大豆GmPRR3b基因在调控大豆抗旱性中的应用

大豆gmprr3b基因在调控大豆抗旱性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种大豆gmprr3b基因在调控大豆抗旱性中的应用，以及在调控抗旱大豆遗传育种中的应用。


背景技术：

2.近年来，随着全球气候变暖和人类活动的加剧，干旱、洪涝、高温和霜冻等极端天气发生的频率和数量逐渐增加，其对农业生产的威胁日趋严峻。目前干旱、高温被认为是导致农作物减产和绝产的两大主要非生物胁迫因子。外界空气过干或土壤含水量过低均可导致植物因缺水而形成干旱胁迫，其对植物的生长和发育具有严重的抑制作用。
3.最新数据显示，由于气候变化导致的温度升高和水资源匮乏已经成为一个亟待解决的全球性难题，全球每年有近50％的陆地受到干旱的影响，其中大部分都是农业区，主要分布于非洲、亚洲、北美西部、南美西部和澳大利亚部分地区(mahalingam,2017)。近10年来由于干旱造成的农作物减产损失已达到300亿美元，人口的不断增长，农业用水需求的增加以及可利用淡水量的降低，进一步加剧了干旱对农业生产的影响(gupta et al.,2020)。
4.大豆原产于中国，是世界上食用蛋白质和油脂的重要来源。上世纪50年代以前中国是世界大豆第一生产国和净出口国。近年来，随着我国人们生活水平提高，对大豆的需求量急速攀升，供需矛盾日益突出。造成我国大豆生产落后、供给严重不足的原因是多方面的，其中干旱胁迫是重要的环境因素。因此鉴定干旱调控基因是培育耐旱大豆新品种的重要步骤。
5.在干旱条件下，过表达gmwrky54基因促进大豆叶片气孔关闭进而增加大豆的耐旱性(wei et al.,2019；zhou et al.,2008)。最新研究发现，mads-box转录因子dt2可能通过直接调控干旱胁迫响应基因gmdreb1d的表达，进而影响叶片气孔运动和水分利用效率(zhang et al.,2019)。生物钟核心振荡器组分gmlhys基因功能同时缺失会增强气孔对干旱的响应，降低大豆叶片失水速率，进而增强植物的耐旱性，表明gmlhys蛋白在大豆耐干旱胁迫中起负调控作用(wang et al.,2021)。
6.迄今为止，在大豆中只鉴定到少量的数量性状位点(qtl)与大豆干旱胁迫相关，已克隆到的参与大豆干旱胁迫调控基因较少，且其调控网络仍不明确。因此，研究大豆对干旱胁迫的调控基因非常有意义。


技术实现要素：

7.基于此，本发明的目的之一是提供一种大豆gmprr3b基因在调控大豆抗旱性中的应用。
8.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
9.一种大豆gmprr3b基因在调控大豆抗旱性中的应用，所述大豆gmprr3b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或编码如seq id no.2所示的氨基酸序列。
10.本发明还提供了一种大豆gmprr3b基因在抗旱大豆遗传育种中的应用，所述大豆
gmprr3b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或编码如seq id no.2所示的氨基酸序列。
11.本发明还提供了大豆gmprr3b基因编码的蛋白在调控大豆抗旱性中的应用，所述大豆gmprr3b基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明还提供了大豆gmprr3b基因编码的蛋白在抗旱大豆遗传育种中的应用，所述大豆gmprr3b基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13.本发明还提供了一种大豆gmprr3b基因敲除载体，所述基因敲除载体是利用crispr-cas9编辑技术构建而得，所述大豆gmprr3b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或编码如seq id no.2所示的氨基酸序列。
14.本发明还提供了上述大豆gmprr3b基因敲除载体在提高大豆抗旱性中的应用，或在抗旱大豆遗传育种中的应用。
15.本发明还提供了一种提高大豆抗旱性的制剂，所述制剂的活性成分包括上述大豆gmprr3b基因敲除载体。
16.本发明还提供了一种调控大豆抗旱性的方法，所述方法包括：调控大豆gmprr3b基因的活性，所述大豆gmprr3b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或编码如seq id no.2所示的氨基酸序列。
17.本发明还提供了一种提高大豆抗旱性的方法，所述方法包括步骤：利用crispr-cas9编辑技术构建大豆gmprr3b基因敲除载体，使大豆gmprr3b基因的功能丧失；所述大豆gmprr3b基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或编码如seq id no.2所示的氨基酸序列。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.在本发明中，发明人发现大豆gmprr3b基因能够负调控大豆的耐旱性，相比于野生型植株20％的存活率，大豆gmprr3b基因敲除突变体植株的存活率达到了45％以上，耐旱性显著增强了，大豆gmprr3b基因新功能的发现，为抗旱大豆遗传育种提供了新的基因靶点和资源。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中限制性内切酶xbai消化前的crispr载体结构图。
21.图2为本发明实施例1中构建得到的大豆gmprr3b基因敲除crispr载体的结构图。
22.图3为本发明实施例2中crispr基因敲除突变体株系的靶点测序结果，其中，tl为野生型大豆，gmprr3b-1和gmprr3b-3为gmprr3b基因敲除突变体。
23.图4为本发明实施例3中大豆gmprr3b基因敲除突变体株系的避旱性表型结果，其中，tl为野生型大豆，gmprr3b-1和gmprr3b-3为gmprr3b基因敲除突变体。
24.图5为本发明实施例3大豆gmprr3b基因敲除突变体避旱鉴定中，复水后的存活率统计；其中tl为野生型大豆，gmprr3b-1和gmprr3b-3为gmprr3b基因敲除突变体。
25.图6为本发明实施例4大豆gmprr3b基因敲除突变体耐旱鉴定中，耐旱性表型鉴定及复水后的存活率统计；其中tl为野生型大豆，gmprr3b-1和gmprr3b-3为gmprr3b基因敲除突变体。
具体实施方式
26.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不
同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
27.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
28.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
29.在本发明的其中一个方面，提供了大豆gmprr3b基因和其编码的蛋白在调控大豆抗旱性中的应用。所述大豆gmprr3b基因的核苷酸序列如上述seq id no.1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述调控为负调控，通过使大豆gmprr3b基因或其编码的蛋白丧失生物学功能，从而提高大豆的抗旱性。
30.seq id no.1
31.atgaacaataatgttgggaaagggaaaaaaggtttggcagaacaaaatcatatgttttttgacaaaaagagtctcgaaaatggagtagttaatggaggggtagcctctggatcatcaactgaagatgacacaagatttaataaggtggttgaagatggaaacaatggattgaggggtctgattcaaatccatgggagcttgcagatttcacaacaaccacctcaagagccagccgtatgctgggagagatttctcccattaagatcgataaaagttttgctggtggaagatgatgattcgacacgccatgttgtgcgtgctctgttacagaattgtagttacaaagtcactgccgtttccaatggccttcaagcgtggaaagtcctggaagatccagaaaatggcattgatcttgtcctaacagaggtagctatgcctattttgtctggaataggtcttttgtgcaagatcatgagccacaaaactctgaagaatattcctgtgattatgatgtcatctcatgattctatgggtatagtctttaagtgtttgtcaaaaggtgcagttgattttttagtgaaacctattcggaggaatgaacttaaaaacctctggcagcacgtttggagaagatgccacagttctagtggtagtgggagtgaaagtgcgaccctcaccagaaaatttgcaaagtcaagaagtaatgatgcatatgaaaacaatagtgacagcagtgatgagaatgactatggaagcagaggcttgagcattcgtgatggaagtgacaatggaagtggcactcagagttcatggactaaatgtctagctcaagttggcagtcctcatccagtttcacctcataaacagttggttgatgcccctgatagcacatgtgcccaagtgatgcaaacaaagactgaaaaagttagtagtagatgggtgcatgcgacggaaaaagagtgccatgaacttattgatcttgatgatgttgcaagggttaaggacttggctatgggaatatctttgaatatgcaactagagcatccactcgaggaactgtctagcaatccaattgtgggtaaaggggcaaataagatgtctgatgtagatgatatgcagatcattaagagaaagagcaatgtctgtgaaaaaggacaattggaatacaatggtgataaaaccgggacacaggaaaatcaggctatgaatgttattgatgttactgatagcaacagtccacaggctgaaagcagagacttgaacactccaaatgggttttctggtttttcacaatcaaaagcaaactgttgccccaaagagcatccatcccttgaactaactctgaaaaggctgggagaagtaggagatgctaaaaatgtcactggtgaagaatgcaatgtcttgagacattcagatcagtcagcattctcaaaatataatactgtttctgctaaccaggctcaaactggaaatgtaggaagctgttccccactagacaatagctcagctgcaccaaatacagagacaatgcacaactttccatctcattcaaatggcactccttcaaatcaaaaatctaatgggagcaacaacatcaatgacagggcctccactaatacatatcttggcaccaaacctgatacttttgacaagaagccggagtctggaagagggattggctcgtataattcttgtgaactcctaactgtgcagaacaatagcatttcttcatctcagaagaaaacttctgcctgggaagaatatacagaaatcattaaagaatcagtaggaggctctgaacaaggattccaagtcgagcacacttactatcagcttcacc
attataatcacattgcccataaagctgcagtagatccctaa
32.seq id no.2
33.mnnnvgkgkkglaeqnhmffdkkslengvvnggvasgssteddtrfnkvvedgnnglrgliqihgslqisqqppqepavcwerflplrsikvllvedddstrhvvrallqncsykvtavsnglqawkvledpengidlvltevampilsgigllckimshktlknipvimmsshdsmgivfkclskgavdflvkpirrnelknlwqhvwrrchsssgsgsesatltrkfaksrsndayennsdssdendygsrglsirdgsdngsgtqsswtkclaqvgsphpvsphkqlvdapdstcaqvmqtktekvssrwvhatekechelidlddvarvkdlamgislnmqlehpleelssnpivgkgankmsdvddmqiikrksnvcekgqleyngdktgtqenqamnvidvtdsnspqaesrdlntpngfsgfsqskanccpkehpsleltlkrlgevgdaknvtgeecnvlrhsdqsafskyntvsanqaqtgnvgscspldnssaapntetmhnfpshsngtpsnqksngsnnindrastntylgtkpdtfdkkpesgrgigsynscelltvqnnsisssqkktsaweeyteiikesvggseqgfqvehtyyqlhhynhiahkaavdp
34.应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，在不改变氨基酸序列的前提下，对本发明的编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
35.在本发明的另一方面，提供了大豆gmprr3b基因敲除载体在提高大豆抗旱性中的应用。
36.在本发明的另一方面，还提供了一种提高大豆抗旱性的方法，所述方法包括步骤：利用crispr-cas9编辑技术构建大豆gmprr3b基因敲除载体，使大豆gmprr3b基因的生物学功能丧失。
37.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
38.实施例1敲除大豆gmprr3b基因的载体的构建
39.本实施例利用infusion系统(clotech)，通过限制性酶切位点xbai分别将gmu6启动子和包含19bp靶位点序列的sgrna，构建到crispr载体上，从而构建了大豆gmprr3b基因敲除载体，具体包括以下步骤：
40.1、取大豆威廉82种子，种植在营养土中，在长日照条件下生长15天，取大豆第一片三出复叶提取dna。其中，提取dna方法如下：
41.(1)、取适量大豆幼嫩叶片放入1.5ml装有打样钢珠的rnase-free的离心管中，并迅速放置于液氮中，冷冻状态下研磨打样机打样或研钵磨样，加入500μl65℃预热的ctab溶液，涡旋混匀，65℃干燥烘箱中放置30min。
42.(2)、从干燥烘箱中取出样品并冷却，加入500μl 25:24:1tris-饱和酚/氯仿/异戊醇溶液(必须冷却到室温再加入溶液)，上下颠倒混匀或涡旋混匀，室温12,000rpm匀速离心15min，吸取上清至新的离心管中。
43.(3)、在新的1.5ml离心管中加入500μl 24:1氯仿/异戊醇溶液并上下颠倒混匀或涡旋混匀，室温12,000rpm匀速离心10min，缓慢吸取500μl上清至新的离心管中。
44.(4)、室温加入500μl等体积异丙醇，上下颠倒混匀或涡旋混匀，-20℃放置一段时间或-80℃过夜，室温12,000rpm匀速离心10min。
45.(5)、弃掉上清，加入75％乙醇1ml，上下颠倒混匀并室温12,000rpm离心10min，再次去掉上清，室温放置5min，用枪头吸去多余乙醇，室温放置20min，加入40μl超纯水溶解，以备后用。
46.2、以大豆叶片dna为模板，gmu6-xbal-f(seq id no.3)和gmu6-r(seq id no.4)为
引物，扩增得到gmu6启动子片段。pcr扩增反应体系和反应程序如表1和表2所示。
47.gmu6-xbal-f(seq id no.3)：
48.ggaagcttaggccttctagaaaaataaatggtaaaatgtc
49.gmu6-r(seq id no.4)：caatccatgtggtggcacat
50.pcr反应体系如表1所示。
51.表1
[0052][0053]
pcr反应程序如表2所示。
[0054]
表2
[0055]
95℃2min95℃15s57-62℃15s72℃1min/kb2-4步循环35-3672℃5min4℃长期保存
[0056]
3、以序列如seq id no.7所示的sgrna为模板，gmprr3b-f(seq id no.5，其中下划线为gmprr3b基因的靶位点序列)和sgrna-xbai-r(seq id no.6)为引物，扩增得到包含19bp gmprr3b基因靶位点序列的sgrna片段，pcr扩增反应体系和反应程序如表1(除模板不同外，其他都相同)和表2所示。
[0057]
gmprr3b-f(seq id no.5)：
[0058]
aatgtgccaccacatggattgttaatggaggggtagcctcgttttagagctagaaatagcaa
[0059]
sgrna-xba1-r(seq id no.6)：
[0060]
ggcaacgcgttctagaaaaaaaagcaccgactcggtgccac
[0061]
sgrna序列(seq id no.7)：
[0062]
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt
[0063]
4、以步骤2得到的gmu6启动子片段和步骤3得到的包含19bp靶位点序列的sgrna片段为模板，gmprr3b-f(seq id no.5)和sgrna-xba1-r(seq id no.6)为引物，扩增得到包含19bp gmprr3b基因靶位点序列的gmu6-sgrna片段，pcr扩增反应体系和反应程序如表1(除模板不同外，其他都相同)和表2所示。
[0064]
5、用限制性内切酶xbai消化crispr载体(结构如图1所示，酶切反应体系如表3所示)。
[0065]
表3
[0066][0067]
6、将步骤4的pcr产物和步骤5酶切后的载体进行凝胶电泳，确定目的条带大小并切除(使用axygen凝胶回收试剂盒回收各种对应产物，详细实验步骤按照axygen公司说明书操作)。将目的条带置于1.5ml离心管中，50℃连接30min(连接反应in-fusion系统如表4所示)，得到大豆gmprr3b基因敲除的crispr载体(crispr-gmprr3b，结构如图2所示)，4℃保存。
[0068]
表4
[0069]
基因pcr回收产物1μl限制性内切酶酶切后载体1μlin-fusion酶0.5μltotal2.5μl
[0070]
配制顺序按照从多到小顺序添加，减少误差。
[0071]
实施例2大豆gmprr3b基因敲除植株的获得
[0072]
本实施例采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将实施例1中构建的大豆gmprr3b基因敲除载体转入大豆子叶节中，得到大豆gmprr3b基因敲除植株，具备包括以下步骤：
[0073]
1、农杆菌感受态的制备
[0074]
挑取根癌农杆菌eha105单菌落分别置于5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，eha105抗性为：100μg/ml利福平(rif)。28℃培养过夜；取过夜培养菌液500μl接种于50ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃培养到od
600
约为0.5；冰上放置30min；4℃，5,000rpm离心10min，用15ml预冷的10mm cacl2重悬农杆菌细胞，4℃，5,000rpm离心10min；用2ml预冷的10mm cacl2重悬沉淀，冰上100μl/管分装，液氮速冻，-80℃保存。
[0075]
2、电击转化农杆菌
[0076]
在50μl农杆菌感受态中加入3μl质粒(即实施例1构建得到的大豆gmprr3b基因敲除载体)，灭菌枪头吸打混匀，冰上静置30min，期间准备电击杯超净工作台晾干并预冷。冰
no.9)，进行pcr扩增，反应体积为50μl(反应体系如表1所示，反应程序如表2所示)，pcr完成后，取5μl跑胶检测是否具有特异性条带，剩余25μl样品送给睿博兴科有限公司进行一代测序，并和野生型基因组dna进行比对，确定大豆gmprr3b基因敲除株系是否为纯合突变。最终得到两株纯合突变的大豆gmprr3b基因敲除株系(突变体)，分别命名为gmprr3b-1基因敲除突变体和gmprr3b-3基因敲除突变体，进行以下的表型鉴定。crispr敲除株系靶点测序结果见图3，其中，tl表示对照基因组dna序列，碱基上的
“‑”
表示缺失序列。
[0092]
实施例3大豆gmprr3b基因敲除株系(突变体)的避旱表型鉴定
[0093]
将天隆1号(对照tl)和大豆gmprr3b基因敲除纯合株系gmprr3b-1和gmprr3b-3于长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)条件下种植2周，每种材料单独种植于小盆中，通过停水承受干旱胁迫处理两周，再恢复供应水，分别于断水处理前(对照)、断水6天和恢复供水10天后，观察天隆1号和基因敲除株系gmprr3b-1和gmprr3b-3的性状，结果如图4所示。恢复供水10天后，统计存活率，结果如图5所示。
[0094]
图5结果表明，天隆1号(对照tl)仅有25％的植物存活率，而两个基因敲除株系gmprr3b-1和gmprr3b-3超过了75％的植株存活，gmprr3b-3甚至达到了95％的植株存活率。说明大豆gmprr3b基因敲除株系(突变体)可以显著提高大豆避旱性。
[0095]
实施例4大豆gmprr3b基因敲除株系(突变体)的耐旱表型鉴定
[0096]
将天隆1号(对照tl)和大豆gmprr3b基因敲除纯合株系gmprr3b-1和gmprr3b-3于长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)条件下种植2周，每个大豆gmprr3b基因敲除纯合株系分别与天隆1号种植在一个小盆中。通过停水承受干旱胁迫处理10天，再恢复供应水，分别于断水0天和恢复供水7天后，观察天隆1号和突变体的性状，统计其存活率。结果如图6所示。
[0097]
结果表明，恢复供水7天后，天隆1号(对照tl)不到20％的植物存活率，两个基因敲除株系gmprr3b-1和gmprr3b-3均超过45％的植株存活，gmprr3b-1甚至达到了50％的植株存活率。说明大豆gmprr3b基因敲除株系(突变体)可以显著提高大豆耐旱性。
[0098]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0099]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。