一种外泌体包裹腺苷的纳米复合物及其应用

1.本发明涉及纳米医学技术领域，具体地，涉及一种外泌体包裹腺苷的纳米复合物及其应用。


背景技术：

2.脑中风(stroke)，又称脑卒中，是以脑部缺血及出血性损伤为主要临床表现的神经系统疾病。全世界范围内，中风是导致死亡和终身残疾的首要原因之一。脑中风由于其极高发病率，已成为威胁人类身体健康的首要重大疾病，每年影响数百万人的生命健康。缺血性中风是临床上主要的脑中风类型，大约85％的中风本质上都是缺血性的，缺血性中风是由于血栓的形成导致血液供应不足(缺血)以及大脑缺氧和营养物质缺乏。随后，一系列导致神经元细胞死亡和神经炎症的生化反应发生。在这个级联过程中，神经元去极化并释放谷氨酸，导致神经元内钙内流增加和兴奋性毒性细胞死亡。此外，活性氧和氮(ros和rns)介导的氧化应激也加速梗死区核心细胞的死亡，导致进一步的神经元损失。
3.目前针对缺血性中风治疗的手段有限，主要通过组织型纤溶酶原激活剂(tpa)达到溶解血栓的效果，从而恢复大脑正常供糖供养。近年来，随着医学溶栓技术的迅速发展，脑中风的死亡率大大降低，但在脑中风幸存者中，约有35％的病人会出现严重的认知障碍，给社会带来了巨大的负担。然而，目前临床上并没有任何有效的药物，可以改善这种神经损伤。因此，开发新型的、毒副作用小的治疗药物来降低脑损伤并保护神经细胞，对缺血性中风的术后的神经修复具有十分重要的科学意义。
4.中枢神经系统(central nervous system,cns)疾病由于固有的复杂性，使得其药物开发一直充满挑战。其中，血脑屏障是所有神经系统疾病药物开发面临的巨大难题。血脑屏障是一种高选择性半透性结构，可调节物质进出以及白细胞血脑屏障的迁移，然而，血脑屏障也将98％的小分子药物和几乎所有的大分子药物都拦截下来，阻止它们进入大脑。但是，随着最近纳米技术和纳米科学的非凡进步，人们普遍认为纳米尺度工具材料在神经系统工程方面具有巨大潜力，纳米药物更易穿越血脑屏障，并在药物传递、靶向治疗和成像等领域都具有一定的价值。
5.外泌体是一种新兴的载体材料，外泌体是在细胞通讯过程中由细胞分泌的大小在40～100nm之间的微小囊泡，具有负载“货物”并将其传递给靶细胞的能力。外泌体作为药物的天然内源性载体具有独特优势，如其免疫原性低，在血液中的稳定性高，向细胞运输药物的效率高，和更强的增强渗透滞留效应。海马为大脑边缘系统的组成部分，是形成学习记忆的最主要脑区。脑缺血后认知功能障碍已被证实是由于海马损伤导致的。而海马细胞分泌的外泌体具有良好的归巢作用，可以在其成功穿越血脑屏障后，靶向缺血后的海马受损区域，精准将小分子药物腺苷递送至海马区。
6.腺苷，又称腺嘌呤核苷，是由一分子腺嘌呤和一分子核糖的n-9葡萄糖苷键结合而成，在中枢神经系统中分布广泛。在生理条件下，腺苷的浓度在细胞内和细胞外较低，但在应激反应时显著增加。腺苷参与调节脑内各种应急反应，一直被认为是一种主要的神经保
护内源性物质，其主要通过存在于细胞外膜上的g蛋白偶联受体(腺苷受体亚型a1、a2a、a2b和a3)发挥作用多种生理作用。腺苷受体在神经元、胶质细胞和外周炎性细胞中均有表达。在缺血中，腺苷发挥的作用是一个不同的受体相互作用的结果，腺苷受体是中风治疗实施的重要目标。缺血后不久细胞外腺苷浓度显著升高。位于中枢神经系统细胞和免疫血液上的腺苷受体细胞在缺血过程中发挥重要作用。腺苷的神经保护作用通过a1受体亚型在缺血期间被接受，近年来，a2a受体亚型已成为缺血治疗的潜在靶点。有证据表明a2a受体具有双重作用：在缺血的第一阶段，它增强兴奋性毒性，而缺血后的几小时和几天，免疫血细胞上的a2a受体增强细胞粘附机制和在缺血实质中的浸润。腺苷通过a2a受体的刺激，促进谷氨酸在常氧和缺血条件下的体内和体外释放。在体外缺氧状态下，a2a受体对海马突触传递起重要的调节作用。然而，腺苷作为小分子药物，血液半衰期短，很容易被代谢，并且很难透过血脑屏障发挥其效果，因而对腺苷进行改造对其在缺血性中风疗效的发挥至关重要。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种外泌体包裹腺苷的纳米复合物及其应用，本发明成功提取小鼠海马细胞ht22细胞外泌体，通过简单的超声方式将小分子药物腺苷导入外泌体内，制备得到外泌体包裹腺苷的纳米复合物(即纳米级外泌体-腺苷复合物)，进一步完成特征蛋白，粒径测试、电镜观察外泌体大小和形态等基本表征检测；在体内实验中，成功建立全脑缺血小鼠模型，发现纳米级外泌体-腺苷复合物明显减少海马ca1区的神经元死亡，并能提高缺血小鼠的探索能力。在对小鼠学习记忆能力进行检测时发现，脑缺血小鼠表现明显的认知损伤，而纳米级外泌体-腺苷复合物处理后，可以改善脑缺血小鼠海马ca1区的神经元形态结构的损伤，改善长时程增强(long-term potentiation，ltp)幅值的降低，改善认知损伤，发挥神经保护作用。
8.本发明的第一个目的是提供一种纳米复合物。
9.本发明的第二个目的是提供一种纳米复合物的制备方法。
10.本发明的第三个目的是提供任一所述制备方法制备得到的纳米复合物。
11.本发明的第四个目的是提供所述纳米复合物在制备防治脑中风的药物中的应用。
12.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
13.本发明的目的在于制备一种有利于脑中风患者认知损伤的外泌体包裹腺苷的纳米复合物(即纳米级外泌体-腺苷复合物)，其通过内源载体包裹腺苷达到改善脑缺血小鼠认知损伤的效果。以小鼠海马细胞(ht22细胞)作为供体细胞，收集其分泌的外泌体(exo)作为内源载体，通过超声导入小分子药物腺苷，构建纳米级外泌体-腺苷复合物。
14.通过多种表征手段表明成功收集了ht22细胞的外泌体，并将腺苷导入其中。其后，为检测纳米级外泌体-腺苷复合物的生物学效应，对昆明小鼠采用双侧颈总动脉夹闭30min后再恢复灌注的方式，建立小鼠脑缺血模型，通过各项运动及认知行为学检测，神经元形态染色以及电生理长时程增强记录等手段检验纳米级外泌体-腺苷复合物对缺血性小鼠的运动和学习记忆障碍是否具有明显的神经保护作用。
15.表征实验结果表明，成功合成了纳米级外泌体-腺苷复合物，其粒径在150nm左右，形态稳定；自发交替行为结果表明，缺血后的小鼠并没有出现明显的运动障碍，但是外泌体-腺苷复合物可提高缺血小鼠的探索能力；而水迷宫测试的结果也同样显示，缺血小鼠的
潜伏期明显增加，表现出空间学习记忆能力受损。外泌体-腺苷复合物可以缩短其潜伏期，改善其学习记忆，在行为表现上发挥神经保护作用；而在体外场电位记录时发现，小鼠海马脑片schaffer-ca1通路虽能形成ltp，但兴奋性突触后电位fepsp斜率的增大幅度明显减小，而外泌体-腺苷复合物可以逆转fepsp斜率的降低。
16.因此本发明要求保护一种纳米复合物，外泌体中包裹有腺苷。
17.优选地，所述纳米复合物的粒径为120～180nm。
18.优选地，所述外泌体为细胞外泌体。
19.更优选地，所述外泌体为海马细胞外泌体。
20.最优选地，所述外泌体为ht22细胞外泌体。
21.还要求保护一种纳米复合物的制备方法，将外泌体与腺苷混合后超声处理、静置、离心，即得。
22.优选地，所述外泌体为细胞外泌体。
23.更优选地，所述外泌体为海马细胞外泌体。
24.最优选地，所述外泌体为ht22细胞外泌体。
25.优选地，所述外泌体与腺苷的质量比为1～3：0.5～1.5。
26.更优选地，所述外泌体与腺苷的质量比为2：1。
27.优选地，所述超声处理为振幅15～35％，超声时间4～10s，间隙时间20～40s，循环5～8次，
28.更优选地，所述超声处理为振幅20％，超声时间6s，间隙时间30s，循环6次。
29.优选地，25～37℃恒温静置100～160min。
30.更优选地，37℃静置120min。
31.本发明进一步要求保护任一所述制备方法制备得到的纳米复合物。
32.以及所述纳米复合物在制备防治脑中风和/或神经损伤的药物中的应用。
33.优选地，所述药物逆转和/或抑制海马ca1区细胞减少和/或死亡。
34.优选地，所述药物增加海马ca1区树突的总长度。
35.优选地，所述药物改善运动能力。
36.优选地，所述药物改善学习记忆能力。
37.优选地，所述脑中风为缺血性脑中风。
38.更优选地，所述神经损伤为缺血性脑中风后的神经损伤。
39.优选地，所述纳米复合物在制备防治脑中风和/或神经损伤引起的认知损伤的药物中的应用。
40.更优选地，所述认知损伤为探索能力、和/或学习记忆能力受损。
41.进一步优选地，所述学习能力受损为空间学习记忆能力受损。
42.优选地，所述纳米复合物在制备防治脑中风和/或神经损伤的神经保护药物中的应用。
43.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
44.本发明利用内源载体小鼠海马细胞外泌体包裹小分子药物腺苷，开发设计出的纳米载药输运体系，其粒径在150nm左右，形态稳定。其改善由脑缺血引起的认知损伤，可提高缺血小鼠的探索能力，改善其学习记忆，在行为表现上发挥神经保护作用；同时可以逆转
fepsp斜率的降低。其可以于制备缺血性中风术后神经损伤修复药物。
附图说明
45.图1为ht22的外泌体-腺苷复合物合成示意图。
46.图2为电镜下外泌体形态。
47.图3为外泌体粒径大小。
48.图4为ht22外泌体表达特征蛋白tsg101，cd81和cd63。
49.图5为腺苷的载药量。
50.图6为外泌体-腺苷复合物减少脑缺血小鼠海马ca1区细胞死亡。
51.图7为外泌体-腺苷复合物增多脑缺血小鼠的进臂次数，改善运动损伤。
52.图8为外泌体-腺苷复合物缩短脑缺血小鼠的潜伏期，改善空间记忆损伤
53.图9为外泌体-腺苷复合物对脑缺血小鼠海马神经元形态的影响。
54.图10为外泌体-腺苷复合物对脑缺血小鼠海马脑片基础突触传递的影响。
55.图11为外泌体-腺苷复合物对脑缺血小鼠海马脑片ltp诱导的影响。
具体实施方式
56.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
57.1、细胞株
58.小鼠海马细胞(ht22细胞系)购自上海中科院细胞典藏库，经本实验室传代培养。
59.2、实验动物
60.小鼠为昆明小鼠。
61.3、主要试剂
62.胰酶、高糖dmem培养基、胎牛血清均为gbico公司产品，聚苯乙烯培养板为美国corning公司产品；丙二醛试剂盒(mda)、超氧化物歧化酶试剂盒(sod)购自碧云天生物公司。
63.4、仪器
64.日本olympus公司光学倒置显微镜，日本日立超高速离心机，thermo co2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，hv-85高压灭菌器，无菌操作台，恒温水浴锅等广州科桥实验技术设备有限公司。
65.实施例1一种纳米级外泌体-腺苷复合物的制备
66.一、实验方法
67.1、ht22细胞培养
68.取50ml胎牛血清至于高速离心机(超速离心机cp80nx)内，4℃，离心力100,000g，离心120min，得到不含外泌体的胎牛血清，使用不含外泌体的胎牛血清配置含10％胎牛血清的dmem高糖培养基(含双抗，青霉素的浓度为0.03mg/ml，链霉素的浓度为0.05mg/ml，ph＝7.0～7.2)，解冻的ht22海马细胞复苏于细胞瓶中，37℃恒温培养，等到细胞密度达到
90％时，弃去培养液，pbs清洗2次，再使用含edta的0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种至培养皿中。
69.2、ht22细胞外泌体的提取
70.待细胞铺满皿底约70％～80％，培养基更换为无血清的dmem培养基，18w紫外灯照射培养皿20min以促进外泌体快速释放，照射后置于恒温培养箱中孵育12h后收集细胞培养上清，每一细胞培养皿体积约10ml，转移至50ml的离心管中，2000g离心20min，使用0.22μm针孔滤头过滤上清液，将上清转移至6个体积为10ml的超高速离心管内。调整超高速离心机的参数为100,000g，4℃，4h，弃去上清，尽可能除净上清液，沉淀中饱含外泌体，使用预冷的0.5ml 1
×
pbs均匀吹打管壁、沉淀物，将沉淀的外泌体移至多个250μl ep管中，收集好的外泌体至于-80℃冰箱中，备用。
71.3、外泌体包裹腺苷
72.使用bca蛋白检测试剂盒对收集好的外泌体进行蛋白浓度检测，根据bca实验结果将外泌体稀释为浓度为1mg/ml后进行外泌体装载实验。
73.取1ml体积1mg/ml外泌体配制0.5mg/ml腺苷溶液于1.5ml离心管中，将离心管置于冰上并固定，使用超声波细胞破碎仪进行超声，破碎外泌体膜。
74.具体参数为：振幅20％，超声时间6s，间隙时间30s，循环6次，超声完毕后，将离心管置于37℃细胞培养箱内放置120min，使外泌体囊泡重组，然后再次使用超高速离心100.000g离心力离心4h，去除游离腺苷，即得外泌体包裹腺苷的纳米复合物(即纳米级外泌体-腺苷复合物)，可进行后续实验。
75.二、实验结果
76.以ht22细胞分泌的外泌体为药物载体，利用超速离心从ht22细胞培养上清中提取纯化外泌体；通过简单的超声方式将外泌体与腺苷共孵育以达到渗透，制备得到的纳米级外泌体-腺苷复合物，合成示意图如图1。
77.实施例2纳米级外泌体-腺苷复合物粒子物理化学表征检测
78.一、扫描电镜检测
79.1、实验方法
80.取少量的一定浓度实施例1制备纳米级外泌体-腺苷复合物溶液于ep管中，置于冰上，带去电镜室，分别用不同的吸管吸取少量的液体，滴一滴于300目的铜网上，带起自然晾干，保证充分干燥后，120kv电镜检测粒子形貌。
81.2、实验结果
82.结果如图2电镜图所示，实施例1制备的外泌体-腺苷复合物形态呈球形，直径接近100～150nm，具有明显的膜结构。
83.二、粒经检测
84.1、实验方法
85.将少量的一定浓度实施例1制备得到的外泌体和纳米级外泌体-腺苷复合物溶液加入样品池中，用粒度仪表征，作图并分析其粒径大小与分布。
86.2、实验结果
87.结果如图3，实施例1制备的外泌体粒径集中分布在100～150nm左右，而经超声包裹了腺苷之后，实施例1制备得到的纳米级外泌体-腺苷复合物的粒径稍有增大，粒径主要
集中在120～180nm。
88.三、sds-page电泳检测分子量
89.为了进一步检测外泌体的特性，对外泌体的特征蛋白进行检测，分别检测外泌体特征膜内蛋白tsg101和膜上蛋白cd81和cd63。
90.1、实验方法
91.先安装好电泳装置并验漏，根据实验要求配好分离胶和浓缩胶，然后将分离胶倒入板槽并加水，待胶凝后用滤纸把水吸干，然后缓慢倒入浓缩胶并小心地插入梳子；待胶凝后拔出梳子并安装好电泳槽，再将电极缓冲液加入电泳槽，然后将已经与loading buffer混匀的10μl的marker、实施例1制备得到的ht22-exo蛋白和ht22细胞蛋白依次加入样品槽，接通电源，将工作电压调到60v；待样品进入分离胶后把电压升高到120v；最后等蛋白样分离到合适的位置，断开电源；进行将胶从仪器上面分离出来，考马氏亮蓝染色后脱色过夜，最后利用凝胶成像仪拍照。
92.2、实验结果
93.免疫印迹的结果如图4所示，实施例1制备的外泌体样品中同时检测到上述三种特征蛋白的表达，表明成功提取了ht22细胞的外泌体。
94.四、腺苷的载药率检测
95.1、实验方法
96.为了测定实施例1制备的纳米级外泌体-腺苷复合物中腺苷的包载量，使用紫外分光光度计检测了空载外泌体超声包裹腺苷前后腺苷含量变化，根据测定好的腺苷的标准曲线，代入公式计算的结果如下图所示，
97.2、实验结果
98.结果如图5所示，实施例1制备纳米级外泌体-腺苷复合物包裹腺苷装载率在31.67％。
99.实施例3纳米级外泌体-腺苷复合物对缺血小鼠模型的影响
100.成功合成的纳米级外泌体-腺苷复合物后续应用于缺血再灌注的小鼠，检测其对缺血小鼠运动行为以及学习记忆能力的影响。
101.在筛选脑缺血小鼠模型时，选用双侧颈总动脉夹闭30min的方式建立模型，在30min夹闭结束后对其进行再灌注损伤，之后缝合手术伤口。手术后进行为期3天的青霉素注射，防止感染。单纯的腺苷以及实施例1制备的纳米级外泌体-腺苷复合物分别尾静脉注射10天后，进行心脏灌流，收集脑组织进行he染色，观察海马ca1区细胞的损伤情况，判断模型是否建立成功。
102.一、脑缺血小鼠模型
103.(一)实验方法
104.1、脑缺血小鼠模型的建立
105.采用双侧颈总动脉夹闭方法建立全脑缺血小鼠的动物模型。小鼠术前禁食不禁水12h，用1.4％的戊巴比妥钠(0.1mg/kg)腹腔注射麻醉后，修剪颈部正中部皮毛后做0.8～1cm正中切口，切开皮肤和皮下组织，用玻璃分针分离二腹肌和胸锁乳突肌，暴露双侧颈动脉，然后小心分离双侧颈总动脉及迷走神经约0.5～1cm，以无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉阻断血流30min后松开，恢复脑部供血。最后缝合切口，消毒，用青霉素进行肌注抗炎。假
手术小鼠除不夹闭双侧颈总动脉外，其他操作与模型组一致。术后小鼠麻醉苏醒前需予以白炽灯或孵育箱保温，防止低温休克的发生，室温维持在26～28℃为宜。
106.术后小鼠修复2d后，开始进行药物处理治疗。所有实验动物被随机分为假手术组，缺血组，腺苷组和外泌体-腺苷复合物组，腺苷组和外泌体-腺苷复合物组分别通过尾静脉注射等量的腺苷和实施例1制备的纳米级外泌体-腺苷复合物，而假手术组和缺血组进行同体积的生理盐水。所有组别给药周期为10d，给药周期结束后进行下文的各种实验。
107.2、he染色
108.一批实验动物在结束10天的疗程后(给药周期结束)，安乐死收集脑组织进行石蜡包埋，切片后进行he染色。将玻片放置于玻璃载片盒中，二甲苯ⅰ溶液中脱蜡5～10min，换用二甲苯ⅱ溶液，再脱蜡5～10min，无水乙醇脱水5min，90％乙醇脱水2min，80％乙醇再脱水2min，70％乙醇再次脱水2min，最后蒸馏水2min。
109.样品处理后的玻片放置于原来的玻璃载片盒中不移动，苏木素染色液染色10min，浸自来水中冲洗去多余的染色液，约10min，再用蒸馏水洗涤10s，之后伊红染色液染色2min，再按照下列顺序进行脱水、透明、封片：60％乙醇溶液10s，70％乙醇溶液10s，80％乙醇溶液10s，90％乙醇溶液10s，无水乙醇溶液10s，二甲苯ⅰ溶液透明5min，二甲苯ⅱ溶液透明5min，最后用中性树胶封片。显微镜下观察，细胞核呈蓝色，而细胞浆呈粉红色或红色。
110.(二)实验结果
111.如图6所示，在对各组海马ca1区细胞进行计数时发现，夹闭30min后小鼠海马ca1区细胞数目明显减少，而分别给予腺苷以及实施例1制备的纳米级外泌体-腺苷复合物后，可以显著减少海马ca1区细胞死亡。
112.二、小鼠行为学检测
113.(一)自发交替行为实验
114.1、实验方法
115.另一批实验动物在结束10天的给药周期后进行各项行为学检测。自发交替行为实验(spontaneous alternation behavior,sab)用来评估实验动物对新异环境的探索能力和空间工作记忆。测试全程保持安静和黑暗。利用y-maze迷宫装置进行自发交替评估空间记忆测试。正式测试前用70％的酒精溶液清洁y-maze迷宫，待酒精味散去，并明确标记迷宫外侧三臂为
“ⅰ”“ⅱ”
或
“ⅲ”
。正式测试前，小鼠在原鼠笼进行30min的暗适应。将小鼠放进y-maze迷宫的任一壁中，闭合各臂上方挡板，开始观察记录小鼠在y-maze迷宫中的活动情况。观察员在保证能看清小鼠轨迹的前提尽可能远离迷宫。每只鼠测试一次，每次进行10min，记录小鼠每分钟进入不同迷宫区域的顺序。统计小鼠每分钟的进臂次数、正确进臂次数和正确率，并统计总进臂次数及总平均正确率。
116.2、实验结果
117.如图7所示，假手术组、缺血组、腺苷组和外泌体-腺苷组在前3min的进臂次数无明显差异，说明缺血30min和给药处理均未影响脑缺血小鼠的运动能力。而外泌体-腺苷组在3～8min的进臂次数中明显比缺血组增多(p《0.01)，说明外泌体-腺苷处理可提高脑缺血小鼠的探索能力。与假手术组相比，缺血组在3-8min的正确率显著降低(p《0.05)，说明脑缺血小鼠短时记忆受损；而经过腺苷和外泌体-腺苷处理后，不能提高3～8min的正确率(p》0.05)，表明药物对脑缺血小鼠的短时记忆没有明显的改善作用。
118.(2)水迷宫测试
119.1、实验方法
120.水迷宫测试(water maze test,wmt)是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，是用来评估海马体依赖的空间学习记忆最有效的测试之一。测试历时5天，每天将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中各一次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期，latency)，即每天每只小鼠共被测试4次，每次之间间隔20～30min。每天固定的时间点进行水迷宫测试，测试时的水温保持20℃，利用白色无毒儿童涂料将水染成乳白色，平台置于第一象限的中间，没于水下1cm，记录小鼠找到平台的时间，极为潜伏期。
121.2、实验结果
122.mwt用于评估实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，潜伏期指标代表小鼠的学习记忆能力，潜伏期越短，说明学习能力越强。实验小鼠在水迷宫测试的游泳轨迹图如图8a所示，通过水迷宫测试后，我们发现在第一天的训练过程中，对照组、缺血组、腺苷组和外泌体-腺苷组的潜伏期没有差异(如图8b)，表明各组具有相似的运动和视觉能力。而在训练的第四天，缺血组的潜伏期显著比假手术组延长图(如图8b)，表明脑缺血小鼠出现了空间学习记忆方面的损伤。而经过外泌体-腺苷处理后，潜伏期明显缩短，表现出明显的改善作用(如图8b))。缺血组的平均速度和运动时间和对照组相比有下降的趋势，但没有统计学差异。而经过腺苷和外泌体-腺苷处理后，运动路程有所增加，其中外泌体-腺苷组的运动路程与缺血组相比，具有显著性差异(p《0.05，图8c-d)，说明实施例1制备得到的外泌体-腺苷可提高脑缺血小鼠的运动能力。
123.三、高尔基染色
124.(一)实验方法
125.待小鼠行为学训练结束以后，将小鼠颈椎脱臼处死后断头，剥离全脑组织并用生理盐水冲洗2～3s以除去表面血液。分离左右脑半球并切除前脑和后脑多余部分，置于提前配好的高尔基溶液中浸泡4d后，取出组织放入保护液中再连续浸泡5d，每天更换一次保护液。以上步骤均在室温下避光进行，将泡好的组织修整并放入石蜡包埋仪中浸蜡6h后进行石蜡包埋。包埋的石蜡样品经全自动轮转切片机切片，以背侧海马水平冠状面切厚度约为150μm脑片，将脑片贴附在3％明胶包被的显微镜载玻片上，晾干后进行高尔基染色处理。石蜡切片的高尔基处理步骤：双蒸水浸泡(1min)，14％氨水避光浸泡(30min)，双蒸水浸泡2次(每次1min)，5％硫代硫酸钠避光浸泡(15min),双蒸水浸泡2次(每次1min),50％、70％、95％的乙醇各脱水一次(每次4min)，无水乙醇脱水2次(每次4min)，甲醇、二甲苯、乙醇混合液(1：1：1)浸泡15min，最后用中性树脂封片。在室温下自然干燥后，使用光学显微镜观察并采集海马ca1区域中的神经元树突。
126.根据以下标准选择神经元树突：(1)神经元必须充分染色，不存在不完全染色的迹象；(2)胞体和树突必须在全视图中，且与其他神经元交集较少；(3)神经元的结构完整清晰，不存在截断的分支。为了获得可分析图像，在40倍显微镜下观察ca1区的神经元，不断调整焦距拍照，每次旋转微准焦螺旋5
°
拍一张照片，把单个神经元全貌拍下，然后选择另外一个神经元，并保存标尺。使用image j软件中的sholl分析插件测量树突的长度和分枝复杂度。每只小鼠脑组织选择5个符合上诉标准的神经元进行统计。
127.(二)实验结果
128.神经元的树突形态反映了脑内的突触结构。为了研究实施例1制备的纳米级外泌体-腺苷复合物对脑缺血小鼠树突形态结构的影响，分析了海马ca1区锥体神经元的树突特征(树突总长度和树突交叉点数)。结果如图9所示，分别清楚地展现了来自ca1区锥体神经元的树突形态。与假手术组比较，全脑缺血后小鼠海马ca1区的树突总长度显著缩短(图9b)，基底树突中距离细胞体60-100μm处的交叉点显著降低(图9b)。与缺血组比较，腺苷治疗可以显著增加缺血小鼠海马ca1区树突的总长度(图9b)，但是没有显著增加缺血小鼠海马ca1区树突的交叉点数。而经过实施例制备得到的纳米级外泌体-腺苷治疗可以显著增加缺血小鼠海马ca1区树突的总长度(图9b)，距离细胞体60～80μm处的交叉点显著增加(图9c)，即树突的分支数目。
129.四、电生理记录实验
130.(一)实验方法
131.小鼠颈椎脱臼处死后断头，迅速剥离全脑，置于冰冻液中1～2min，在冰袋上使用塑料剥离器剥离出海马，使用砍刀式切片机沿海马长轴进行切片，厚度约为400μm，转移至含有人工脑脊液的且通混合气(o
2 95％，co
2 5％)的孵育槽中孵育1.5h备用。
132.将脑片转移至记录槽，适应15min后下刺激电极和记录电极，记录海马的schaffer-ca1通路fepsp的斜率。刺激电极由两根绝缘的镍铬合金丝绞合而成，定位于海马schaffer侧支；记录电极由玻璃电极胚拉制而成，且针尖灌充acsf，无气泡，阻抗2-6mω，定位于海马ca1区辐射层。
133.在记录到fepsp后，让脑片休息15min之后，开始记录输入/输出(input/output curve,i/o)曲线，选择能引起fepsp最大斜率的1/3-1/2的刺激强度作为最适刺激强度进行实验。记录基线且维持平稳15min后，给一个强直刺激(tbs)以诱导长时程增强(ltp)的形成。
134.检测刺激参数：波宽0.2ms，频率0.05hz，刺激间隔20s，刺激强度范围0.05-0.15ma。
135.tbs参数：10串，每串5pulses，频率100hz，波宽0.2ms，串间隔200ms。
136.(二)实验结果
137.如图10所示，在对脑片的而基础突出传递进行检测时发现，随着刺激强度的增强，sham组、缺血组、腺苷组和外泌体-腺苷组的fepsp斜率逐渐增大，但各组斜率的增大幅度并没有显著性差异，提示脑缺血30min并不改变小鼠的基础突触传递，而经过腺苷和外泌体-腺苷处理对脑缺血小鼠的基础突触传递也没有影响。
138.通过对小鼠海马脑片schaffer侧枝-ca1通路ltp诱导情况来观察腺苷和外泌体-腺苷处理对脑缺血小鼠记忆的影响。结果如图11所示，记录15min基线后，给予强直刺激tbs诱导ltp的形成。通过场电位的记录发现，第75min，对照组和缺血组的fepsp斜率增大幅度分别为基线水平的283.86
±
68.19％和150.53
±
26.96％，而腺苷组和外泌体-腺苷组的fepsp斜率增大幅度则为基线水平的197.14
±
41.04％和228.39
±
51.61％。缺血组小鼠虽然也能诱导出ltp，但与假手术组相比，fepsp的斜率降低近53％左右(图11b)。而在给予腺苷处理后，第75min的fepsp斜率增大幅度为基线水平的197.14
±
41.04％，比缺血组增大31％左右，而经过外泌体-腺苷处理后，第75min的fepsp斜率增大幅度为基线水平的228.39
±
51.61％，比缺血组增大52％左右(图11b)。以上结果表明，缺血30min对小鼠海马schaffer侧枝-ca1通路ltp诱导造成一定的损伤，经过腺苷和外泌体-腺苷处理能够改善脑缺血所引起的ltp诱导，其中外泌体-腺苷的改善作用较为明显。
139.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。