一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用

一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于病毒技术领域，尤其涉及一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建方法及应用。


背景技术：

2.2015年以来，我国江苏、山东、河北等地区商品肉鸭群(樱桃谷鸭与北京鸭等)发生了不明原因的以雏鸭发育迟缓，上下喙萎缩，舌头外伸、肿胀、向下弯曲为特征的疾病，俗称为鸭“短喙与侏儒综合征”(short beak and dwarfism syndrome,sbds)。该病发病率为10％～30％，严重时可达50％以上，患鸭出栏体重较健康鸭降低20％～30％，严重者仅为正常体重的50％。感染鸭群料肉比显著升高，出栏合格率下降，在抓扑、屠宰过程中喙部、翅部骨骼和胫骨等易发生骨折。疾病发生后本实验室以及国内多个实验室先后证实该病为传染性疾病，其病原为水禽细小病毒，因该病毒跟小鹅瘟(鹅细小病毒)同源性很高(92.7％～97.3％)，故也称之为鸭源鹅细小病毒、鹅细小病毒变异株或新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,ngpv)；同时因其跟番鸭细小病毒同源性较高(81.1％～85.0％)，曾也被称为新型鸭细小病毒，本研究中统一称之为ngpv。1971与1995年，法国与波兰的半番鸭中有发生该病的报道，直到2009年才最终确定病原为ngpv。目前，该病仍在我国养鸭地方广泛发生与流行，同时出现鸭“异常换羽”等临床表现以及半番鸭(表现短喙与侏儒)与鸵鸟(表现为瘫痪，本课题组首次发现)等家禽感染；该病既可通过消化道途径水平传播，也可通过种鸭/种蛋垂直传播，给我国家禽业造成了巨大经济损失。
3.疫病发生后，本课题组2015年从患有sbds的樱桃谷鸭体内分离到ngpv sd株，该病毒可在鸭胚或鸭胚成纤维细胞(def)上增殖，易感鹅胚或鹅胚成纤维细胞(gef)也可以增殖。
4.ngpv与番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus,mdpv)、鹅细小病毒(goose parvovirus,gpv)同属于细小病毒科(parvoviridae)细小病毒亚科(parvovirinae)依赖病毒属(dependovirus)成员。在电镜下ngpv病毒粒子分为实心和空心两种形态，直径为20～24nm，无囊膜，正二十面体对称。ngpv为单股链状dna病毒，基因组全长约5.1kb，含有两个相同的末端重复序列(itr)和两个开放阅读框(orf)。itr对病毒的复制和包装起着重要的作用。左侧开放阅读框编码非结构蛋白ns1及其mrna剪切后产生的ns2，ns1与ns2共同参与病毒的复制与转录。右侧开放阅读框编码通过使用不同的起始密码子和蛋白质水解酶裂解编码三种结构蛋白，vp1、vp2、vp3，这三种结构蛋白以1:1:8的比例构成二十面体衣壳。
5.反向遗传操作技术的基本过程是先获得病毒的全基因组，将其组装至适宜载体上，将构建好的全长质粒通过转染至易感细胞，进而拯救出具有感染性的病毒。反向遗传学技术是开展病毒研究的一个有效的平台，可通过操纵基因组的变化，从而影响相应的表观变化，以此判断这些操作对病毒的影响。建立新型鹅细小病毒的反向遗传操作系统，以此为基础可以对新型鹅细小病毒的毒力、跨种传播机制等开展研究，同样也可对相关疫苗的研
究提供一个有用的平台，但是目前尚未有相关研究和报道。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建及其拯救方法，建立了新型鹅细小病毒的反向遗传学操作系统，为今后进行该病毒的毒力研究、跨种传播机制、相关疫苗研制等提供了技术保障。
7.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
8.本发明提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的制备用引物，具体序列如seq id no.1～14所示。
9.本发明还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的分子标记引物，具体序列如seq id no.15～16所示。
10.本发明还提供了一种含有基因序列如seq id no.1～16所示的引物组合的试剂盒。
11.本发明还提供了一种针对致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株的拯救系统，包括a、b、c1、c2-1、c2-2、d、e七个片段的扩增产物和两种质粒。
12.优选的，所述质粒为psk-xbse和pbluescript ii sk。
13.本发明还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：
14.(1)构建克隆c片段的中间质粒psk-xbse：选取载体pbluescript ii sk，合成基因片段，进行多克隆位点改造，获得含如seq id no.17所示基因片段的pbluescript ii sk质粒，然后转化、培养、鉴定，将阳性菌进行扩繁，提取质粒，作为中间质粒，并命名为psk-xbse；
15.(2)提取ngpv sd第f5代病毒基因组总dna；
16.(3)设计、合成覆盖ngpv sd病毒全基因组的六对重叠引物sega-f、sega-r、segb-f、segb-r、segc1-f、segc1-r、segc2-f、segc2-r、segd-f、segd-r、sege-f、sege-r，其中sega-f含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂，sega-r含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂与sph
ꢀⅰ
、bcl
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限制性内切酶酶切位点，sege-f含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂，sege-r含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂与sph
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限制性内切酶酶切位点，各引物序列如seq id no.1～12所示；在c2片段中引入遗传标记δnco
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，突变引物为1-r、2-f，突变引物序列如seq id no.13～14所示；为扩增含有nco
ꢀⅰ
酶切位点的片段设计rsd-f、rsd-r引物，具体序列如seq id no.15～16所示；
17.(4)分别以sega-f/sega-r、segb-f/segb-r、segc1-f/segc1-r、segd-f/segd-r、sege-f/sege-r为引物，使用高保真酶fastpfu fly dna polymerase对五个片段进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，等到a、b、c1、d、e五个片段。然后以segc2-f/1-r、2-f/segc2-r为引物，使用高保真酶fastpfu fly dna polymerase对c2片段进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，再以回收产物为模板，以segc2-f/segc2-r为引物，使用高保真酶fastpfu fly dna polymerase进行重叠pcr，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，得到c2片段；
18.(5)将质粒pbluescript ii sk使用xho
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
进行双酶切，进行琼脂糖凝胶
电泳，回收目的产物，使用hifi dna assembly mastermix将回收产物与a片段进行同源重组，将连接产物转化至jm110感受态细胞中，经处理、培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，以质粒小提试剂盒qiagen plasmid mini kit提取质粒，将获得的质粒命名为psk-a；将质粒pbluescript ii sk使用ecor
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用hifi dna assembly master mix将回收产物与e片段进行同源重组，将连接产物转化至dh5α感受态细胞中，经处理、培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，以质粒小提试剂盒qiagen plasmid mini kit提取质粒，将获得的质粒命名为psk-e；
19.(6)使用sph
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与bcl
ꢀⅰ
分别对质粒psk-a与b片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-ab，再将其转化至jm110，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，命名为psk-ab(jm110)；使用sph
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
分别对质粒psk-e与d片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-de；
20.(7)使用bcl
ꢀⅰ
与sph
ꢀⅰ
分别对质粒psk-xbse与c1片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至dh5α感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-c1；使用sph
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
分别对质粒psk-c1与c2片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至jm110感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-c；
21.(8)使用xho
ꢀⅰ
与bcl
ꢀⅰ
分别对质粒psk-ab(jm110)与psk-c进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-abc；
22.(9)使用ecor
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与not
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分别对质粒psk-abc与psk-de进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，得到含有完整克隆的质粒，将获得的质粒命名为psk-sd；完成全长质粒的构建并对其进行基因测序，其序列为seq id no.1所示。
23.本发明还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆，所述克隆的基因序列如seq id no.18所示。
24.本发明还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株的拯救方法，首先将重组质粒psk-sd与转染试剂混合，然后以0.3ml/枚量经绒毛尿囊腔与尿囊腔途经转染混合试剂，每枚鸭胚接种质粒量为3.0μg，接着在接种120h收获尿囊液，再经相同途径以0.3ml/枚接种鸭胚进行传代，在120h后收获尿囊液，即得拯救病毒。
25.具体的拯救过程为：以lipofectamine 2000作为转染试剂，将质粒与转染试剂以1:2.5(μg：μl)比例进行混合。取1ml opti-dmem培养基稀释质粒(质粒量为20μg)，轻轻混匀；将lipofectamine 2000轻轻摇匀后，取50μl与950μl的opti-dmem培养基混匀，室温孵育5分钟；将稀释后质粒与稀释后lipofectamine 2000混合，轻轻混匀，室温放置20分钟；以0.3ml/枚量经绒毛尿囊腔与尿囊腔途经转染混合试剂，每枚鸭胚接种质粒量为3.0μg。在接种120h收获尿囊液，再经相同途径以0.3ml/枚接种鸭胚进行传代，在120h后收获尿囊液，得到拯救病毒。
26.本发明还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株拯救病毒的鉴别方法，首先设计遗传标记δnco
ꢀⅰ
引物rsd-f、rsd-r，具体序列如seq id no.15～16所示；然后提取拯救病毒dna；采用rsd-f/rsd-r引物对a、b、c、d、e五个片段进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测和纯化回收，再使用nco
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限制内切酶进行酶切反应；若为拯救病毒则nco
ꢀⅰ
无法切开回收产物。
27.本发明还提供了一种所述引物或所述试剂盒或所述拯救系统或所述新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆在制备致鸭短喙与侏儒综合征新型鹅细小病毒sd株诊断试剂和/或疫苗中的应用。
28.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
29.(1)本发明提供了一种新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆，通过该全长感染性克隆能成功拯救出病毒，并且在全长感染性克隆中引入了遗传标记，且该标记在传代之后依然能稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。
30.(2)本发明通过分段扩增的方法构建了新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆，保证了所获得质粒中细小病毒基因序列的完整性，且使用同源重组的方法构建中间质粒，使得构建步骤更加简洁，同时构建的中间质粒有利于后期一系列基因位点的改造。
31.(3)本发明建立的新型鹅细小病反向遗传学操作系统也可以用于新型鹅细小病毒的毒力分析、跨种传播、相关疫苗研制等。
附图说明
32.图1为实施例1中新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆构建策略示意图；
33.图2为实施例1中ngpv基因组及其酶切位点示意图；
34.图3为实施例1中sd株分段扩增产物的凝胶电泳图；
35.图4为实施例1中psk-sd质粒各基因段扩增的凝胶电泳图；
36.图5为实施例1中psk-sd质粒酶切鉴定的凝胶电泳图；
37.图6为实施例2中拯救病毒的遗传标记鉴定的凝胶电泳图；
38.图7为实施例2中拯救病毒与亲本病毒序列比较图；
39.图8为实施例2中拯救病毒f3代尿囊液western blot鉴定图；
40.图9为实施例2中拯救病毒f3代尿囊液间接免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
41.本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技
术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。
42.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
43.实施例1新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建
44.新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建策略示意图如图1所示。具体过程如下：
45.1.1毒株与鸭胚
46.ngpv sd由河北农业大学兽医生物制品实验室分离并保存，并已将测得的全基因组序列上传至ncbi(genbank序列号：ky511124)，第5代毒用于本研究。
47.1.2中间质粒psk-xbse的构建
48.ngpv sd基因组结构如图2所示，将1-189bp记为a片段、190-585bp记为b片段、586-4470bp记为c片段、4471-4868bp记为d片段、4869-5053bp记为e片段。选择sph
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酶切位点作为itr分别克隆的中间克隆位点，以便完整克隆itr。但由于c片段较长，且c片段中间位置同样具有sph
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酶切位点，因此构建含有sph
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酶切位点的中间质粒psk-xbse，帮助c片段的克隆。
49.具体实施方法如下：
50.合成基因片段，基因序列如seq id no.17所示，使用xho
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与ecor
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限制性内切酶对pbluescript ii sk质粒进行双酶切，使用t4 dna ligase与相应片段进行连接，转化至jm110感受态细胞中进行培养，挑取单个菌落进行培养后，提取质粒使用sph
ꢀⅰ
限制性内切酶进行酶切鉴定，将阳性菌进行扩繁，提取质粒。
51.1.3 ngpv sd第f5代病毒基因组总dna的提取
52.将ngpv sd f5代尿囊液使用dna提取试剂盒进行总dna提取，提取后置于-20℃冰箱中备用。
53.1.4引物设计与合成
54.根据ngpv sd全基因序列，依据选取的酶切位点设计相应引物。因选取sph
ꢀⅰ
酶切位点，导致3’与5’itr需分别构建后再组合，c片段亦然。sega-f含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂，sega-r含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂与sph
ꢀⅰ
、bcl
ꢀⅰ
限制性内切酶酶切位点，利用同源重组技术将a片段连接入pbluescript ii sk质粒，构建psk-a中间质粒，同时引入sph
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、bcl
ꢀⅰ
酶切位点；sege-f含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂，sege-r含有与pbluescript ii sk质粒的同源臂与sph
ꢀⅰ
限制性内切酶酶切位点，构建psk-e中间质粒，同时引入sph
ꢀⅰ
酶切位点；segb-f、segb-r、segc1-f、segc1-r、segc2-f、segc2-r、segd-f、segd-r引物可完整扩增相应片段且具有保护性碱基，增加酶切概率；各引物序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示；同时为在c2片段中引入遗传标记δnco
ꢀⅰ
，设计突变引物为1-r、2-f，可将基因组第3807位碱基c突变为碱基a，突变后的密码子aca与突变前的密码子acc均编码同一氨基酸(t)，属于同义突变，不影响基因表达，点突变后去除ccatgg的nco
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限制性内切酶识别序列。突变引物序列如seq id no.13、seq id no.14所示；为扩增含有nco
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酶切位点的片段设计rsd-f、rsd-r引物，引物序列如seq id no.15、seq id no.16所示；引物由上海生工生物技术有限公司合成，使用时用无核酸酶的水将其稀释到10μm。各引物序列具体信息如表1所示。
55.表1扩增引物、突变引物以及分子标记引物序列详情
[0056][0057][0058]
1.5 ngpv sd各基因片段的pcr扩增
[0059]
以ngpv sd f5代dna为模板，分别以sega-f/sega-r、segb-f/segb-r、segc1-f/segc1-r、segc2-f/1-r、2-f/segc2-r、segd-f/segd-r、sege-f/sege-r为引物，使用高保真酶fastpfu fly dna polymerase对五个片段进行pcr扩增，对pcr扩增产无进行检测和纯化回收，得到a、b、c1、c2-1、c2-2、d、e七个片段，分别对应于图2中的1-189bp片段(a)、190-585bp片段(b)、586-2359bp片段(c1)、2360-3806bp片段(c2-1)、3807-4470bp片段(c2-2)、4471-4868bp片段(d)、4869-5053bp片段(e)。扩增体系为fastpfu fly buffer 10μl、2.5mm dntps 5μl、forward primer(10mm)2μl、reverse primer(10mm)2μl、fastpfu fly dna polymerase 1μl、模板5μl、ddh2o 25μl；扩增条件为：95℃ 3min 1个循环；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min 30个循环；72℃ 10min 1个循环。扩增后经1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，电泳图如图3所示，其中m为dl2000 marker；1为由sega-f/sega-r扩增的a片段(253bp)；2为由segb-f/segb-r扩增的b片段(416bp)；3为由segc1-f/segc1-r扩增的c1片段(1800bp)；4为由segc2-f/1-r扩增的c2-1片段(1703bp)；5为由2-f/segc2-r扩增的c2-1片段(691bp)；6为由segd-f/segd-r扩增的d片段(407bp)；7为由sege-f/sege-r扩增的e片段(237bp)。
[0060]
使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。以c2-1与c2-2回收产物为模板，以segc2-f/segc2-r为引物，使用高保真酶fastpfu fly dna polymerase进行重叠pcr，扩增程序为：取pcr管，加入fastpfu fly buffer 10μl、2.5mm dntps 5μl、fastpfu fly dna polymerase 1μl、c2-1与c2-2回收产物各5μl、ddh2o 20μl；进行pcr，pcr程序为：95℃ 3min 1个循环；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min 10个循环；72℃ 10min1个循环，然后取出pcr管加入forward primer(10mm)2μl、reverse primer(10mm)2μl；进行pcr，pcr程序为：95℃3min 1个循环；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min 20个
循环；72℃ 10min 1个循环。扩增后经1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收，得到c2片段。
[0061]
1.6 psk-a质粒的构建
[0062]
将质粒pbluescript ii sk使用xho
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用hifi dna assembly master mix将回收产物与a片段进行同源重组，按说明书构建总体积为20μl的反应体系，50℃反应1h。将连接产物全部转化至100μl jm110感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰盒上冰浴30min，42℃水浴锅中热击1min后，立即置于冰盒上冰浴3min，加入无抗lb 500μl，37℃、200r/min震荡培养1h，4000rpm离心1min，弃约500μl上清，将沉淀吹吸混匀后全部吸出，用涂布棒均匀涂布在lb/amp 固体平板上，待其完全吸收后，将倒置的培养皿过夜培养于37℃培养箱中。挑取单个菌落于lb/amp 液体培养基中，以m13引物进行鉴定。选择经pcr检测结果为阳性的菌落，提取质粒，进行测序。经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，以质粒小提试剂盒qiagen plasmid mini kit提取质粒，将获得的质粒命名为psk-a；
[0063]
1.7 psk-ab质粒的构建
[0064]
使用sph
ꢀⅰ
分别对质粒psk-a与b片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将目的片段再分别经bcl
ꢀⅰ
对质粒psk-a与b片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物。将目的产物构建10μl t4 dna ligase连接体系，16℃连接过夜，连接产物全部转化至100μl hb101感受态细胞中进行培养，挑取单个菌落于lb/amp 液体培养基中，以m13引物进行鉴定。选择经pcr检测结果为阳性的菌落，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-ab，再将其转化至jm110，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，命名为psk-ab(jm110)；
[0065]
1.8 psk-c质粒的构建
[0066]
使用sph
ꢀⅰ
分别对质粒psk-xbse与c1片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将目的片段再分别经bcl
ꢀⅰ
对质粒psk-xbse与c1片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物。将目的产物构建10μl t4 dna ligase连接体系，16℃连接过夜，连接产物全部转化至100μldh5α感受态细胞中进行培养，挑取单个菌落于lb/amp 液体培养基中，以m13引物进行鉴定。选择经pcr检测结果为阳性的菌落，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-c1；使用sph
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
分别对质粒psk-c1与c2片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物。将目的产物构建10μl t4 dna ligase连接体系，16℃连接过夜，连接产物全部转化至100μl jm110感受态细胞中进行培养，挑取单个菌落于lb/amp 液体培养基中，以m13引物进行鉴定。选择经pcr检测结果为阳性的菌落，提取质粒，进行测序。经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-c。
[0067]
1.9 psk-abc质粒的构建
[0068]
使用xho
ꢀⅰ
分别对质粒psk-ab与psk-c片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将目的片段再分别经bcl
ꢀⅰ
对质粒psk-xbse与c1片段产物进行单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物。将目的产物构建10μl t4 dna ligase连接体系，16℃连接过夜，连接产物全部转化至100μl hb101感受态细胞中进行培养，挑取单个菌落于lb/amp 液体培养基中，进行鉴定。选择经pcr检测结果为阳性的菌落，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-abc；
[0069]
1.10 psk-e质粒的构建
[0070]
将质粒pbluescript ii sk使用ecor
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用hifi dna assembly master mix将回收产物与e片段进行同源重组，将连接产物转化至dh5α感受态细胞中，经处理、培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-e；
[0071]
1.11 psk-de质粒的构建
[0072]
使用sph
ꢀⅰ
与ecor
ꢀⅰ
分别对质粒psk-e与d片段产物进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，将获得的质粒命名为psk-de；
[0073]
1.12 psk-sd质粒的构建
[0074]
使用ecor
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
分别对质粒psk-abc(jm110)与psk-de进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用t4 dna ligase进行连接，转化至hb101感受态细胞中进行培养，选择经pcr检测结果为阳性的菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，得到含有完整克隆的质粒，将获得的质粒命名为psk-sd；
[0075]
构建完成后使用sega-f/sega-r、segb-f/segb-r、segc1-f/segc2-r、segd-f/segd-r、sege-f/sege-r作为引物对质粒psk-sd进行pcr进行鉴定。鉴定结果如图4所示，其中m为dl5000 marker；1为由sega-f/sega-r扩增的a片段(253bp)；2为由segb-f/segb-r扩增的b片段(416bp)；3为由segc-f/segc-r扩增的c片段(3900bp)；4为由segd-f/segd-r扩增的d片段(407bp)；5为由sege-f/sege-r扩增的e片段(237bp)。
[0076]
结果显示：重组质粒psk-sd均可扩增正确目的片段。
[0077]
使用xho
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
对质粒psk-sd进行双酶切同时分别使用xho
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
对质粒psk-sd进行单酶切，结果如图5所示，其中m为dl5000 marker；1为xho
ꢀⅰ
与not
ꢀⅰ
双酶切产生的载体分子(2891bp)和ngpv sd基因组分子(5060bp)；2为xho
ꢀⅰ
单酶切产生的dna片段(7951bp)；3为not
ꢀⅰ
单酶切产生的dna片段(7951bp)。
[0078]
结果显示：酶切后条带均为正确条带。
[0079]
实施例2：新型鹅细小病毒sd株感染性dna的拯救
[0080]
2.1转染
[0081]
以lipofectamine 2000作为转染试剂，将质粒与转染试剂以1:2.5(μg：μl)比例进行混合。取1ml opti-dmem培养基稀释质粒(质粒量为20μg)，轻轻混匀；将lipofectamine 2000轻轻摇匀后，取50μl与950μl的opti-dmem培养基混匀，室温孵育5分钟；将稀释后质粒与稀释后lipofectamine 2000混合，轻轻混匀，室温放置20分钟；以0.3ml/枚量经绒毛尿囊腔与尿囊腔途经转染混合试剂，每枚鸭胚接种质粒量为3.0μg。在接种120h收获尿囊液，再经相同途径以0.3ml/枚接种鸭胚进行传代，在120h后收获尿囊液，得到拯救病毒。
[0082]
2.2拯救病毒遗传标记的酶切鉴定及测序验证
[0083]
收集f3代拯救病毒尿囊液，提取dna，使用rsd-f、rsd-r引物进行扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的产物，使用nco
ꢀⅰ
进行单酶切鉴定。同时使用rsd-f、rsd-r引物对ngpv sd f5病毒尿囊液dna进行扩增，也使用nco
ꢀⅰ
进行单酶切作为对照。酶切后，进行1％琼脂糖
凝胶电泳，结果如图6所示，其中m为dl2000 marker；1为ngpv sd野毒株经rsd-f/rsd-r引物扩增后由nco
ꢀⅰ
单酶切后产生的dna片段；2为拯救病毒鸭胚传代f3代病毒经rsd-f/rsd-r引物扩增后由nco
ꢀⅰ
单酶切后产生的dna片段。
[0084]
结果显示：ngpv sd野毒株经rsd-f/rsd-r引物扩增后由nco
ꢀⅰ
单酶切后产生两个dna片段(分别为822bp和690bp)，而拯救病毒鸭胚传代f3代病毒经rsd-f/rsd-r引物扩增后由nco
ꢀⅰ
单酶切后产生一个dna片段(1490bp)。说明遗传标记δnco
ꢀⅰ
在拯救病毒的传代之后依然能稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。
[0085]
同时将rsd-f、rsd-r引物扩增产物进行测序，结果如图7所示。
[0086]
结果显示：拯救病毒与亲本病毒具有一致的序列，除了在拯救病毒中引入的作为遗传标记的唯一碱基突变(c
→
a)。表明病毒为所拯救病毒，而非污染所致。
[0087]
2.3拯救病毒western blot鉴定
[0088]
收集f3代拯救病毒尿囊液，将其进行2倍浓缩，加入sds上样缓冲液煮沸10min，进行sds-page电泳，回收含有目的片段的蛋白胶，采用湿式电印迹转膜法进行转膜2h；转印膜使用5％脱脂奶粉封闭过夜，将一抗(鼠源抗vp3)用5％脱脂奶粉稀释100倍，室温孵育1.5h，将二抗(羊抗小鼠igg-hrp)用5％脱脂奶粉稀释200倍，室温孵育1.5h，使用dab法显色试剂盒避光显色，结果如图8所示，其中m为180kda marker；1为拯救病毒f3代尿囊液western blot鉴定。
[0089]
结果显示：一抗为鼠源一抗，抗vp3蛋白，约60kda。
[0090]
2.4拯救病毒间接免疫荧光鉴定
[0091]
分别将f3代拯救病毒尿囊液与亲本病毒尿囊液接种于鸭胚成纤维细胞(def)，于感染后36h，以抗ngpv的兔源多抗作为一抗，羊抗兔igg-fitc作为二抗，进行间接免疫荧光鉴定，鉴定结果如图9所示，其中a为拯救病毒鉴定结果；b为亲本病毒鉴定结果；c为阴性对照。
[0092]
结果显示：拯救病毒与亲本病毒均可检测到绿色荧光信号，表明病毒拯救成功。
[0093]
由上述实施例可知，本发明通过分段扩增的方法将新型鹅细小病毒sd株的完整基因组克隆至质粒pbluescript ii sk，获得重组质粒；同时利用重叠pcr将基因组中nco
ꢀⅰ
突变，作为鉴定野毒与拯救病毒的遗传标记；然后将重组质粒与转染试剂混合，通过卵黄囊与尿囊腔途径接种spf鸭胚，获得拯救病毒。本发明建立的新型鹅细小病毒反向遗传操作系统，可用于新型鹅细小病毒毒力分析、跨种传播机制等方向的研究，同时也为研究鸭短喙与侏儒综合征的新型疫苗奠定了基础。
[0094]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。