一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法

技术特征：
1.一种利用cut&tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒，其特征在于，包括：生物素化的tn5转座酶、细胞核提取液、洗涤液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、dna洗脱液、一抗、二抗、dna纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液、triton x-100溶液、十二烷基硫酸钠溶液、甘氨酸溶液、预装的phase lock gel凝胶、dna共沉淀剂和pcr反应液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的转座酶由转座酶与生物素化的dna接头引物孵育形成；所述生物素化的dna接头引物由引物a与引物b退火形成的双链接头i和引物a与引物c退火形成的双链接头ii构成；引物a包含转座酶识别的mosaic end(me)序列片段，5’端磷酸化，3'端氨基(aminolinkerc7)修饰；引物b的3’端为与引物a反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物c的3’端为与引物a反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物b或引物c其中的一个的5’端标记有生物素三甘醇。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述tn5转座酶为pg-tn5转座酶或pa-tn5转座酶；细胞核提取液为含有0.5％-1％体积浓度triton x-100的tris缓冲液；洗涤液为含有蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的tris缓冲液；抗体杂交液为含有edta,bsa,蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的tris缓冲液；链霉亲和素洗涤液为含edta和tween-20的tris缓冲液；dna洗脱液为含醋酸钠和甲酰胺的溶液；dna纯化磁珠为表面羧基化修饰的磁珠。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括：引物i、引物ii和pcr预混液；所述引物i的碱基序列如seq id no.4-seq id no.15所示序列中的一种；所述引物ii的碱基序列如seq id no.16-seq id no.23所示序列中的一种。5.一种利用cut&tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用生物素化的dna接头引物与tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的tn5转座酶二聚体；(2)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；(3)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；(4)利用植物基因组dna提取液提取反应后的dna，利用链霉亲和素磁珠对其中生物素标记的dna片段进行纯化，形成链霉亲和素磁珠-dna片段混合物；(5)以链霉亲和素磁珠-dna片段为模板，进行pcr建库，建立转录因子与染色质互作的高通量测序文库；(6)文库质检、高通量测序及生物信息学分析；或者，(a)利用生物素化的dna接头引物与tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的tn5转座酶二聚体；(b)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；(c)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座
酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；(d)利用植物基因组dna提取液提取反应后的dna，取出一部分dna溶液中dna充作荧光定量pcr的input dna，再利用dna纯化磁珠结合剩余dna中的大片段,回收上清溶液；(e)利用链霉亲和素磁珠对步骤(d)产物中的小片段进行生物素-亲和素纯化，形成链霉亲和素磁珠-dna片段混合物；(f)利用dna洗脱液对结合在链霉亲和素磁珠上的dna片段进行洗脱；并以洗脱下来的dna为模板，进行荧光定量pcr；(g)利用δct方法对荧光定量pcr数据进行分析。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(a)中，具体步骤包括：a)制备生物素化的dna接头引物：由引物a与引物b退火形成双链接头i，由引物a与引物c退火形成双链接头ii；引物a包含转座酶识别的mosaic end(me)序列片段，5’端磷酸化，3'端氨基(aminolinkerc7)修饰；引物b的3’端为与引物a反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物c的3’端为与引物a反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物b或引物c中的一个的5’端经生物素三甘醇标记。b)制备tn5转座酶二聚体：将接头i和接头ii以1:1的比例混合形成接头混合物，接头混合物与tn5转座酶孵育形成tn5转座酶二聚体。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，pcr的反应体系包括：引物i、引物ii和pcr预混液；所述引物i的碱基序列如seq id no.4-seq id no.15所示序列中的一种；所述引物ii的碱基序列如seq id no.16-seq id no.23所示序列中的一种。pcr的反应程序为：98℃ 3min，98℃ 30s；98℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s,18-20个循环，72℃ 5min。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，所述dna洗脱液的配方为ph＝9.0的含30mm醋酸钠、95％甲酰胺的溶液；所述dna纯化磁珠为ampure xp beads磁珠。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(f)中，所述荧光定量pcr的反应体系包括：sybr green，模板，上游基因特异引物，下游基因特异引物；所述模板分别为步骤(d)中的input dna和步骤(f)中洗脱下的dna；所述上下游基因特异引物覆盖的目的片段区域包含预测的转录因子结合基序；反应程序为：98℃ 3min，98℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s,45个循环。10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(g)中，所述δct方法为以下任意一种：(g-1)δct＝抗体组样本的ct值-igg对照组样本的ct值，抗体组片段富集倍数为＝2-δc
；所述抗体组为使用目的转录因子特异抗体或者抗融合蛋白标签的抗体为一抗进行cut&tag反应的样本；所述igg对照组指使用igg进行cut&tag反应的样本；(g-2)δct＝cut&tag样本的ct值
–
1％input的ct值，则cut&tag样本中目的片段占其1％input的比例＝2-δct
×
100％。所述cut&tag样本指抗体组或igg对照组cut&tag。所述1％input dna来自步骤(d)；最后，比较目的片段在抗体组和igg对照组两个比例的差异。

技术总结
本发明公开了一种利用CUT&Tag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法，该试剂盒包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、Triton X-100溶液、预装的Phase Lock Gel凝胶、DNA共沉淀剂和PCR反应液等试剂。本发明克服现有CUT&Tag技术在植物中应用的缺陷和不足，提供一种在动植物、特别是丰度较低的染色质结合蛋白与DNA的互作研究中广泛适用的CUT&Tag-seq和CUT&Tag-qPCR策略及相应试剂盒，促进表观遗传调控新技术新手段的发展。手段的发展。手段的发展。


技术研发人员：徐盛春 陶晓园 徐飞 李素娟 王钢军 王剑 陈光 邵健丰
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/5/31