共价有机框架纳米片、生物传感器及其制备方法与应用

1.本发明属于生物传感器技术领域，涉及用于制备生物传感器的共价有机框架纳米片，基于该共价有机框架纳米片制备的生物传感器以及该生物传感器在甲基化dna检测中的应用。


背景技术：

2.共价有机框架纳米片(covalent organic framework nanosheets,cons)具有高比表面积、孔隙率高、高度有序介孔、有机配体丰富以及结构稳定等独特性质，已经被广泛应用于生物医学领域，尤其是蛋白或多肽分离、生物传感器、磁共振成像等方面。现有的共价有机框架纳米片的制备方法主要是基于自上而下的工艺，包括溶剂辅助剥离、自剥离、机械剥离等步骤。这种工艺是先采用溶剂热的方法制备块状的共价有机框架材料，然后通过剥离的方法得到共价有机框架纳米片。尽管上述工艺在共价有机框架纳米片的制备中取得了巨大的成功，但是由于层间π-π相互作用较强，导致纳米片的产率较低从而影响了其应用前景。
3.hua zhang等公开了一种共价有机框架纳米片的制备方法，并给出了该纳米片在dna检测方面的应用；该制备方法首先通过溶剂热的方法制备了以三(4-氨基苯基)胺(tapa)和三(4-甲酰苯基)胺(tfpa)为有机配体的块状的共价有机框架材料，然后在乙醇中超声剥离4h得到相应的共价有机框架纳米片材料(ultrathin two-dimensional covalent organic framework nanosheets:preparation and application in highly sensitive and selective dna detection,j.am.chem.soc.,2017,139,8698-8704,hua zhang)，其中制备块状共价有机框架材料时间为3天，超声剥离时间为4小时以上，所以整个制备周期为至少3天；由于剥离过程损耗较大，所以产率较低，基本不超过10％；而且由于所使用的原料不具备功能性基团，从而缺乏灵活的功能修饰性。相似地，tapas kumar mandal等以相同的制备方法制备了以均苯三甲醛和对苯二胺为有机配体的共价有机框架纳米片材料(sensitive and selective fluorometric determination of dna by using layered hexagonal nanosheets of a covalent organic framework prepared from p-phenylenediamine and benzene-1,3,5-tricarboxaldehyde,microchimica acta,2019,186,833-840)。
4.然而，目前这种共价有机框架纳米片的制备工艺存在制备时间长，过程繁琐，产率低，以及缺乏灵活的功能修饰性等缺点，使得上述基于共价有机框架纳米片对于生物传感器的应用前景并不是十分理想。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种共价有机框架纳米片及其制备方法，在简化制备工艺、提高产率的同时，制备出具有功能可修饰性的共价有机框架纳米片。
6.本发明的另一目的在于提供一种生物传感器及其制备方法，通过后修饰工艺，在制备得到的共价有机框架纳米片中的乙烯基上修饰巯基、金纳米粒子和荧光探针得到生物传感器。
7.本发明的第三个目的在于提供基于共价有机框架纳米片的生物传感器在甲基化dna定量检测中的应用，实现对甲基化dna的高灵敏和高特异性检测。
8.本发明提供的共价有机框架纳米片以1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛为有机配体，然后加入过量的2,4,6-三甲基苯甲醛通过溶剂热法制备得到；具体包括以下步骤：
9.(1)将1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,4,6-三甲基苯甲醛和乙酸溶解于二氧六环中得到第一溶液；
10.(2)将2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛溶解于无水乙醇中得到第二溶液；
11.(3)将第一溶液与第二溶液混合均匀得混合液a，将所得混合液a在密闭容器中于100～150℃反应6～20h，所得反应液经离心、洗涤得到共价有机框架纳米片；
12.混合液a中，所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,4,6-三甲基苯甲醛、2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛的物质的量之比为1:(20～80):1.5，所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛的物质的量之和与乙酸的物质的量之比为1：24。
13.上述共价有机框架纳米片的制备方法，步骤(1)中，两种配体1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛是通过加成反应制备得到共价有机框架纳米片的，其中乙酸作为催化剂，2,4,6-三甲基苯甲醛作为亚胺交换剂促进纳米片形成。在超声条件下，分别将1,3,5-三(4-氨苯基)苯，2,4,6-三甲基苯甲醛，2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛溶解分散均匀，一般超声5～10min即可；所用溶剂二氧六环和无水乙醇的用量需要将物料完全溶解，同时满足体积比二氧六环：无水乙醇＝1:1即可。第一溶液与第二溶液在室温的条件下磁力搅拌至少10分钟混合均匀，然后所得混合液a在密闭容器中反应6～20h，温度为100～150℃；获得的反应液分别经两次离心得到共价有机框架纳米片，首先是通过2000～3000rpm离心得到包含共价有机框架纳米片的上清液，上清液再次在至少1000rmp离心得到固体产物，并对固体产物进行洗涤，即得到共价有机框架纳米片(简称cons纳米片)。洗涤的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料。所制备的cons纳米片保存于无水乙醇中待用。
14.上述共价有机框架纳米片制备方法规避了块状共价有机框架材料的形成。其中，对于2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛有机配体，一方面其为合成共价有机框架的组分之一，同时其剩余的碳碳双键可以为进一步引入巯基作为反应活性位点，引入巯基能更好地促进金纳米粒子在共价有机框架纳米片上的形成。
15.通过上述方法制备的共价有机框架纳米片呈现片状结构，如石墨烯状；其厚度在4.2～4.4纳米左右，尺寸大小在微米级别。
16.本发明进一步提供了一种以上述共价有机框架纳米片为原料制的生物传感器；该生物传感器包括上述共价有机框架纳米片，经巯基修饰于该共价有机框架纳米片表面的金纳米粒子以及修饰于金纳米粒子上的荧光探针。
17.本发明进一步提供了上述生物传感器的制备方法，首先在共价有机框架纳米片上修饰巯基，然后在巯基修饰的共价有机框架纳米片表面进一步修饰金纳米粒子，再将设计合成的荧光探针通过polya的方法修饰到纳米片中的金纳米粒子上；具体包括以下步骤：
18.(i)制备cons@au
19.该步骤包括以下分步骤：
20.(i1)将偶氮二异丁腈、二硫苏糖醇和cons纳米片加入到复合溶剂中形成混合液b，然后在氮气保护下，将所得混合液b于50～80℃进行巯烯点击，巯烯点击反应完成后对所得反应液进行离心分离，再将离心分离所得固体产物洗涤、干燥后得到巯基修饰的共价有机框架纳米片；
21.(i2)将巯基修饰的共价有机框架纳米片均匀分散于含有氯金酸的溶液得到混合液c，之后将含有硼氢化钠的溶液滴加于上述混合液c中，再在0～4℃条件下搅拌反应12～72h得反应液，继后将所述反应液离心分离，再将离心分离所得固体产物清洗后得到修饰金纳米粒子的共价有机框架纳米片，简称cons@au，保存于去离子水中待用；
22.所述复合溶剂由乙醇与去离子水按照体积比1:1混合均匀得到；cons纳米片、二硫苏糖醇、偶氮二异丁腈的质量比为4:2:1；巯基修饰的共价有机框架纳米片的质量与氯金酸的物质的量之比为100:(1～5)；所述氯金酸与硼氢化钠的物质的量之比为1:(1～20)；质量的计量单位为mg，物质的量的计量单位为mmol；
23.(ii)制备cons@au-probe生物传感器
24.在磁力搅拌下，将修饰金纳米粒子的共价有机框架纳米片和荧光探针于去离子水中孵育8～16h，然后加入孵育缓冲液，继续孵育至少24h得到反应液，再将所述反应液离心分离，离心分离所得固体产物清洗后得到修饰荧光探针的共价有机框架纳米片，简称cons@au-probe生物传感器；
25.所述修饰金纳米粒子的共价有机框架纳米片的质量与荧光探针物质的量之比为1:1，质量的计量单位为mg,物质的量的计量单位为nmol；所述去离子水与孵育缓冲液的体积比为1:1。
26.上述生物传感器的制备方法，步骤(i)中，通过高效率的巯烯点击的方法，将带有巯基的二硫苏糖醇修饰在共价有机框架纳米片表面。该反应需要在无氧的条件下进行，本发明先将偶氮二异丁腈、二硫苏糖醇和cons纳米片加入到含有去离子水和乙醇的复合溶剂中超声混匀得到混合液b；然后采用氮气吹扫方式对混合液b进行除氧，除氧时间约为0.5～2h；再采用抽真空-通氮气的循环操作方式除去反应器内的氧气，一般循环3～5次，每个循环中，先将反应器内抽真空至真空度不大于100pa，然后再通氮气至常压。之后将上述除氧后的混合液b转移至除氧后的反应器中，再在磁力搅拌条件下于50～80℃条件下反应，且混合液b中cons纳米片分散良好、无贴壁现象即可，一般反应时间约为6-24h。反应结束后将反应液进行固液分离、并对分离所得固体产物进行洗涤、干燥即得到巯基修饰的共价有机框架纳米片。洗涤的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料，本发明中采用的洗涤方式为：将分离出的固体产物依次用乙醇和去离子水洗涤，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。然后将巯基修饰的共价有机框架纳米片加入到含有氯金酸的溶液中，在室温下磁力搅拌约12～36h得到混合液c，之后将含有硼氢化钠的溶液滴加入上述混合液c中，滴加时上述混合液c应该置于冰上，同时伴随磁力搅拌，滴加的速度控制在50～100μl每秒，滴加之后在0～4℃条件下搅拌反应12～72h，最后离心分离清洗后得到的修饰了金纳米粒子的共价有机框架纳米片，简称cons@au，保存于去离子水中待用。所述含有氯金酸的溶液为氯金酸溶解于醇中得到；所述含有硼氢化钠的溶液为硼氢化钠溶解于醇中得到；所述醇为甲醇、乙醇或丙醇
等；所述醇的使用量至少为将氯金酸、硼氢化钠溶解。
27.上述生物传感器的制备方法，步骤(ii)中，荧光探针通过polya的方法修饰到纳米片中的金纳米粒子上。所使用的孵育缓冲液为含nacl的pbs缓冲液，所述nacl的浓度为0.05～0.2m。清洗的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料，本发明中采用的清洗方式为：将分离出的固体产物依次用孵育缓冲液和去离子水洗涤，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。
28.通过上述方法制备的生物传感器，其中金纳米粒子均匀地分布于纳米片上，金纳米粒子的尺寸约为3～4纳米，荧光探针通过polya修饰于金纳米粒子上。该共价有机框架纳米片生物传感器具有大的比表面积(107m
2 g-1
)和多孔性能(平均孔径约为2.5nm)，从而有利于对于甲基化dna的检测。
29.本发明进一步提供了所述生物传感器在甲基化dna检测中的应用。所述生物传感器对于甲基化dna检测具有很好的特异性和灵敏度，尤其是在对于结直肠癌病人血浆中目标甲基化dna检测过程中显现出极其优异的性能，在结直肠癌的早期诊断方面表现出巨大的意义。
30.本发明所述生物传感器在检测甲基化dna的操作为：将cons@au-probe生物传感器加入到含有目标甲基化dna和hogg1酶的neb缓冲液中，所得混合物于避光的条件下在摇床上孵育45min，温度为40℃；然后将混合物在95℃条件下灭活5min，再离心处理取上清用荧光光度计测试荧光强度，根据荧光强度可以实现目标甲基化dna的定量分析。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.(1)本发明提供的共价有机框架纳米片制备方法，以1,3,5-三(4-氨苯基)苯、2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛为有机配体，乙酸为催化剂，2,4,6-三甲基苯甲醛为亚胺交换剂，通过加成反应得到共价有机框架纳米片；相对于传统的自上而下的工艺，不仅可缩短制备时间，简化工艺，而且可大幅度提高产率(产率最高可达65％，见具体实施方式部分的表2)，有利于在生物医药领域内推广。
33.(2)本发明提供的共价有机框架纳米片制备方法，以具有可功能修饰的有机配体来构建共价有机框架纳米片，其在纳米片表面含有碳碳双键，可以进一步引入巯基作为反应活性位点，引入巯基能更好地促进金纳米粒子在共价有机框架纳米片上的形成，有利于后期修饰从而构建功能的生物传感器。
34.(3)本发明提供的生物传感器，首先通过巯烯点击反应在共价有机框架纳米片引入巯基，继而修饰金纳米粒子，再在金纳米粒子上修饰荧光探针所制备得到；所述生物传感器具有大的比表面积(107m
2 g-1
)和多孔性能(平均孔径约为2.5nm)，金纳米粒子粒径规整，分布良好，荧光探针修饰简便
35.(4)本发明提供的生物传感器在检测甲基化dna方面表现出选择性高、灵敏度优异等优势，在研究结直肠癌的早期诊断方面具有十分重要的意义，应用前景良好。
附图说明
36.图1为实施例3制备的共价有机框架纳米片的透射电镜(tem)图。
37.图2为实施例3制备的共价有机框架纳米片的原子力显微镜(afm)图。
38.图3为实施例3制备的共价有机框架纳米片的n2吸附/解吸附等温曲线。
39.图4为实施例16制备的cons@au的透射电镜(tem)图，其中插图为金纳米粒子的尺寸分布图。
40.图5为实施例16制备的cons@au的x射线电子能谱(xps)图，其中，(b)为(a)的放大图。
41.图6为实施例3制备的cons纳米片、实施例16制备的cons@au、实施例21制备的cons@au-probe生物传感器的表面电位表征图。
42.图7为cons@au-probe生物传感器对于甲基化dna检测的原理图。
43.图8为cons@au-probe生物传感器检测不同浓度目标甲基化dna时的荧光强度。
具体实施方式
44.以将通过实施例并结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
45.以下实施例中使用的荧光探针外购于上海生工。
46.实施例1-实施例9制备cons纳米片
47.实施例1-实施例9提供的cons纳米片，按照以下步骤制备：
48.(1)将1,3,5-三(4-氨苯基)苯(tab，0.02mmol)，2,4,6-三甲基苯甲醛(tba，0.4-1.6mmol)和乙酸(0.2ml，6m)超声溶解于二氧六环(1ml)中得到第一溶液，并加入到一个5ml的厚壁耐压瓶中；
49.(2)将2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(dva，0.03mmol)超声溶解于无水乙醇(1ml)中得到第二溶液；
50.(3)将步骤(2)得到的第二溶液加入到步骤(1)中厚壁耐压瓶得到混合液a，所得混合液a在室温下磁力搅拌30min，然后密封厚壁耐压瓶置于烘箱中于密闭容器于100～150℃反应6～20h，所得反应液通过2000～3000rpm离心得到包含共价有机框架纳米片的上清液，上清液再次在至少10000rmp离心得到共价有机框架纳米片，最后通过离心的方式用乙醇清洗三遍后保存于无水乙醇中待用，从而得到cons纳米片。
51.上述实施例1-实施例9提供的cons纳米片制备工艺参数见表1所示。
52.表1制备共价有机框架纳米片的原料及其配比和工艺参数
53.[0054][0055]
通过该方法得到的共价有机框架纳米片能够均匀分散在乙醇中，形成稳定的胶体溶液。对得到的共价有机框架纳米片进行tem和afm分析显示，所述共价有机框架纳米片呈现石墨烯状的片状结构，片的厚度在4.3
±
0.13纳米左右，片状的尺寸大小在微米级别。通过调节2,4,6-三甲基苯甲醛加入的量(0.4～1.6mmol)，可以调节得到的共价有机框架纳米片的产率在40％～65％之间，见表2所示。
[0056]
表2实施例1-7制备的共价有机框架纳米片产率
[0057]
实施例实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例7产率(％)45536558494340
[0058]
从表1及表2可以看出，通过调控2,4,6-三甲基苯甲醛的加入量可以控制共价有机框架纳米片的产率，在实施例3中，当加入1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,4,6-三甲基苯甲醛的物质的量之比为1:40时，共价有机框架纳米片的产率最高，达到65％。
[0059]
为了探究共价有机框架纳米片是否制备成功，对实施例3制备的共价有机框架纳米片的形貌尺寸和微观结构进行了透射电子显微镜(tem)表征，如图1所示：制备的共价有机框架纳米片呈现典型的石墨烯状的片状结构，片状的尺寸大小在微米级别。然后通过原子力显微镜测试共价有机框架纳米片的厚度，如图2所示，可以明显观测到cons纳米片呈现片状结构，片的厚度在4.3
±
0.13纳米左右。对共价有机框架纳米片进行n2吸附/解吸附测试，测试结果如图3所示，所得n2吸附/解吸附等温曲线表明此共价有机框架纳米片具有大的比表面积和孔隙率，同时孔径分布较窄，大约在2.5nm左右。
[0060]
实施例10-实施例20制备cons@au
[0061]
实施例10-实施例20提供的cons@au制备步骤如下：
[0062]
(i1)将偶氮二异丁腈(5mg)、二硫苏糖醇(10mg)和实施例3制备的共价有机框架纳米片(20mg)依次加入到乙醇(5ml)和去离子水(5ml)形成的复合溶剂中形成混合液b，然后采用氮气吹扫方式对混合液b进行除氧，除氧时间约为1h；再采用抽真空-通氮气的循环操作方式除去反应器内的氧气，一般循环5次，每个循环中，先将反应器内抽真空至真空度不大于100pa，然后再通氮气至常压；再将上述除氧后的混合液b转移至除氧后的反应器中，然后在氮气保护下，将所得混合液b于50～80℃进行巯烯点击6～24h，巯烯点击反应完成后对所得反应液进行离心、洗涤、干燥后得到巯基修饰的共价有机框架纳米片；
[0063]
(i2)将巯基修饰的共价有机框架纳米片(5mg)均匀分散于含有氯金酸(haucl40.05-0.25mmol)的甲醇溶液(6ml)得到混合液c，然后再室温下磁力搅拌24小时，之后将含有硼氢化钠(nabh4，0.1-2mmol)的甲醇溶液(4ml)滴入上述混合液c中(滴加时上述混合液c应该置于冰上，同时伴随磁力搅拌)，再在0～4℃条件下搅拌反应12～72h，继后经离心分离清洗后得到修饰金纳米粒子的共价有机框架纳米片，简称cons@au，保存于去离子水中待用。
[0064]
上述实施例10-实施例20提供的cons@au制备工艺参数见表3所示。
[0065]
表3制备cons@au的原料及其配比和工艺参数
[0066][0067]
表4实施例10-18制备的cons@au金纳米粒子尺寸及分布情况
[0068]
[0069][0070]
从表3、表4中可以看出，通过调控加入haucl4和nabh4的量可以调控合成金纳米粒子的尺寸大小，粒径的均一性、是否发生团聚及在cons纳米片上的分布情况。由于实施例16制备的cons@au最优，因此，选择实施例16制备cons@au进行下一步的荧光探针的修饰。需要说明的是，除了实施例16以外的其它实施例制备的cons@au也是可以修饰荧光探针制备生物传感器的，只是可能会由于金纳米粒子在纳米片上的分布密度较小而导致修饰的荧光探针量少从而影响实际应用效果。
[0071]
为了探究cons@au是否制备成功，对实施例16制备的cons@au进行了透射电子显微镜(tem)表征，如图4所示，金纳米粒子均匀地分布于cons纳米片上，金纳米粒子的尺寸约为3.5
±
0.5纳米。然后对cons@au进行x射线光电子能谱(xps)分析，如图5所示，典型的s2p,au4f
7/2
,andau4f
5/2
特征峰的出现表面巯基，说明金纳米粒子的修饰成功。
[0072]
实施例21制备cons@au-probe生物传感器
[0073]
将实施例16的方案制备cons@au(1mg),荧光探针(1nmol)首先加入到去离子水中(1ml)，于室温下摇床孵育16h，然后加入1ml的孵育缓冲液(10mmpbs，0.1mnacl，ph 7.4)继续于室温下摇床孵育40h，得到含有cons@au-probe生物传感器的孵育液，然后采用离心的方法用缓冲液(10mm pbs，0.1mnacl，ph 7.4)清洗5次后置于去离子水中备用，从而得到cons@au-probe生物传感器。
[0074]
为了表明荧光探针的修饰成功，对cons纳米片、cons@au和cons@au-probe生物传感器的表面电位进行测试，如图6所示：结果表明电位进一步下降，说明带负电的荧光探针
成功地修饰到了cons@au上。
[0075]
综上所述，理化表征证明了cons@au-probe生物传感器成功制备，这种独特的片状结构的生物传感器将有利于在甲基化dna检测中的应用。
[0076]
应用例
[0077]
本发明进一步提供了上述cons@au-probe生物传感器在甲基化dna检测方面的应用，cons@au-probe生物传感器对于甲基化dna检测的原理，如图7所示，目标甲基化dna通过杂交链反应和荧光探针形成双链，因此目标甲基化dna上的甲基化胞嘧啶mc和荧光探针上的goxo形成mc/goxo位点，加入hogg1酶后会剪开mc/goxo位点从而断开荧光探针释放荧光分子，采用荧光光谱分度计检测荧光强度可以实现对于目标甲基化dna的定量，以进一步确定cons@au-probe生物传感器对于甲基化dna的检测效果。
[0078]
应用例1 cons@au-probe生物传感器对于模型甲基化dna的检测
[0079]
取实施例21制备的30μl cons@au-probe生物传感器(0.3mg ml-1
)加入到100μl的1
×
neb缓冲液中(包含1.5u的hogg1，不同浓度的目标甲基化dna)。在避光环境下，上述混合液在40℃的条件下孵育45分钟。然后，置于95℃的条件下灭活处理5分钟。最后上清液通过离心收集，并通过荧光光谱分度计检测。分析结果如图8所示。从图8可以看出，随着目标甲基化dna的浓度增加，测得的荧光强度随之增强，同时在50fm-50pm的浓度条件下，荧光强度和目标甲基化dna的浓度呈现较好的相关性，也就是说可以通过测试荧光强度，然后根据线性公式可以得到目标甲基化dna的浓度，从而实现对于目标甲基化dna的定量检测。
[0080]
应用例2 cons@au-probe生物传感器对于人血浆目标甲基化dna的检测
[0081]
取实施例21制备的30μl cons@au-probe生物传感器(0.3mg ml-1
)加入到100μl的1
×
neb缓冲液中(包含1.5u的hogg1，结直肠癌和健康人血浆提取基因组dna)。在避光环境下，上述混合液在40℃的条件下孵育45分钟。然后，置于95℃的条件下灭活处理5分钟。最后上清液通过离心收集，并通过荧光光谱分度计检测。分析结果如表5所示。从表5可以看出，6个健康人基本是检测不到目标甲基化dna的，而12个结直肠癌病人都能检测到目标甲基化dna，同时通过线性公式可以得到目标甲基化dna的含量，也就是说本发明提供的cons@au-probe生物传感器可以实现结直肠癌的诊断。另一方面，采用临床的试剂盒在相同的样本中检测目标甲基化dna，可以看到有三个结直肠癌病人的检测结果呈现假阴性，说明本发明报道的cons@au-probe生物传感器比临床的试剂盒在结直肠癌的诊断中表现出更优异的性能。
[0082]
表5 cons@au-probe生物传感器和临床试剂盒检测结直肠癌和健康人血浆中目标甲基化dna的结果
[0083][0084]
综上所述，本发明所述的cons@au-probe生物传感器可以实现对于目标甲基化dna的定量检测，因而可以实现对于结直肠癌的早期诊断。
[0085]
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。