Mfn2蛋白在作为确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物中的用途

mfn2蛋白在作为确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及mfn2蛋白在作为确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物中的用途。


背景技术：

2.随着经济的发展和信息时代的来临，电磁辐射环境污染已经成为继水污染、空气污染、噪声污染之后的新的第四大公害，其对人体的健康危害备受关注。微波指频率为300mhz至300ghz之间的电磁波，是应用最为广泛的电磁波段。研究发现，微波辐射可引起中枢神经系统损伤，机制未明。作为能量代谢的中心细胞器，线粒体是对微波辐射损伤敏感的细胞器。线粒体动力学，包括线粒体融合和分裂，对线粒体功能发挥重要的调控作用。然迄今，微波辐射对线粒体动力学影响的研究较少，尚缺乏线粒体动力学异常的检测方法。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。
4.需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
5.发明人在线粒体动力学异常的情况下，对已有研究报道与线粒体功能相关的众多蛋白的表达进行研究，发现了一些蛋白的表达出现了上调或下调现象。进一步地，发明人发现，这些蛋白中并非所有的蛋白表达变化均与微波辐射相关，即对微波辐射敏感，例如有些是因为脑卒中、缺血/再灌注、重金属中毒、放疗和化疗等原因导致的线粒体动力学异常，在此条件下检测的某些蛋白表达会变化，但是其微波辐射作用下不会发生表达变化。进而，发明人经过深入研究发现，经微波辐射后，线粒体动力学异常，表现为融合减少、分裂增加，相比于其他蛋白，mfn2蛋白表达显著下调，表明mfn2蛋白对微波辐射敏感，可以作为经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物。
6.为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物。根据本发明的实施例，所述标志物选自mfn2蛋白。发明人经过深入研究发现，经微波辐射后，线粒体动力学异常，表现为融合减少、分裂增加，相比于其他蛋白，mfn2蛋白表达显著下调，表明mfn2蛋白对微波辐射敏感，可以作为经微波辐射后是否出现线粒体异常的标志物。
7.在本发明的另一方面，本发明提出了mfn2蛋白在作为确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物中的用途。
8.在本发明的又一方面，本发明提出了检测mfn2蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常。利用该试剂盒可以检测mfn2蛋白的表达水平，如mfn2蛋白活性或编码mfn2蛋白基因的表达量，从而可以确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常。
9.本发明对于检测mfn2蛋白的试剂不做严格限定，可以根据实际需要灵活选择，例
如是pcr反应所需试剂、免疫印迹法所需试剂等。
10.根据本发明的实施例，所述mfn2蛋白的表达水平降低，是出现所述线粒体动力学异常的指示；所述mfn2蛋白的表达水平未降低，是未出现所述线粒体动力学异常的指示。
11.在本发明的又一方面，本发明提出了mfn2蛋白功能促进剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗经微波辐射后出现线粒体动力学异常所引发的疾病或病症。如前所述，经微波辐射后，线粒体中的mfn2蛋白表达水平显著下调，线粒体动力学异常，表现为融合减少、分裂增加。进而，采用mfn2蛋白功能促进剂以提高mfn2蛋白表达水平，从而有助于预防或治疗经微波辐射后出现线粒体动力学异常。
12.在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：测定生物样本中mfn2蛋白的表达水平；所述mfn2蛋白的表达水平降低，是出现线粒体动力学异常的指示；所述mfn2蛋白的表达水平未降低，是未出现线粒体动力学异常的指示。由此，利用根据本发明的方法可以准确地确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常。
13.根据本发明的实施例，所述生物样本选自脑组织、心脏组织、肺组织、肝组织或肾组织。具体地，脑组织选自神经元。
14.在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定通过微波辐射神经元所构建的线粒体动力学异常的动物模型是否构建成功的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：测定构建的动物模型的中mfn2蛋白的表达水平；所述mfn2蛋白的表达水平降低，是所述动物模型构建成功的指示；所述mfn2蛋白的表达水平未降低，是所述动物模型未构建成功的指示。由此，根据本发明实施例的方法可以准确地确定通过微波辐射神经元所构建的线粒体动力学异常的动物模型是否构建成功的方法。
15.在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建线粒体动力学异常的动物模型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用微波辐射动物；测定所述辐射后动物的中mfn2蛋白的表达水平；选取mfn2蛋白的表达水平降低的动物作为目标动物模型。由此，根据本发明实施例的方法可以准确地构建出线粒体动力学异常的动物模型。
16.根据本发明的实施例，所述微波辐射的参数如下：微波频率为2～3ghz，平均功率密度为20～40mw/cm2，辐射时间为20～40分钟。由此，可以高效地实现线粒体动力学异常。
17.根据本发明的实施例，所述线粒体动力学异常为融合减少，分裂增加。
18.根据本发明的实施例，所述线粒体来源于脑、心脏、肺、肝或肾。具体地，脑选自神经元。
19.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
20.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
21.图1显示了频率为2.856ghz，平均功率密度为30mw/cm2的微波辐射后大鼠海马组织结构的变化，其中：
22.图1a为假辐射组(c组)海马组织结构，可见锥体神经元核大而圆，淡染色；
23.图1b为微波辐射组(r组)海马组织结构，可见部分神经元核固缩深染；
24.图2显示了频率为2.856ghz，平均功率密度为30mw/cm2的微波辐射后海马神经元超微结构的变化，其中：
25.图2a为假辐射组海马神经元超微结构，可见线粒体呈棒状，嵴结构完整，排列整齐；
26.图2b为微波辐射组海马神经元超微结构，可见线粒体肿胀，嵴断裂、消失，线粒体呈碎片化；
27.图3显示了频率为2.856ghz，平均功率密度为30mw/cm2的微波辐射后海马线粒体融合相关蛋白的变化，其中：
28.图3a为mfn1、mfn2、opa1和gapdh蛋白免疫印迹条带；
29.图3b为mfn1、mfn2和opa1蛋白表达量统计图，与c组相比，**示p《0.01。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
31.实施例1对大鼠进行微波暴露
32.采用成年雄性wistar大鼠(6～8周龄)，随机分为假辐射组(c组)和微波辐射组(r组)。将r组大鼠放入固定盒(不含金属物质)之中，置于辐射平台之上，自上而下进行全身暴露，详细参数如下：微波频率为2.856ghz，平均功率密度为30mw/cm2，每辐射15min暂停15min，共辐射3次，总辐射时间为45min，经计算其比吸收率约为10.5w/kg；c组进行同等条件的假辐射。
33.实施例2大鼠海马组织光镜观察
34.于辐射后1d，采用腹腔注射戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，断头，剥离脑组织，放入10％缓冲福尔马林溶液中进行固定，制作石蜡切片，苏木素伊红染色，在光学显微镜下观察组织结构。
35.微波辐射大鼠后1d，c组海马呈正常组织结构，锥体神经元核大而圆，淡染色，见图1a；r组海马部分锥体神经元核固缩深染，见图1b。表明微波辐射可引起海马组织结构损伤。
36.实施例3大鼠海马神经元透射电镜观察
37.于辐射后1d，采用腹腔注射戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，断头处死，取1mm3海马组织块，2.5％戊二醛和1％锇酸双固定，脱水包埋，超薄切片，重金属染色，采用h7650型透射电子显微镜观察并摄像。
38.微波辐射大鼠后1d，通过透射电子显微镜观察发现，c组海马神经元线粒体呈棒状，双层膜结构清晰可见，线粒体嵴结构完整，见图2a；r组海马神经元线粒体肿胀呈圆形，嵴断裂、消失，出现明显的碎片化，见图2b。提示微波辐射可引起海马神经元线粒体结构损伤，融合减少，分裂增加。
39.实施例4大鼠海马组织线粒体融合相关蛋白mfn1、mfn2和opa1检测
40.于辐射后1d，采用腹腔注射戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，断头处死，冰上剥离海马
组织，采用含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液提取海马组织总蛋白，加入蛋白上样缓冲液，加热变性。
41.对研究报道过的与线粒体相关的蛋白进行研究筛选，从中选出十多种蛋白作为待测蛋白采用免疫印迹法进行检测，如mfn1、mfn2、opa1、fundc1、cnx、tomm20、cox等，具体步骤如下：
42.电泳，转膜，加入兔抗待测蛋白单克隆抗体(1:1000)和兔抗gapdh单克隆抗体(1:1000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，常温孵育1h，加入化学发光液显影，暗室胶片成像。采用image j分析蛋白条带的光密度值，计算目的蛋白和gapdh的比值。
43.微波辐射大鼠后1d，免疫印迹结果显示，一些蛋白的表达水平出现上调或下调，也有些蛋白的表达水平未见明显改变，图3示出了其中最具有代表性的三种蛋白表达情况，与c组相比，r组mfn2表达下调最为显著(p＜0.01)，而mfn1和opa1表达未见明显改变(p＞0.05)。由此，选择采用mfn2蛋白作为确定经微波辐射后是否出现线粒体动力学异常的标志物。
44.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
45.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。