一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的PBMC分离方法

一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法
技术领域
1.本发明涉及免疫医学技术领域，特别涉及一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法。


背景技术：

2.乳腺癌被认为是免疫“冷”肿瘤，仅有小部分患者对现有免疫检查点抑制剂治疗有效，治疗反应率不佳，因此急需要探索新的有效的免疫治疗方案。
3.在本研究团队的在先申请cn202210012502.0中，提出了伽马干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶gilt在提高t细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的新用途。结果表明，gilt的高表达能够显著增加肿瘤组织中杀伤性t细胞的水平。
4.但上述技术方案中并未涉及pbmc分离的具体方法和所述使用的设备，因此，本技术提出了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法，所述提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法通过使用医用血液离心设备来实现pbmc分离过程中涉及的离心处理；所述医用血液离心设备包括：底座、离心部、闭锁部和辅助部；所述底座固定在工作台上；所述底座上焊接有连接板，且连接板组成了底座的强度强化结构；连接板上插接有两个固定螺栓，且两个固定螺栓均与工作台螺纹连接；连接板底端面高于底座底端面，且二者的高度差为2cm；所述离心部由转轴a、驱动电机、挡座、放置座、密封板和密封垫组成，且转轴a转动连接在底座上；离心部上放置有试管；所述闭锁部由限位座、滚珠、连接臂、受力块、闭锁杆和把手组成，且限位座套接在转轴a上；所述辅助部由转轴b、叶轮和摩擦轮组成，且转轴b共设有两根，并且两根转轴b均转动连接在底座上。
6.可选地，所述底座上螺纹连接有四个支撑座，且四个支撑座共同组成了底座的水平调整结构。
7.可选地，所述驱动电机通过螺栓固定连接在底座底端面，且驱动电机的转动轴与转轴a相连接；转轴a上安装有挡座，且转轴a上还安装有放置座，并且放置座上放置有试管。
8.可选地，所述转轴a上滑动连接有密封板，且密封板底端面黏附有密封垫；密封垫底端面与试管顶端面接触，且密封垫组成了试管的密封结构。
9.可选地，所述限位座底端面呈环形阵列状转动连接有滚珠，且滚珠与密封板顶端面接触；
10.限位座上对称焊接有两根连接臂，且两根连接臂尾端焊接有受力块。
11.可选地，所述闭锁杆螺纹连接在底座上，且闭锁杆头端经过打磨处理，并且经过打磨处理后闭锁杆的头端为半球形结构；
12.闭锁杆头端与受力块接触，且受力块为梯形结构。
13.可选地，所述受力块底端面与固定螺栓顶端面接触，且受力块组成了固定螺栓的
摩擦闭锁结构。
14.可选地，所述底座上通过螺栓固定连接有辅助座，且辅助座上黏附有弹性块；
15.闭锁杆的尾端焊接有把手，且把手外壁呈环形阵列状开设有凹槽；把手与弹性块弹性接触，且实现弹性块组成了把手的摩擦闭锁结构。
16.可选地，每根所述转轴b上均安装有五个叶轮，且每根转轴b上均安装有一个摩擦轮，并且两个摩擦轮均与挡座接触。
17.可选地，两根所述转轴b的顶端面与密封板底端面之间的间距为0.01cm，且密封板组成了转轴b的稳定结构。
18.有益效果
19.通过离心部和辅助部的设置，第一，因每根转轴b上均安装有五个叶轮，且每根转轴b上均安装有一个摩擦轮，并且两个摩擦轮均与挡座接触，从而当挡座转动时叶轮也呈转动状态，进而也就实现了试管内血液的散热；
20.第二，因两根转轴b的顶端面与密封板底端面之间的间距为0.01cm，且密封板组成了转轴b的稳定结构，从而可限制转轴b的离心范围。
21.通过闭锁部的设置，第一，因限位座底端面呈环形阵列状转动连接有滚珠，且滚珠与密封板顶端面接触；限位座上对称焊接有两根连接臂，且两根连接臂尾端焊接有受力块，从而当受力块向下拉紧时可实现密封垫与试管的密封；
22.第二，因闭锁杆螺纹连接在底座上，且闭锁杆头端经过打磨处理，并且经过打磨处理后闭锁杆的头端为半球形结构；闭锁杆头端与受力块接触，且受力块为梯形结构，从而当转动闭锁杆的时候通过闭锁杆的挤压可实现受力块的向下拉动，进而也就实现了密封垫与试管的密封。
23.通过受力块和固定螺栓的配合设置，因受力块底端面与固定螺栓顶端面接触，且受力块组成了固定螺栓的摩擦闭锁结构，从而可实现固定螺栓的防松动。
24.通过支撑座的设置，因底座上螺纹连接有四个支撑座，且四个支撑座共同组成了底座的水平调整结构，从而转动支撑座可实现底座的水平调整，进而也就保证了离心过程中不存在偏心现象。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明的实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
26.下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
27.在附图中：
28.图1是本发明的轴视结构示意图；
29.图2是本发明图1另一方向上的轴视结构示意图；
30.图3是本发明的主视结构示意图；
31.图4是本发明图3的a处放大结构示意图；
32.图5是本发明图3的b处放大结构示意图；
33.图6是本发明图3的c处放大结构示意图；
34.图7是本发明的右视结构示意图；
35.图8是本发明图7的d处放大结构示意图。
36.附图标记列表
37.1、底座；101、连接板；102、固定螺栓；103、支撑座；104、辅助座；105、弹性块；2、离心部；201、转轴a；202、驱动电机；203、挡座；204、放置座；205、密封板；206、密封垫；3、闭锁部；301、限位座；302、滚珠；303、连接臂；304、受力块；305、闭锁杆；306、把手；4、试管；5、辅助部；501、转轴b；502、叶轮；503、摩擦轮。
具体实施方式
38.为了使得本发明的技术方案的目的、方案和优点更加清楚，下文中将结合本发明的具体实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。除非另有说明，否则本文所使用的术语具有本领域通常的含义。附图中相同的附图标记代表相同的部件。
39.实施例：请参考图1至图8：
40.本发明提出了一种提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法，所述提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法通过使用医用血液离心设备来实现pbmc分离过程中涉及的离心处理；所述医用血液离心设备包括：
41.底座1、离心部2、闭锁部3和辅助部5；
42.底座1固定在工作台上；
43.离心部2由转轴a201、驱动电机202、挡座203、放置座204、密封板205和密封垫206组成，且转轴a201转动连接在底座1上；
44.离心部2上放置有试管4；
45.闭锁部3由限位座301、滚珠302、连接臂303、受力块304、闭锁杆305和把手306组成，且限位座301套接在转轴a201上；
46.辅助部5由转轴b501、叶轮502和摩擦轮503组成，且转轴b501共设有两根，并且两根转轴b501均转动连接在底座1上。
47.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，底座1上焊接有连接板101，且连接板101组成了底座1的强度强化结构；
48.连接板101上插接有两个固定螺栓102，且两个固定螺栓102均与工作台螺纹连接；连接板101底端面高于底座1底端面，且二者的高度差为2cm，从而当将固定螺栓102拧紧后连接板101会弹性弯曲，进而通过连接板101的弹力可实现固定螺栓102的防松动。
49.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，底座1上螺纹连接有四个支撑座103，且四个支撑座103共同组成了底座1的水平调整结构，从而转动支撑座103可实现底座1的水平调整，进而也就保证了离心过程中不存在偏心现象。
50.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，驱动电机202通过螺栓固定连接在底座1底端面，且驱动电机202的转动轴与转轴a201相连接；转轴a201上安装有挡座203，且转轴a201上还安装有放置座204，并且放置座204上放置有试管4，从而当驱动电机202转动时可实现试管4内血液的离心。
51.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，转轴a201上滑动连接有密封板205，且密封板205底端面黏附有密封垫206；密封垫206底端面与试管4顶端面接触，且密封垫206组成了试管4的密封结构，从而可实现试管4的辅助密封。
52.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，限位座301底端面呈环形阵列状转动连接有滚珠302，且滚珠302与密封板205顶端面接触；
53.限位座301上对称焊接有两根连接臂303，且两根连接臂303尾端焊接有受力块304，从而当受力块304向下拉紧时可实现密封垫206与试管4的密封。
54.此外，根据本发明的实施例，如图3和图5所示，闭锁杆305螺纹连接在底座1上，且闭锁杆305头端经过打磨处理，并且经过打磨处理后闭锁杆305的头端为半球形结构；
55.闭锁杆305头端与受力块304接触，且受力块304为梯形结构，从而当转动闭锁杆305的时候通过闭锁杆305的挤压可实现受力块304的向下拉动，进而也就实现了密封垫206与试管4的密封。
56.此外，根据本发明的实施例，如图3和图5所示，受力块304底端面与固定螺栓102顶端面接触，且受力块304组成了固定螺栓102的摩擦闭锁结构，从而可实现固定螺栓102的防松动。
57.此外，根据本发明的实施例，如图2所示，底座1上通过螺栓固定连接有辅助座104，且辅助座104上黏附有弹性块105；
58.闭锁杆305的尾端焊接有把手306，且把手306外壁呈环形阵列状开设有凹槽；把手306与弹性块105弹性接触，且实现弹性块105组成了把手306的摩擦闭锁结构，从而你也就实现了把手306的摩擦闭锁。
59.此外，根据本发明的实施例，如图3所示，每根转轴b501上均安装有五个叶轮502，且每根转轴b501上均安装有一个摩擦轮503，并且两个摩擦轮503均与挡座203接触，从而当挡座203转动时叶轮502也呈转动状态，进而也就实现了试管4内血液的散热。
60.此外，根据本发明的实施例，如图3和图6所示，两根转轴b501的顶端面与密封板205底端面之间的间距为0.01cm，且密封板205组成了转轴b501的稳定结构，从而可限制转轴b501的离心范围。
61.所述提高免疫细胞杀伤肿瘤能力的pbmc分离方法可以包括如下步骤：
62.在固定时，首先转动调节支撑座103实现底座1的水平调节，调节好后通过固定螺栓102实现底座1的固定；
63.在使用前，首先将试管4放置在放置座204上，而后拧紧闭锁杆305，此时，因限位座301底端面呈环形阵列状转动连接有滚珠302，且滚珠302与密封板205顶端面接触；限位座301上对称焊接有两根连接臂303，且两根连接臂303尾端焊接有受力块304，从而当受力块304向下拉紧时可实现密封垫206与试管4的密封；因闭锁杆305螺纹连接在底座1上，且闭锁杆305头端经过打磨处理，并且经过打磨处理后闭锁杆305的头端为半球形结构；闭锁杆305头端与受力块304接触，且受力块304为梯形结构，从而当转动闭锁杆305的时候通过闭锁杆305的挤压可实现受力块304的向下拉动，进而也就实现了密封垫206与试管4的密封；
64.在离心过程中，因每根转轴b501上均安装有五个叶轮502，且每根转轴b501上均安装有一个摩擦轮503，并且两个摩擦轮503均与挡座203接触，从而当挡座203转动时叶轮502也呈转动状态，进而也就实现了试管4内血液的散热；
65.在使用过程中，因受力块304底端面与固定螺栓102顶端面接触，且受力块304组成了固定螺栓102的摩擦闭锁结构，从而可实现固定螺栓102的防松动；因两根转轴b501的顶端面与密封板205底端面之间的间距为0.01cm，且密封板205组成了转轴b501的稳定结构，
从而可限制转轴b501的离心范围。
66.除了具体的离心过程以外，pbmc分离的完整过程可以参照cn202210012502.0进行，即包括如下步骤：
67.(1)将收集的血液离心5min，300g，吸弃血浆；
68.(2)将离心后的血细胞沉淀和等体积的pbs置于10ml离心管内，将离心管倒置几次，充分混合血细胞和pbs；
69.(3)将ficoll paque密度梯度分离液瓶倒置数次，充分混匀，使用注射器吸出3ml分离液，添加到15ml离心管中；
70.(4)缓慢将稀释后的血液添加到ficoll paque密度梯度分离液液面上，18℃-20℃，400g离心30min；
71.(5)使用无菌移液管将含有血浆和血小板的上层液体吸走，将单个核细胞层转移到无菌离心管中；
72.(6)吸取6ml pbs加至含有单个核细胞的离心管中，使用无菌移液管将液体混匀，18℃-20℃，400g离心10min；
73.(7)使用移液枪将上清吸走，用6ml pbs重悬细胞，18℃-20℃，400g离心10min；
74.(8)使用移液枪将上清吸走，加入2ml t细胞培养液，轻轻吹打细胞，混匀后移至12孔板中；
75.(9)细胞计数，用t细胞培养基调整pbmc细胞终浓度为每毫升1
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106细胞，按照培养基体积1/1000的比例加入il-2。
76.其中，细胞：人外周血淋巴细胞(pbmc)，t细胞
77.试剂耗材：ficoll paque密度梯度分离液、t细胞培养基、il-2(50-150iu/ml)、cd3/cd28 t细胞激活剂、easyseptm buffer、human cd3 positive selection cocktail ii、easyseptm dextran rapidspherestm 50100、easyseptm magnet、bd pharmingen stain buffer。
78.除了具体的pbmc分离以外，伽马干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶gilt在增强t细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的应用的全部过程可以参照cn202210012502.0进行，包括模型的构建、t细胞分选与激活、gilt增强t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力、高表达gilt明显提高乳腺癌组织中浸润性t细胞的水平等。
79.最后，需要说明的是，本发明在描述各个构件的位置及其之间的配合关系等时，通常会以一个/一对构件举例而言，然而本领域技术人员应该理解的是，这样的位置、配合关系等，同样适用于其他构件/其他成对的构件。
80.以上所述仅是本发明的示范性实施方式，而非用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由所附的权利要求确定。