大缩短的消化时间，降低了生产时间成
本，提高生产效率。
44.下面结合实施例对本发明提供的一种人间充质干细胞原代细胞分离用培养基及分离培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.原代细胞的分离培养
47.1)分离前准备：打开摇床预热至37℃；擦拭超净工作台台面，将试剂、灭菌器械盒经75％酒精擦拭后传入超净工作台；
48.2)准备5个15cm培养皿，分别倒入50ml 0.9％氯化钠注射液，待用；
49.3)将羊膜组织用75％酒精擦拭后，转入超净工作台中的两个15cm培养皿内；
50.4)将羊膜组织上的血迹剥离干净，转移至一个15cm培养皿内，清洗羊膜组织直至无明显血迹为止；
51.5)夹取沥干后的羊膜组织至2个15cm培养皿内，用10cm眼科弯剪将羊膜组织剪成大约1
×
1cm2的组织块，平均转移至两支50ml离心管中；
52.6)向每支离心管中分别加入与羊膜组织等体积的37℃预热后的胰蛋白酶(购自美国invitrogen公司)，拧好盖子并用封口膜封口，上下颠倒混匀5次，放至37℃摇床225rpm转速消化1h；
53.7)将胰蛋白酶消化后的羊膜组织倒入装有50ml 0.9％氯化钠注射液的15cm培养皿中清洗，然后再将羊膜组织沥至无水滴滴落为止，将羊膜组织转移至新的50ml离心管中，第二管羊膜组织重复上述步骤；
54.8)用10ml移液管分别吸取与羊膜组织等体积的0.4u/ml复合型胶原酶至上述离心管内，拧好盖子并用封口膜封口，上下颠倒混匀5次，放至37℃摇床至约95％羊膜组织消化完全为止；
55.9)消化结束后，用10ml移液管分别向50ml离心管中加入0.9％氯化钠注射液至45ml，吹打混匀；
56.10)400g
×
10min，升9降9，室温离心；
57.11)离心后，倒去上清，用10ml移液管分别加入40ml 0.9％氯化钠注射液重悬细胞，吹打混匀；
58.12)400g
×
5min，升9降9，室温离心；
59.13)倒去剩余上清，用70μm细胞筛过滤，吹打混匀，取约100μl细胞悬液进行细胞计数和活率检测，按8.67
×
104/cm2接种细胞至t75培养瓶，每瓶中加入无血清培养基，将培养瓶转至co2培养箱内；
60.14)将培养3d后的原代细胞从co2培养箱内取出，倒掉培养基，加入无血清培养基，继续培养3d后细胞汇合率达到90％左右。
61.实施例2
62.胰蛋白酶加入量的筛选实验
63.将羊膜用预冷的生理盐水洗净凝血后，剪至1cm
×
1cm大小，加入0.5倍、1倍、1.5倍、2倍羊膜组织体积的胰蛋白酶消化组织1h(37℃、150rpm)，消化后的组织块转移至新的培养皿中，用生理盐水清洗后，沥干水分，再次重复消化，获得沥干水分的组织块后转移至新的离心管中添加与消化后的组织块等体积的复合型胶原酶消化，消化至组织块呈透明状
结束，收集消化的间充质干细胞。通过考察细胞数量、细胞形态、细胞纯度等指标，确定胰蛋白酶加入量对羊膜间充质干细胞质量的影响，结果如下。
64.1.细胞数量
65.不同添加体积的胰蛋白酶处理组所得原代细胞的数量、复合型胶原酶的消化时间结果见表1。
66.表1原代细胞消化时间及数量
67.组别0.5倍1倍1.5倍2倍组织量5ml5ml5ml5ml胶原酶消化时间147min90min82min82min原代细胞数量(
×
106)16.4418.3711.013.25
68.从表1中可以看出，等体积的羊膜组织用四种不同体积的胰蛋白酶加入消化组织后，制备出的原代细胞数量有差异，其中0.5倍和1倍组细胞数量明显比1.5倍和2倍体积的细胞数量更多。
69.2.细胞形态
70.将4组收获的间充质干细胞原代细胞等量的原代细胞数量于t225培养瓶中，在37℃、5％co2培养箱中培养7d，观察细胞形态。
71.从图1中可以看出，0.5倍与2倍胰蛋白酶体积两组细胞增殖明显偏少，1倍与1.5倍两组细胞数量无明显差异，4组细胞形态正常，呈梭形。
72.3.细胞纯度
73.等体积的羊膜组织用四种不同体积的胰蛋白酶加入消化组织后，将原代细胞接种至无血清培养基中传代培养3d至p1，取四个组别的羊膜间充质干细胞(1
×
106cell)，流式细胞仪检测其细胞表面抗原。结果见表2。
74.表2流式细胞仪检测羊膜间充质干细胞表面抗原
[0075][0076][0077]
从表2结果可以看出，1倍和1.5倍组细胞纯度均符合要求，且1倍组(cd105：97.91％)大于1.5倍组(cd105：96.37％)；0.5倍和2倍组因细胞增殖数量太少，未进行流式检测。
[0078]
结论：
[0079]
(1)四个不同胰蛋白酶消化体积来处理羊膜组织，导致后续的胶原酶消化时间也不一样，胶原酶消化组织至透明的时间随着胰蛋白酶加入体积的增加，消化时间越短，0.5倍组nb消化时间长达147min，消化时间过长增加了时间成本且会影响细胞质量(高代次时增殖变慢)；
[0080]
(2)从细胞数量来看，等体积的羊膜组织用四种不同体积的胰蛋白酶加入消化组织后，制备出的原代细胞数量有差异，其中0.5倍和1倍组细胞数量明显比1.5倍和2倍体积的细胞数量更多。而将等量原代细胞铺于t225培养瓶中培养7d后，0.5倍与2倍两组细胞增殖明显较少，达不到生产的规模，无法满足临床需要，而1倍与1.5倍两组细胞数量明显较高且无明显差异，符合预期生产要求；
[0081]
(3)流式细胞仪分析羊膜间充质干细胞的纯度，1倍与1.5倍组细胞表面标志物均合格(见图2和图3)。
[0082]
实施例3
[0083]
胶原酶加入量
[0084]
将用1倍羊膜组织体积的胰蛋白酶消化后的羊膜组织用预冷的生理盐水洗净凝血后，剪至1cm
×
1cm大小，加入0.5倍、1倍、1.5倍、2倍羊膜组织体积的复合型胶原酶(提供酶活0.4u/ml)消化组织至透明为止，通过考察细胞数量、细胞形态、细胞纯度指标，确定胶原酶加入量对羊膜间充质干细胞质量的影响。
[0085]
1.细胞数量
[0086]
不同添加体积复合型胶原酶处理组的消化时间和原代细胞数量结果见表1。
[0087]
表1原代细胞消化时间及数量
[0088]
组别0.5倍1倍1.5倍2倍组织量3ml3ml3ml3ml胶原酶消化时间100min85min85min75min原代细胞数量(
×
106)14.127.218.919.5
[0089]
从表1中可以看出，等量的羊膜组织经不同体积胶原酶处理后，制备出的原代细胞数量有差异，其中1倍组细胞数量明显比其他组的细胞数量更多。
[0090]
2.细胞形态
[0091]
按照实施例2中方法培养间充质干细胞原代细胞。从图4中可以看出，等量的羊膜组织经不同体积胶原酶处理后，四组细胞形态均正常，呈梭形，细胞生长无显著差异。
[0092]
3.细胞纯度
[0093]
等量的羊膜组织经不同体积胶原酶处理后，经过原代细胞培养传代至p1，取四个组别的羊膜间充质干细胞(1
×
106cell)，流式细胞仪检测其细胞表面抗原。结果见表2和图5～图8。
[0094]
表2流式细胞仪检测羊膜间充质干细胞表面抗原
[0095][0096]
从表2结果可以看出，四组均符合流式检测要求。
[0097]
综上所述，选择1倍羊膜组织体积的胶原酶消化组织更符合生产工艺需求，相比其他组制备的羊膜间充质干细胞质量更优。
[0098]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。