一种游离IgE化学发光免疫检测试剂盒的制作方法

一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及抗体检测技术领域，具体涉及一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒。


背景技术：

2.过敏性哮喘是由吸入性抗原与特异性ige结合而导致的一种慢性炎症性呼吸道疾病。吸入性抗原与ige结合形成的复合物与肥大细胞、嗜碱性粒细胞等效应细胞表面的高亲和力受体交联后，可释放炎症介质，从而引起呼吸道收缩和炎性反应。人源化抗ige单克隆抗体奥马珠单抗(omalizumab)是全球首个治疗哮喘的创新性药物，用于治疗中度至重度持续性过敏性哮喘。奥马珠单抗通过与ige分子fc片段cε3结合，抑制ige与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面ige受体(fcεri)结合，从而阻止效应细胞的脱颗粒作用，抑制炎症介质的释放。
3.临床研究数据表明，奥马珠单抗给药后，血清游离ige水平与临床表现，包括总哮喘症状评分、早晨呼气峰流量以及急救药物使用量均具有高度的相关性。同时，哮喘的临床症状随着游离ige回归基线浓度而再次出现。目前普遍认为，奥马珠单抗给药后，血清游离ige浓度的降低可作为奥马珠单抗的药效学替代标志物。此外，总ige虽并非直接与药效学结果相关，但是总ige水平可以说明奥马珠单抗对于体内ige的清除规律和分布规律的改变。
4.因此，在抗ige抗体药物的临床前评价中，考察血清中游离ige和总ige水平，对于整体评价药物的药效学性质、药动学-药效学(pharmacokinetic-pharmacodynamic，pk-pd)、毒理学评价，或者与原研药物之间的相似性或优劣性具有极大的意义，并且可以对后期临床药理学评价中的生物标志物的研究，提供重要的数据和理论支持。
5.目前，国内外文献对于血清中游离ige和总ige水平检测方法没有详细的描述，市售试剂盒无法区分游离ige和总ige，对抗ige抗体的临床前评价中的相关检测造成很大困扰。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种能够定量检测游离ige的试剂盒。
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
8.一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂和r3试剂，
9.所述的r1试剂为含有生物素标记的fcεri/fcεria蛋白和第一保护剂的缓冲液，所述的第一保护剂包括含量为所述的r1试剂的总质量的0.4％～0.6％的酪蛋白、含量为所述的r1试剂的总质量的0.2％～0.5％的动物血清和含量为所述的r1试剂的总质量的0.1％～0.3％的牛血清蛋白，所述的生物素标记的fcεri/fcεria蛋白的含量为0.02～0.08μg/ml；
10.所述的r2试剂为含有发光标记物标记的抗人ige抗体和第二保护剂的缓冲液，所述的第二保护剂包括含量为所述的r2试剂的总质量的0.5％～0.8％的酪蛋白和含量为所述的r2试剂的总质量的0.2％～0.5％的动物血清，所述的发光标记物标记的抗人ige抗体的含量为0.08～0.12μg/ml；
11.所述的r3试剂为含有链霉亲和素标记的磁微粒子的缓冲液，所述的链霉亲和素标记的磁微粒子的含量为所述的r3试剂的总质量的0.5～2％。
12.优选地，所述的动物血清为胎牛血清和马血清的组合物，所述的胎牛血清和所述的马血清的质量比为10～20:1。
13.进一步优选地，所述的胎牛血清和所述的马血清的质量比为14～16:1。
14.优选地，所述的第一保护剂还包括含量为所述的r1试剂的总质量的0.1％～0.3％的聚乙二醇6000和含量为所述的r1试剂的总质量的1％～2％的海藻糖。
15.优选地，所述的r1试剂使用的缓冲液为tris缓冲液。
16.优选地，所述的r2试剂使用的缓冲液为hepes缓冲液。
17.优选地，所述的r3试剂采用的缓冲液为pbs缓冲液。
18.优选地，所述的r1试剂的ph值为7.5～8.5。
19.优选地，所述的r2试剂的ph值为6～7。
20.优选地，所述的r3试剂的ph值为6.5～7.5。
21.优选地，所述的生物素标记的fcεri/fcεria蛋白中所述的生物素和所述的fcεri/fcεria蛋白的质量比为1：8～20。
22.优选地，所述的发光标记物标记的抗人ige抗体中所述的抗人ige抗体和所述的发光标记物的质量比为1：1～5。
23.优选地，所述的发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、碱性磷酸酶或三联吡啶钌。
24.优选地，所述的磁微粒子的粒径为0.8～1.5μm。
25.优选地，所述的r1试剂还包括含量为50～200mmol/l的盐类、含量为所述的r1试剂的总质量的0.01％～0.1％的防腐剂、含量为0.1～0.5mg/ml的hbr-1阻断剂以及含量为0.5～1％的表面活性剂。
26.优选地，所述的r2试剂还包括含量为50～200mmol/l的盐类、含量为所述的r2试剂的总质量的0.05％～0.1％的防腐剂、含量为0.01～0.05mg/ml的碱性磷酸酶阻断剂以及含量为0.5～1％的表面活性剂。
27.根据一些具体实施方式，所述的r1试剂组成成分为：
[0028][0029][0030]
所述的r2试剂组成成分为：
[0031][0032]
所述的r3试剂组成成分：
[0033][0034]
进一步优选地，所述的盐类为nacl、kcl、mgcl2中的一种或多种。
[0035]
进一步优选地，所述的防腐剂为proclin300。
[0036]
进一步优选地，所述的表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚、曲拉通x-100、吐温20、吐温-80中的一种或多种。
[0037]
优选地，所述的游离ige化学发光免疫检测试剂盒还包括校准品，所述的校准品包括浓度分别为0.00ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25.00ng/ml、50.00ng/ml、100.00ng/ml、200.00ng/ml和400.00ng/ml的游离ige溶液。
[0038]
优选地，所述的游离ige化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述的化学发光底物液为aps-5缓冲液。
[0039]
本发明与现有技术相比具有如下优势：
[0040]
本发明采用磁微粒化学发光免疫分析法，设计了用于游离ige浓度的检测的试剂盒，该试剂盒具有稳定好、准确度高、灵敏度高等优点。
附图说明
[0041]
图1为实施例中的游离ige化学发光检测试剂盒的测试校准品检测相对光单位的
标准曲线，横坐标为校准品浓度，单位为ng/ml，纵坐标为相对光单位(rlu)。
具体实施方式
[0042]
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0043]
本发明提供一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂、r3试剂，
[0044]
所述的r1试剂为含有生物素标记的fcεri/fcεria蛋白和第一保护剂的缓冲液，所述的第一保护剂包括含量为所述的r1试剂的总质量的0.4％～0.6％的酪蛋白、含量为所述的r1试剂的总质量的0.2％～0.5％的动物血清和含量为所述的r1试剂的总质量的0.1％～0.3％的牛血清蛋白，所述的生物素标记的fcεri/fcεria蛋白的含量为0.02～0.08μg/ml；
[0045]
所述的r2试剂为含有发光标记物标记的抗人ige抗体和第二保护剂的缓冲液，所述的第二保护剂包括含量为所述的r2试剂的总质量的0.5％～0.8％的酪蛋白和含量为所述的r2试剂的总质量的0.2％～0.5％的动物血清，所述的发光标记物标记的抗人ige抗体的含量为0.08～0.12μg/ml；
[0046]
所述的r3试剂为含有链霉亲和素标记的磁微粒子的缓冲液，所述的链霉亲和素标记的磁微粒子的含量为所述的r3试剂的总质量的0.5～2％。
[0047]
根据实施例，r1试剂组成成分为：
[0048][0049][0050]
根据实施例，所述的r2试剂组成成分为：
[0051][0052]
根据实施例，所述的r3试剂组成成分：
[0053][0054]
优选地，所述的盐类为nacl、kcl、mgcl2中的一种或多种。
[0055]
优选地，所述的防腐剂为proclin300。
[0056]
优选地，所述的表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚、曲拉通x-100、吐温20、吐温-80中的一种或多种。
[0057]
优选地，所述的r1试剂的ph值为7.5～8.5。
[0058]
优选地，所述的r2试剂的ph值为6～7。
[0059]
优选地，所述的r3试剂的ph值为6.5～7.5。
[0060]
优选地，所述的生物素标记的fcεri/fcεria蛋白中所述的生物素和所述的fcεri/fcεria蛋白的质量比为1：8～20。
[0061]
优选地，所述的发光标记物标记的抗人ige抗体中所述的抗人ige抗体和所述的发光标记物的质量比为1：1～5。
[0062]
优选地，所述的磁微粒子的粒径为0.8～1.5μm。
[0063]
根据实施例，所述的游离ige化学发光免疫检测试剂盒还包括校准品，所述的校准品包括浓度分别为0.00ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25.00ng/ml、50.00ng/ml、100.00ng/ml、200.00ng/ml和400.00ng/ml的游离ige溶液。
[0064]
根据实施例，所述的游离ige化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液为aps-5缓冲液。
[0065]
本发明的游离ige化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测仪器，完成游离ige的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间，检测准确度较高。
[0066]
本发明的游离ige化学发光免疫检测试剂盒的检测方法：
[0067]
以全自动化学发光免疫分析仪(i2900)为检测仪器，试剂盒测定原理是间接法，即仪器依次加入10μl的样本，30μl r1试剂和30μl r3试剂，反应7min后，进行磁分离，并清洗未被结合的物质。再加入50μl r2试剂，反应7min后，进行磁分离，并清洗未被结合的物质，加入发光底物液进行反应，最后记录相对光单位(rlu)。
[0068]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
[0069]
以下实施例和对比例中，若如特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
[0070]
以下实施例和对比例中，链霉亲和素磁珠购自安捷伦科技有限公司(货号pl6727-1001)。
[0071]
以下实施例和对比例中，若如特殊说明，所述的“％”为质量百分比。
[0072]
实施例1
[0073]
本实施例提供一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
[0074]
r1试剂的组成成分：
[0075][0076][0077]
r1试剂的制备方法：
[0078]
生物素标记的fcεri/fcεria蛋白的标记工艺：取440μl dmso加入到2mg活性生物素瓶内，混匀，再取1mg待标记的fcεri/fcεria于超滤管中，并加入适量体积的标记缓冲液定容至0.5ml，使终浓度为2mg/ml，混匀后，高速冷冻离心机离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟，离心后在超滤管中加入33.3μl生物素溶液和466.7μl标记缓冲液，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30分钟，温育后离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟。离心后在超滤管中加入500μl标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，转速12000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次，最后一次离心后在超滤管中加入250μl标记缓冲液并轻轻吹打混匀，转移到离心管内，再加入250μl保存液，即得到0.5ml浓度为2mg/ml生物素标记fcεri/fcεria，2-8℃保存。
[0079]
根据上述r1试剂的组成成分，将生物素标记的fcεri/fcεria蛋白与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r1试剂。
[0080]
r2试剂的组成成分：
[0081][0082][0083]
发光标记物标记的抗人ige抗体0.1μg/ml(发光标记物为吖啶酯，发光标记物和所述的抗人ige抗体的质量比为1:3)。
[0084]
r2试剂的制备方法：
[0085]
化学发光标记物标记的抗人ige抗体标记工艺：将1mg抗人ige抗体放入离心管中，加入碳酸缓冲溶液，终浓度为2mg/ml，充分混匀，混匀后加入10μl 2mg/ml三联吡啶钌的dmf溶液，高速冷冻离心机离心30s，转速12000r/min。将离心管用封口膜密封后放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀4h。再加入0.5ml 30％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀后，封闭2h。将封闭好的抗体用葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pbs缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。
[0086]
根据上述r2试剂的组成成分，将化学发光标记物标记的抗人ige抗体与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r2试剂。
[0087]
r3试剂的组成成分：
[0088][0089]
r3试剂的制备方法：
[0090]
试剂r3的制备：
[0091]
链霉亲和素磁颗粒工艺：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液1ml，加入10ml的tbst溶液充分混匀15分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复此过程清洗3次。加入10ml含50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中，标定浓度为10mg/ml，2℃～8℃保存。
[0092]
根据上述r3试剂的组成成分，将链霉亲和素磁颗粒与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r3试剂。
[0093]
校准品的制备：
[0094]
用血清基质配制浓度为0.00ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25.00ng/ml、50.00ng/ml、100.00ng/ml、200.00ng/ml和400.00ng/ml的游离ige校准品。采用实施例1制备的试剂盒测定校准品，绘制标准曲线，如图1所示，横坐标为校准品浓度，单位为ng/ml，纵坐标为相对光单位(rlu)。
[0095]
对比例1
[0096]
本对比例提供一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
[0097]
r1试剂的组成成分：
[0098]
[0099]
r1试剂的制备方法：
[0100]
生物素标记的fcεri/fcεria蛋白的标记工艺：取440μl dmso加入到2mg活性生物素瓶内，混匀，再取1mg待标记的fcεri/fcεria于超滤管中，并加入适量体积的标记缓冲液定容至0.5ml，使终浓度为2mg/ml，混匀后，高速冷冻离心机离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟，离心后在超滤管中加入33.3μl生物素溶液和466.7μl标记缓冲液，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30分钟，温育后离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟。离心后在超滤管中加入500μl标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，转速12000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次，最后一次离心后在超滤管中加入250μl标记缓冲液并轻轻吹打混匀，转移到离心管内，再加入250μl保存液，即得到0.5ml浓度为2mg/ml生物素标记fcεri/fcεria，2-8℃保存。
[0101]
根据上述r1试剂的组成成分，将生物素标记的fcεri/fcεria蛋白与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r1试剂。
[0102]
r2试剂同实施例1。
[0103]
r3试剂同实施例1。
[0104]
对比例2
[0105]
本对比例提供一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
[0106]
r1试剂同实施例1。
[0107]
r2试剂组成成分：
[0108][0109]
r2试剂的制备方法：
[0110]
化学发光标记物标记的抗人ige抗体标记工艺：将1mg抗人ige抗体放入离心管中，加入碳酸缓冲溶液，终浓度为2mg/ml，充分混匀，混匀后加入10μl 2mg/ml三联吡啶钌的dmf溶液，高速冷冻离心机离心30s，转速12000r/min。将离心管用封口膜密封后放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀4h。再加入0.5ml 30％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀后，封闭2h。将封闭好的抗体用葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pbs缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。
[0111]
根据上述r2试剂的组成成分，将化学发光标记物标记的抗人ige抗体与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r2试剂。
[0112]
r3试剂同实施例1。
[0113]
对比例3
[0114]
本对比例提供一种游离ige化学发光免疫检测试剂盒，其包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
[0115]
r1试剂同实施例1。
[0116]
r2试剂同实施例1。
[0117]
r3试剂组成成分：
[0118][0119]
r3试剂的制备方法：
[0120]
链霉亲和素磁颗粒工艺：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液1ml，加入10ml的tbst溶液充分混匀15分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复此过程清洗3次。加入10ml含50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中，标定浓度为10mg/ml，2℃～8℃保存。
[0121]
根据上述r3试剂的组成成分，将链霉亲和素磁颗粒与其他组分混合，灌封于试剂瓶中，得到r3试剂。
[0122]
1.线性评价：
[0123]
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。采用实施例1、对比例1、对比例2及对比例3制备的试剂盒对每一浓度的样本均重复检测3次，计算平均值，将测定浓度的平均值与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，结果如表1所示。
[0124]
表1
[0125]
[0126][0127]
2、空白限评价：采用实施例1对比例1、对比例2和对比例3制备的试剂盒对零值校准品进行20次测定相对光(rlu)单位，取其平均值减去两倍的标准差，带入标准曲线所得即为空白限；结果如表2所示。
[0128]
表2
[0129]
[0130][0131]
3、重复性评价：采用实施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备的试剂盒对重复性低值(6～10ng/ml)和重复性高值(30～50ng/ml)的两个样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值m、标准差sd以及cv值，结果见表3。
[0132]
表3
[0133][0134][0135]
4、稳定性评价：将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3制备的游离ige化学发光免疫检测试剂盒在2℃～8℃条件下贮存，分别对3个月、6个月、9个月、12个月、15个月时的空白限、线性、重复性指标进行评价，结果表4所示。
[0136]
表4
[0137][0138]
5、临床样本评价：将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3制备的游离ige化学发光免疫检测试剂盒对临床血清游离ige的样本进行检测，结果表5所示。
[0139]
表5
[0140]
[0141][0142]
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。