一种产油微藻的开放式培养方法与流程

1.本发明属于生物质能源技术领域，具体涉及一种产油微藻的开放式培养方法。


背景技术：

2.微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分，可用于食品、医药和能源方面；可以大量积累脂肪酸，有些微藻脂肪酸含量可占干重的30%-60%。利用培养微藻来获得油脂资源，已经成为目前利用太阳能开发可再生资源较热门的研究领域，不仅具有强大的市场潜力，而且具有非凡的社会价值。
3.目前，微藻培养方式有封闭式和开放式两种。封闭式是指采用不同结构的封闭式反应器，如气升式、搅拌式、管式等，生产成本较高，可用于生产高附加值产物或作为开放式培养的种子罐。开放式是指采用开放池培养装置，如跑道池、圆形浅池，它具有技术简单、投资低廉的优点，因此近年来备受研究者的关注。但是，开放式培养容易受到丝状真菌、轮虫、原生动物等敌害生物污染，这些敌害生物在藻类培养液中生长、繁殖。当这些敌害生物数量达到一定的密度时，即对培养藻类的生长繁殖造成影响，被污染后的藻液轻者不利于再扩大培养，重者会导致培养的失败。因此，如何有效地防止敌害生物的污染是微藻规模化培养的一个关键问题。
4.近年来，关于微藻病虫害等敌害生物防治方法已有较多研究。传统的方法第一是采用物理方法如过滤或者酸化的方法杀灭和消除藻类中的敌害生物；其二是通过化学的方法来治理微藻开放式培养中的敌害生物污染；其三是采用生物防治的方法来治理；其四是采用添加植物提取物的方法来治理。
5.cn103773690a公开了一种开放式培养微藻的方法，微藻培养采用常规培养方法和条件，在微藻培养初始时，直接在微藻培养基中添加植物提取物，植物提取物为印楝提取物、川楝提取物和苦皮藤提取物中的一种或几种，添加量为5-80mg/l。该方法可以解决微藻开放式培养中敌害生物污染问题，有效防治开放式培养的杂菌和病虫害污染。但是，该方法需专门制备特定配方植物提取物，提高了培养成本。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种产油微藻的开放式培养方法。本发明方法通过特定的培养方式，解决了微藻开放培养中杂菌污染的问题，不会抑制微藻生长和降低固碳效率。
7.本发明提供的产油微藻的开放式培养方法，包括如下内容：在开放式光生物反应器中加入微藻种子液和微藻培养基，进行光暗交替培养，光反应时通入含co2气体，反应温度为20-35℃；暗反应时通入含co2和no
x
气体，反应温度为5-15℃，交替培养一段时间后，暗反应停止通入no
x
，培养至稳定期，收获微藻细胞。
8.本发明中，所述的微藻为能够耐受no
x
和低温（不高于15℃）的自养单一藻或者混合藻，如可以是纤维藻ss-b7（ankistrodesmus sp.）、小球藻sf-b1（chlorella sp.）、纺锤
纤维藻hc-dy4（ankistrodesmus fusiformis）等中的至少一种，优选纺锤纤维藻hc-dy4（ankistrodesmus fusiformis）。
9.本发明中，所述的纤维藻ss-b7（ankistrodesmus sp.）已经于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 7478，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该藻株已经于cn105713836a中公开，并提交了保藏及存活证明。
10.本发明中，所述的小球藻sf-b1（chlorella sp.）已经于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.11005，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该藻株已经于cn109576158a中公开，并提交了保藏及存活证明。
11.本发明中，所述的纺锤纤维藻hc-dy4（ankistrodesmus fusiformis）已经于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 19981，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
12.本发明中，微藻培养基采用本领域技术人员熟知的bg11培养基、se培养基、bbm培养基等中的任意一种。具体根据微藻的种类确定，微藻培养基和微藻种子液的制备同常规方法。
13.本发明中，微藻种子液的制备方法为：将微藻接种至微藻培养基，在ph值7～9，温度为20～35℃，光照周期24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000lux条件下，振荡培养至对数生长期，制得微藻种子液。
14.本发明中，光生物反应器中加入的微藻种子液与微藻培养基的体积比为1:20～1:5。
15.本发明中，所述的光暗交替培养，光照强度为2000～20000lux，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10～10:14。
16.本发明中，光反应通入的含co2气体中，co2体积含量为5%～40%，优选为5%～20%，不含有no
x
。
17.本发明中，光反应的反应温度为20-35℃，优选为25-30℃。
18.本发明中，暗反应通入含co2和no
x
气体中，co2体积含量为5%～40%，no
x
体积含量为0.03%～0.07%。所述的no
x
为no和/或no2，含co2和no
x
气体可以自制，也可以是烟气或废气，如可以来源于硫磺回收装置焚烧尾气、催化裂化再生尾气等中的至少一种。
19.本发明中，暗反应的反应温度为5-15℃，优选为5-10℃。
20.本发明中，所述的光暗交替培养3-5天后，停止通入no
x
，培养至生长稳定期结束。
21.本发明中，培养完成后经检测，杂菌数低于2.8
×
103个/ml。通过离心、沉降等方式收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本技术发明人在开放式培养纺锤纤维藻hc-dy4的研究中发现，通过本发明所述培养方式，在最终得到的藻液中杂菌数明显降低，在此基础上，发明人对耐受no
x
的纤维藻ss-b7、小球藻sf-b1等同时进行了试验，发现可以抑制杂菌且不影响微藻正常生长。在此基础上，提出了适用于该类微藻的开放式培养方法，解决了微藻开放式培养中杂菌污染的问题，降低了培养成本，适用于规模化培养。
23.（2）本发明培养方式适用于对no
x
和低温具有一定耐受性的自养微藻，对该类微藻本身生长无毒害作用，可以维持微藻的正常生长。
24.（3）本发明培养方式特别适用于纺锤纤维藻hc-dy4的培养，不影响该藻株正常生长，而且提高了油脂含量。
具体实施方式
25.下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
26.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
27.本发明中，所涉及的低温是针对微藻的适宜培养温度20-35℃而言的，一般是不高于15℃。
28.本发明中，气体中co2、no
x
浓度采用烟气分析仪检测。
29.本发明所述的纤维藻ss-b7保藏编号为cgmcc no. 7478，已经于cn105713836a中公开，并提交了保藏及存活证明。所述小球藻sf-b1保藏编号为cgmcc no.11005，已经于cn109576158a中公开，并提交了保藏及存活证明。
30.本发明所述纺锤纤维藻hc-dy4是发明人分离筛选出的新藻种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：cgmcc no. 19981；保藏日期：2020年5月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
31.本发明微藻培养采用bg11培养基，配方如表1和表2所示。
32.表1 bg11培养基
*表2 表1中a5 co solution的组成首先按照表1和表2制备bg11液体培养基，将培养基的ph调节为8.0，然后将微藻分别接种于培养基中。在恒温光照摇床中培养，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000lux，120rpm振荡培养至对数生长期，获得微藻种子液。
33.实施例1（1）在20l开放式光生物反应器中，加入纺锤纤维藻hc-dy4种子液和微藻培养基，种子液的加入量为800ml，微藻培养基加入量为8l，进行光暗交替培养，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000lux，光反应通入气体中co2体积含量为10%，培养温度为30℃；暗反应通入气体中co2体积含量为10%，no体积含量为0.05%，培养温度15℃。
34.（2）光暗交替培养4天后，暗反应通入气体同光反应，不再含no
x
，培养3天后进入稳定期，结束培养，检测杂菌数低于1.7
×
103个/ml。
35.离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量。在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，细胞干重为8.8g/l，油脂含量为细胞干重的50.38%。
36.实施例2同实施例1，不同在于：种子液的加入量为800ml，微藻培养基的加入量为4l，光暗时间比为10:14，光照强度为10000lux，光暗交替培养3天后暗反应通入气体同光反应，不再含no
x
。培养7天结束后经检测，杂菌数低于1.8
×
103个/ml，细胞干重可达到8.5g/l，油脂含量为细胞干重的49.12%。
37.实施例3同实施例1，不同在于：种子液的加入量为400ml，微藻培养基的加入量为8l，光暗时间比为12:12，光照强度为8000lux，光暗交替培养5天后通入气体同光反应，不再含no
x
。培养7天结束后经检测，杂菌数低于1.5
×
103个/ml，细胞干重可达到8.3g/l，油脂含量为细胞干重的49.72%。
38.实施例4
同实施例1，不同在于：光反应培养温度为35℃，暗反应培养温度为10℃。培养结束经检测后，杂菌数低于1.5
×
103个/ml，细胞干重可达到8.7g/l，油脂含量为细胞干重的50.93%。
39.实施例5同实施例1，不同在于：光反应培养温度为25℃，暗反应培养温度为5℃。培养结束经检测后，杂菌数低于1.3
×
103个/ml，细胞干重可达到8.6g/l，油脂含量为细胞干重的51.69%。
40.实施例6同实施例1，不同在于：co2体积含量为5%，no的体积含量为0.07%。培养结束经检测后，杂菌数低于1.2
×
103个/ml，细胞干重可达到8.9g/l，油脂含量为细胞干重的50.56%。
41.实施例7同实施例1，不同在于：co2体积含量为25%，no的体积含量为0.03%。培养结束经检测后，杂菌数低于2.6
×
103个/ml，细胞干重可达到8.4g/l，油脂含量为细胞干重的49.29%。
42.实施例8同实施例1，不同在于：微藻采用纤维藻ss-b7。培养结束经检测后，杂菌数低于2.3
×
103个/ml，细胞干重可达到9.2g/l，油脂含量为细胞干重的42.12%。
43.实施例9同实施例1，不同在于：微藻采用小球藻sf-b1。培养结束后经检测，杂菌数低于2.7
×
103个/ml，细胞干重可达到9.8g/l，油脂含量为细胞干重的43.67%。
44.比较例1同实施例1，不同在于：光反应和暗反应通入相同的只含co2的气体，暗反应不加入no
x
。培养结束后经检测，杂菌数为3.1
×
105个/ml，细胞干重可达到6.9g/l，油脂含量为细胞干重的40.32%。
45.比较例2同实施例1，不同在于：光反应和暗反应通入相同的同时含co2和no
x
的气体，气体中co2和no
x
体积含量同实施例1。培养结束后经检测，杂菌数为1.3
×
103个/ml，细胞干重可达到7.1g/l，油脂含量为细胞干重的40.31%。
46.比较例3同实施例1，不同在于：光反应和暗反应的培养温度均为25℃。培养结束后经检测，杂菌数为3.6
×
105个/ml，细胞干重可达到8.0g/l，油脂含量为细胞干重的40.53%。
47.比较例4同实施例1，不同在于：光反应和暗反应的培养温度均为15℃。培养结束经检测后，杂菌数为2.0
×
103个/ml，细胞干重可达到5.6g/l，油脂含量为细胞干重的49.31%。
48.比较例5同实施例1，不同在于：微藻采用cn106635807a公开的单针藻shj-02，保藏编号为cgmcc no. 10763。培养结束后经检测，杂菌数为2.5
×
103个/ml，细胞干重可达到1.1g/l，油脂含量为细胞干重的20.5%。
49.比较例6同实施例1，不同在于：微藻采用cn107177505a公开的栅藻hcs-02，保藏编号为cgmcc no. 10766。培养结束后经检测，杂菌数为2.4
×
103个/ml，细胞干重可达到2.5g/l，油脂含量为细胞干重的15.6%。