一种本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法与流程

1.本发明属于烟草繁殖技术领域，尤其涉及一种本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法。


背景技术：

2.目前我国烟草的繁育方式多以播种或分株繁殖为主，烟草种子籽粒较小，每克约11500粒，其种子籽粒较小，较难播种，在生产中一般采用丸粒化种子，进行播种。在科研生产中，因其生育周期短，易观察表情和性状，烟草作为一种模式性植物，在科研中发挥着重要的作用。在科研中一般我们采用传统的组织培养技术，对烟草进行组织培养播种，培养组培苗，进行生根驯化及其移栽。组织培养是烟草生根繁殖的重要方式之一，但传统的组织培养技术存在着诸多问题。如传统组织培养生根采用的培养基以糖为植物体碳源，培养基易污染，导致细菌真菌等微生物的滋生严重，造成污染；由于采用琼脂等有机物质，质地致密，透气性差，不利于组培苗根部呼吸，导致生根不良。为减少污染，只能采用封闭的小型容器，与外界气体交流少，内部环境差，组培苗长势不良，再加上生产周期长，环节多，生根后无法直接移栽，必须先进行驯化炼苗，但在炼苗和后续移栽环节中，都会有大批组培苗死亡，导致组培苗移栽成活率低，成本提高。
3.烟草是一年生或有限多年生草本，全体被腺毛，叶矩圆状披针形、披针形、矩圆形或卵形，顶端渐尖，根粗壮，茎高0.7-2米，基部稍木质化。烟草是喜温作物，水分对烟草十分重要，一是烟草植株高大、叶面宽阔、叶面积系数大，蒸腾作用强烈，需要有较多的水分供应；二是水分影响肥料的有效性；三是水分影响叶片的伸展。水分供应充足时，烟叶细胞膨压较大，能够充分伸展，烟叶叶片得以变长、变宽，结构疏松；烟草全株也可作农药杀虫剂，亦可药用，作麻醉、发汗、镇静和催吐剂；原产于南美洲，中国南北各省区广为栽培。
4.以往采用丸粒化种子，在建园时，这种繁殖方式生长的砧木整齐度较差，树体长势参差不一，导致园貌不齐，给后续果园管理造成诸多不便。而在组培条件下生产的本氏烟草幼苗，长势整齐，且可以按照幼苗株幅大小进行分类栽植，大大减轻了管理难度，省工省力，也降低了管理成本。
5.综上所述，现有技术存在的问题是：传统的组织培养技术生根表现不稳定、炼苗移栽成活率不稳定，成本难以控制等。无糖生根培养可以有效的节约时间、减少移栽成本、操作方便、对根系的损伤小，提高烟草移栽的成活率。传统的组织培养技术存在培养基易污染、一般培养基生根不是特别好且后期移栽成活率低、驯化时间长，成本较高；气候等条件要求较高不适宜较恶劣的地区种植，因此驯化移栽尤为重要，无糖生根培养巧妙的使炼苗和驯化结合起来大大的节约了时间，提高烟草组培苗的缓苗；传统实生繁殖的本氏烟草在成园后树体长势不一，园貌不齐，给后续管理带来诸多不便，成本也相应提高。
6.解决上述技术问题的难度：传统组织培养生根所用的培养基多为含糖的有机物质，十分容易污染，为了降低污染率，不得不采用内部空间较小的培养瓶，这就会导致组培苗内部生长的环境湿度大，与外界基本不进行气体交换，幼苗长势较弱，生根较差。因此，如
果不从根本上解决传统组织培养生根培养基易污染的问题，就无法解决组培苗在炼苗和移栽过程中死亡率居高不下的问题，也就更难实现降低成本、优质高产的目标。
7.解决上述技术问题的意义：如果能从源头上解决组织培养生根培养基易污染的问题，就给使用大型培养箱提供了前提条件，这样培养箱的内部湿度将会降低，使得内外环境可以进行气体交换，改善组培苗的生长环境，有利于组培苗的生长，产出的组培苗长势粗壮，生根较好，无需进行炼苗和驯化，可直接进行移栽，在提高移栽成活率的同时，省去了一个步骤，缓苗周期短且易成活，节约时间，降低生产成本。
8.目前在科研中常用的烟草有本氏烟草和大叶烟草，其性状和表型优良，在科研中其作为科研材料的模式植物，转基因，试验材料的处理等应用，可加科研的快试验进程；同时克服了传统种子实生砧木建园，园貌不整齐的问题，具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法、应用。
10.本发明采用的技术方案是：
11.一种本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法，所述方法包括以下步骤：
12.(1)本氏烟草外植体的选择与接种：将消毒后的本氏烟草种子接种到初代培养基中，将接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养；
13.(2)增殖扩繁培养：将幼苗取出，切除切除根部和植株大叶片，接种到继代培养基中，接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养；
14.(3)无糖生根培养：将蛭石和营养液倒入无糖培养盒中，混匀得到无糖生根培养基；选取本氏烟草幼苗，切除基部愈伤组织，接种到无糖生根培养基中；将接种好的幼苗在室温25
±
2℃的环境下进行暗培养3d，再放到无糖培养专用培养架上，通入二氧化碳气体，在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行无糖生根培养，培养时间为20～25d即可出苗。
15.进一步，所述步骤(1)中，以本氏烟草为材料，在田间收集子粒饱满、无病状、长势优良、发芽力高的种子作为外植体材料。
16.进一步，所述步骤(1)中，种子消毒的步骤为：在超净工作台中，将冲洗后的种子放入75％的酒精中消毒10-15分钟，期间震荡摇晃，将种子用移液枪吸出放入无菌水中冲洗3-5遍。
17.进一步，所述步骤(1)中，将消毒后的种子接种到初代培养基中；将接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养25d～30d。一般情况下5d发芽，再20～25d就可进行扩繁。
18.进一步，初代培养基的组成为：1/2ms 30g/l蔗糖 7-8g/l琼脂，ph5.8-6.2。
19.进一步，所述步骤(2)中：初代外植体培养25d～30d后，进行继代扩繁培养；在超净工作台中，将幼苗取出，切除基部和植株大叶，接种到继代培养基中，接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养25d～30d。
20.进一步，继代培养基的组成为：1/2ms 30g/l蔗糖 7-8g/l琼脂，ph5.8-6.2。
21.进一步，所述步骤(3)中，无糖生根培养基的组成为：蛭石基质和营养液混合，营养液的组成为1/2ms 0.5～1.0mg/l iba，ph5.8～6.0，两者混合后基质的含水量为75～80％，优选基质的含水量为80％。
22.进一步，所述无糖生根培养基按以下方法制备：组装无糖培养盒，并将蛭石放入121℃高温高压灭菌锅中灭菌21min，取出后在65℃烘干箱中烘12h，在无菌条件下称取400g/盒，并配置营养液1000～1100ml/盒，营养液的组成为：1/2ms 0.5～1.0mg/l iba，ph5.8，两者混合后基质含水量为75～80％。
23.进一步，所述步骤(3)优选按以下步骤操作：在超净工作台中，将准备的蛭石和营养液倒入无糖培养盒中，混匀，得到含水量75～80％的无糖生根培养基；选取生长25d～30d、生长较健壮(高2.5.0-4.0cm)，并且生长势一致，带有3-5片及以上叶片、长势良好的本氏烟草幼苗，切除基部愈伤组织，接种到无糖生根培养基中；将接种好的幼苗在室温25
±
2℃下暗培养3d，3d后将幼苗放到无糖培养专用培养架上，通入浓度为800ppm～1300ppm的二氧化碳气体，在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养，培养时间为20～25d即可出苗。
24.上述提及的培养环境参数为试验比较得出，培养基参数也为多次筛选得出的结果，在这些参数下配制培养基和培养幼苗，本氏烟草的长势粗壮，无生长胁迫现象，且生根效果好，根系发达。
25.本技术的初代培养基和继代培养基均没有加入生长素类物质，但生根效果良好，无生长素培养基可节省成本。
26.本发明的另一目的在于提供一种所述的本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法在烟草繁殖中的应用。
27.综上所述，本发明的优点及积极效果为：植物无糖组织培养技术(sugar～free micropropagation)，又称光自养组织培养技术或者光独立组织培养技术，是指利用植物外植体的光合作用，以co2代替糖作为植物体的碳来源，通过输入co2气体，并控制影响幼苗生长发育的光照16h/d温度、湿度等环境因子，促进植株光合作用，增强其光合速率，使幼苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新兴的植物微繁殖技术。
28.本发明的培养基中不含糖，用co2代替糖作为植物体的碳来源，可减少微生物引起的真菌、细菌等微生物的污染；无糖生根技术是生根壮苗驯化的同时进行，其操作方便、过渡期短，不需要清洗根部，可直接移栽到基质中，避免了对根部造成的损伤，从而提高了移栽的成活率；蛭石疏松透气，为烟草的移栽，提供了良好的生存环境，从而提高组培苗的生根率，在无糖生根中充足的二氧化碳，光照、温度、湿度等环境因素，提高了高质量烟草，无糖生根出来的烟草组培苗生根数多且健壮，长势旺盛。无糖组培生产的组培苗，移栽成活率能达到98～99.8％左右，其自养能力远远超过传统组培生根的组培苗，移栽后长势健壮，便于后期的管理，加快本氏烟草的生产的化育苗，为工厂化农业育苗提供了高效的快繁方式，对于组培苗的无性繁殖具有重要的指导意义，其作为科研材料的模式植物，如转基因，试验材料的处理等应用，可加科研的快试验进程。
附图说明
29.图1是本发明实施例提供的本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法流程图。
30.图2无糖生根设备图。
31.图3本氏烟草无糖生根培养25d的幼苗期照片。
32.图4本氏烟草无糖生根培养的组培苗移栽到基质中再生长30d的盛长期照片。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
35.如图1所示，本发明实施例提供的本氏烟草的快速繁殖及无糖生根培养方法包括以下步骤：
36.s101：将消毒后的种子接种到初代培养基中，将接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养；
37.s102：将幼苗取出，切除愈伤组织和底部叶片，接种到继代培养基中，接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下进行培养；
38.s103：将准备的蛭石和营养液倒入无糖培养盒中，混匀；选取本氏烟草幼苗，切除愈伤组织和底部叶片，接种到无糖生根培养基中；将幼苗放到无糖培养专用培养架上，通入二氧化碳气体，在光照16h/d、黑暗8h/d，室温25
±
2℃，光照度为2000～4000lx的环境下进行无糖生根培养。
39.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
40.实施例1
41.第一步，外植体的建立
42.(1)以本氏烟草为材料，在田间收集子粒饱满、无病状、长势优良、发芽力高的种子作为外植体材料；
43.(2)在超净工作台中，将冲洗后的种子放入75％的酒精中消毒10-15分钟，期间震荡摇晃，将种子用移液枪吸出放入无菌水中冲洗3-5遍。
44.(3)将消毒后的种子接种到初代培养基中，培养基的配方为：1/2ms 30g/l蔗糖 8g/l琼脂，ph5.8。将接种好的外植体放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下培养25d。
45.第二步，继代培养
46.初代外植体培养20d～25d后，进行继代扩繁培养。在超净工作台中，将幼苗取出，切除愈伤组织和底部叶片，接种到继代培养基中，继代培养基配方为：1/2ms 30g/l蔗糖 8g/l琼脂，ph5.8。接种好的组培苗放在光照16h/d、黑暗8h/d，光照度为2000～4000lx，室温25
±
2℃的环境下培养25d。
47.第三步，无糖生根培养
48.(1)组装无糖培养盒，并将蛭石放入121℃高温高压灭菌锅中灭菌21min，取出后在
65℃烘干箱中烘12h，在无菌条件下称取400g/盒；配置营养液1100ml/盒，营养液配方为：1/2ms 0.5mg/l iba，ph5.8左右。
49.(2)在超净工作台中，将上述步骤准备的蛭石和营养液倒入无糖培养盒中，混匀，得到含水量80％的无糖生根培养基；选取生长25d～30d、带有5片及以上叶片、长势良好的本氏烟草幼苗，切除愈伤组织和底部叶片，接种到无糖生根培养基中。将接种好的幼苗在室温25
±
2℃下暗培养3d，3d后将幼苗放到无糖培养专用培养架上，通入浓度为800ppm～1300ppm的二氧化碳气体，在光照16h/d、黑暗8h/d，室温25
±
2℃，光照度为2000～4000lx的环境下进行无糖生根培养，培养时间为25d。无糖生根培养25d的幼苗照片如图3所示，可见生长健壮，生根良好。将组培苗移栽到基质中，生长30d的照片如图4所示。
50.无糖生根培养25d后，随机抽取15株统计株高、生根数，所得结果见下表1：
51.表1无糖生根培养25d生理数据统计
[0052][0053]
实施例2
[0054]
操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(3)中无糖生根培养基的基质的含水量为75％。按同样操作培养25d后，随机抽取随机抽取15株统计株高、生根数，平均株高为18.15cm，生根数为101.7/条。
[0055]
幼苗在基质含水量80％的无糖生根培养基中的生长情况优于75％含水量。
[0056]
比较例1
[0057]
操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(3)中无糖生根培养基的基质的含水量为70％。按同样操作培养25d后，随机抽取随机抽取15株统计株高、生根数，平均株高为16.28cm，生根数为77.6/条。
[0058]
比较例2
[0059]
操作步骤同实施例1，所不同的是，步骤(3)中无糖生根培养基的基质的含水量为90％。按同样操作培养25d后，随机抽取随机抽取15株统计株高、生根数，平均株高为15.75cm，生根数为75.7/条。
[0060]
比较例可以看出，基质的含水量过低或过高，都会导致幼苗生长缓慢，生根不良。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。