针对生长抑素受体的多肽偶联药物及其应用的制作方法

1.本发明涉及癌症治疗，特别是胰腺癌治疗过程中所涉及的产品领域，具体涉及针对生长抑素受体的多肽偶联药物及其应用。


背景技术：

2.2021年初，世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布了2020年全球最新癌症负担数据。2020年全球男性新发癌症1007万例，而女性新发癌症923万例。根据数据显示，中国新发癌症人数及癌症死亡人数均位居全球第一。
3.目前，癌症的治疗方法，主要有手术治疗、化疗、放疗等，其中化疗是目前治疗癌症主要手段之一。但是在治疗的过程中，患者存在明显的恶心、呕吐、脱发、消瘦等毒副作用，给患者带来很大的不适感。
4.目前用于癌症化疗的小分子药物，往往在杀伤肿瘤细胞的同时，也会杀伤大量的人体正常细胞，导致患者的免疫力快速下降，毒副作用大。
5.相比于小分子药物，目前正在兴起的单抗药物在癌症治疗方面无疑具有靶向性强的优点。但是，与传统的小分子药物相比，抗体药物的靶点数量相对较少，限制了其在各类疾病治疗中的应用。
6.多肽分子量相对较小，相比于抗体药物，在生产制造过程中，不仅成本较低，而且获得的产品纯度比抗体药物要高很多，相应的药物副作用也比较小，同时生产成本要远远低于抗体药物。多肽药物组织渗透性更强，联合抗癌药物用于肿瘤靶向治疗，具有更好药物靶向传递途径和疗效。目前多肽偶联药物已经成为肿瘤靶向治疗一个新的研究热点。
7.肿瘤靶向肽(tumor homing peptides，thps)是指能够特异的结合到肿瘤细胞和肿瘤血管的多肽，通常是由5～31个氨基酸构成的分子量较小的活性肽。小分子多肽具有如下优点：与抗体相比，克服了抗体存在的异源性问题；分子量较小，易通过生理屏障，有效渗透组织，亲和力高，确保可以高效的浓聚配体；易化学合成，成本低。
8.生长抑素受体(sstr)，在许多肿瘤细胞和肿瘤血管中的表达水平相对较高。这为开发选择性靶向sstr特异性位点的各种细胞毒性偶联药物提供了一种新的思路。一些有效的化疗药物如喜树碱(cpt)、甲氨蝶呤(mtx)、紫杉醇(ptx)和多柔比星(dox)已与生长抑素(sst)类似物完成偶联，相应的药物目前正处于临床研究阶段。
9.这些sstr偶联物将化疗药物输送到受体特异性位点，增强抗肿瘤功效，减少对正常组织的毒副作用，并在一定程度上克服多种耐药性，在癌症治疗上具有非常明显的优势。
10.胰腺癌是所有癌症中生存率相对最低的癌症，其手术切除率低、预后差、病死率高。多年来，胰腺癌的治疗没有过大的进展，也是患者预后差的重要原因之一。
11.吉西他滨是目前胰腺治疗较为常用的化疗药物。但是因为没有实现靶向性治疗，吉西他滨本身对正常细胞的损害较大，因此用药量受到了很大的限制，患者的耐药性以及治疗效果也均不是很理想。


技术实现要素：

12.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供针对生长抑素受体的靶向多肽偶联药物及其应用。
13.本发明第一方面提供针对生长抑素受体的多肽偶联药物，其结构通式如下：
[0014][0015]
其中，x1选自phe、d-phe、tyr和d-tyr中的一种。
[0016]
本发明第二方面提供所述针对生长抑素受体的多肽偶联药物作为癌症特异性靶向治疗药物的应用。
[0017]
本发明第三方面提供一种癌症特异性靶向治疗的药物组合物，其包括所述多肽偶联药物或其组合。
[0018]
进一步地，所述癌症包括胰腺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、喉脑癌、结肠直肠癌、食道癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、视网膜癌、胆囊腺癌、多发性骨髓瘤、腺瘤、各种淋巴瘤或黑色素瘤。
[0019]
优选地，所述癌症为胰腺癌。
[0020]
本发明的有益效果为：
[0021]
1、本发明的多肽偶联药物，相比于小分子抗肿瘤药物而言，作为载体的多肽序列具有对应的靶向性，能够定向的把抗肿瘤药物穿透癌细胞的细胞膜，并完成小分子药物的释放，进行肿瘤的治疗。
[0022]
2、本发明的多肽偶联药物，通过化学合成的方法，多肽序列进行相应的环化，形成稳定构象的多肽序列，这样可以避免多肽在体内的提前降解。
[0023]
3、本发明的多肽偶联药物，在一个药物分子中，引入了两分子的细胞毒性药物吉西他滨，增加了肿瘤药物的治疗效果。
附图说明
[0024]
图1为多肽偶联药物1纯品ms分析图(mw：1854.09)；
[0025]
图2为多肽偶联药物1纯品hplc分析图；
[0026]
图3为多肽偶联药物2纯品ms分析图(mw：1854.09)；
[0027]
图4为多肽偶联药物2纯品hplc分析图；
[0028]
图5为多肽偶联药物3纯品ms分析图(mw：1870.09)；
[0029]
图6为多肽偶联药物3纯品hplc分析图；
[0030]
图7为多肽偶联药物4纯品ms分析图(mw：1870.09)；
[0031]
图8为多肽偶联药物4纯品hplc分析图。
具体实施方式
[0032]
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0033]
实施例1：多肽序列的合成
[0034]
使用fmoc固相多肽合成技术，选择起始树脂wang resin(sub＝0.9mmol/g)50g，加入fmoc-thr(tbu)-oh 10.3g(30mmol)，hobt 4.6g(36mmol)，加入dmap 0.4g(0.3mmol)，加入dic 7.8ml(45mmol)，偶联反应2h后停止反应。用dmf清洗树脂后，再用甲醇收缩树脂、抽干，得到fmoc-thr(tbu)-wang resin 56.3g(sub＝0.5mmol/g)。
[0035]
称取上述fmoc-thr(tbu)-wang resin 40g(20mmol)，按照fmoc固相多肽合成的标准偶联方法(氨基酸投料倍数3倍，偶联体系为hobt/dic)，按照多肽的序列顺序，依次偶联fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-d-trp(boc)-oh、fmoc-phe-oh，fmoc-cys(trt)-oh，偶联完成后，用dcm清洗树脂，甲醇收缩树脂，抽干，然后得到上述肽树脂78.8g。
[0036]
把上述78.8g肽树脂平均分为4份，每份19.7g(5mmol)，分别加入4根固相反应柱，dmf溶胀后，按照上述fmoc固相多肽合成的方法(氨基酸投料倍数3倍，偶联体系为hobt/dic)，分别偶联fmoc-phe-oh(1号柱)、fmoc-d-phe-oh(2号柱)、fmoc-tyr(tbu)-oh(3号柱)、fmoc-d-tyr(tbu)-oh(4号柱)，上述残基偶联完后，继续偶联boc-lys(alloc)-oh。
[0037]
上述偶联完成的肽树脂，加入2.54g(10mmol，2eq)i2的dmf溶液，反应2h，得到cys氧化后形成二硫键的肽树脂。
[0038]
相应的肽树脂如表1：
[0039]
表1
[0040][0041]
实施例2：多肽序列与荧光标记的合成
[0042]
按照实施例1相同的方法，使用fmoc固相多肽合成技术，完成前面肽树脂的偶联。
[0043]
将肽树脂分成四份后，分别偶联fmoc-phe-oh(1号柱)、fmoc-d-phe-oh(2号柱)、fmoc-tyr(tbu)-oh(3号柱)、fmoc-d-tyr(tbu)-oh(4号柱)，上述残基偶联完后，继续偶联fmoc-lys(alloc)-oh，然后按照同样的偶联方法，继续偶联fmoc-ahx-oh(ahx为6-氨基己酸)，然后脱除fmoc之后，偶联荧光素fitc(偶联方法：1.5eq的diea，1.1eq的fitc，反应1小时)。
[0044]
偶联完成后，加入2倍当量的i2/dmf溶液，反应2h，得到cys氧化后形成二硫键的肽树脂。
[0045]
相应的完成荧光标记的肽树脂如表2：
[0046]
表2
[0047][0048]
实施例3：多肽序列与linker的反应
[0049]
实施例1中得到的任意一条肽树脂中，加入40倍当量的苯硅烷，加入1.0倍当量的pd0(ph3p)4，dcm溶剂中反应2小时，选择性脱除lys侧链的alloc保护基团，得到lys侧链氨基裸露的肽树脂。
[0050]
然后加入10倍当量的丁二酸酐和10倍当量的diea，dmf溶剂中反应2小时，完成丁二酸酐与lys侧链氨基的反应。
[0051]
实施例4：吉西他滨与多肽序列形成的多肽偶联药物
[0052]
吉西他滨为一种胞嘧啶核苷衍生物，进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢，临床上用于多种癌症的治疗，对多种实体瘤均有很好的疗效。其化学结构如下式i：
[0053][0054]
相应的多肽偶联药物的化学结构式如下式ii：
[0055][0056]
上述多肽偶联药物结构中，peptide为相应的seq序列1-4中任意一条多肽序列。
[0057]
具体操作为：
[0058]
实施例3得到的四种不同的肽树脂，分别在dmf中加入10倍当量的hosu，然后加入10倍当量的dcc(1.2倍当量)，室温反应8小时，使得丁二酸裸露的羧基形成活泼的osu酯。
[0059]
然后加入6倍当量的吉西他滨和10倍当量的diea，dmf溶剂中反应4小时。dmf清洗后用甲醇收缩树脂，抽干。得到偶联上吉西他滨的肽树脂，分别为21.3g(1号柱)、21.8g(2号柱)、22.5g(3号柱)、22.7g(4号柱)。
[0060]
上述肽树脂分别转移至3l的圆底烧瓶中，加入2200ml的tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2(体积比)的裂解液，室温反应1.5小时，然后倒入无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥得到白色固体的多肽偶联粗品。
[0061]
粗品经过hplc纯化，得到最终的多肽偶联药物1-4的纯品，其ms分析图和hplc分析图如图1-8所示。
[0062]
具体的结果见下表3：
[0063]
表3
[0064]
[0065][0066]
实施例5：荧光标记多肽偶联药物的合成
[0067]
对于实施例2得到的荧光标记肽树脂，采用实施例3和实施例4相同的方法，得到相应的荧光标记多肽偶联药物fitc-多肽偶联药物1-4。
[0068]
实施例6：多肽偶联药物对正常细胞的毒性
[0069]
mtt法检测细胞的存活率。取两种非致瘤的成纤维细胞fibrocyte-1和fibrocyte-2，以每孔104个细胞接种于96孔的培养板，贴壁后分别予以0(对照组)、10、30、100μm的多肽偶联药物1-4。处理24h后，弃去培养液，每孔加入100μl的0.5μm的mtt培养液，并设置dmso为调零孔。37℃避光孵育6小时，弃液后每孔加入100μl的dmso，室温震荡5分钟。用酶联免疫检测仪测定570nm的吸光度值a
570
。细胞存活率(％)＝处理组a
570
/对照组a
570
×
100％。具体的结果见下表4：
[0070]
表4：多肽偶联药物对正常细胞毒性检测结果统计表
[0071][0072][0073]
从上述检测的结果可以看出，对多肽偶联药物1-4对正常细胞的人成纤维细胞基本没有太大的毒性影响，特别在低浓度(30μm)的条件下。其中多肽偶联药物2和药物4在高浓度下对正常细胞有一定的破坏作用，但是药物1和药物3即使在高浓度的条件下，也基本没有太明显影响。这说明，多肽偶联药物1-4对健康细胞无明显毒性。当多肽偶联药物1-4被用作哺乳动物、尤其是人的治疗剂时，事实上非常有可能发生很少的副作用。
[0074]
实施例7：fitc-多肽药物与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定
[0075]
将正常胰腺导管上皮细胞hpde6-c7，以及胰腺癌细胞pcc-1、pcc-2(内部命名)细
胞铺于带有载玻片的24孔板中，放入细胞孵化箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用pbs洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。pbs洗2次，每次5min。用含0.5％的triton x-100的pbs透化10min。pbs洗2次，每次3min。加3％bsa封闭，室温静置20min。加入3μm的fitc-多肽偶联药物，37度静置15min。pbs洗2次，每次3min。加入dab染液，37℃静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜定位fitc-多肽偶联药物在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向作用。
[0076]
按照上述实验方案，观察到，在pcc-1和pcc-2细胞上存在明显的强荧光信号，而在hpde6-c7细胞上检测到荧光信号非常弱，这个观察结果说明上述多肽有较强的胰腺癌特异性靶向作用。
[0077]
实施例8：细胞增殖和细胞存活率的测定
[0078]
以胰腺癌细胞pcc-1、pcc-2作为研究细胞。以每孔0.2ml的体积将约10000个细胞接种到96孔微板中，24小时后，用多肽偶联药物1-4进行处理。在存在多肽偶联药物1-4的条件下，将细胞在co2培养箱中于37℃下孵育48小时。孵育后，将mtt试剂或(3-(4,5-二甲基-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(0.5mg/ml，0.1ml)加入到每个孔中，并在37℃下孵育2小时。然后，mtt所含有的四唑环被活细胞的琥珀酸脱氢酶还原。然后，去除上清液，并加入0.1ml裂解缓冲液(含有10％triton x-100和10％1n hcl的异丙醇)以溶解所形成的蓝紫色甲臜沉淀。几分钟后，在室温下用酶标仪在562nm的检测波长下测定吸光度。使用不含肽的孔来证实对照细胞的存活率。通过处理后细胞的吸光度与对照细胞的吸光度的比率来评估每一种细胞的ic50(多肽偶联药物1-4在这些细胞系上引起50％细胞毒性时的浓度)值，单位μm。
[0079]
具体结果见下表5：
[0080]
表5
[0081]
多肽偶联药物pcc-1(ic50)pcc-2(ic50)135.429.3233.828.7334.626.3430.228.3
[0082]
如上表所示，多肽偶联药物1-4均显著抑制了以上两种胰腺癌肿瘤细胞的增殖。说明本发明的多肽偶联药物1-4相对于现有技术有着对胰腺癌肿瘤细胞良好的抑制效果，可进一步用于肿瘤的相关治疗。
[0083]
实施例9：癌细胞对多肽偶联药物的耐药性
[0084]
将多肽偶联药物1-4分别对癌细胞进行耐药性实验，实验方法为本领域常规的一些实验方法，结果显示该肽具有不诱导快速的耐药过程。
[0085]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。