基于重编程因子的抗衰老疫苗及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于重编程因子的抗衰老疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的

技术实现要素：
，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
3.全球人口老龄化日益加重，老龄化研究已成为关注焦点。据世界卫生组织统计，到2050年，世界60岁以上的人口将达到21亿(联合国，2017年)。我国早已进入老龄化社会，2018年，60以上人口占总人口的18.5％。伴随年龄增加，年龄相关疾病大幅增加，如阿尔茨海默氏症、心血管疾病和癌症等(melzer等人，2020年)，相关疾病的发病率基本在60岁之后每5年翻一番。因此，提出新的医疗及健康模式，成为解决全球承受不可持续慢性病社会及经济损失的重要举措。衰老与疾病之间的联系，促使人们对衰老的机制和减轻其影响的策略进行基础性研究。衰老是一种进行性退化状态，伴有组织干细胞耗竭、组织炎症、基质改变、细胞衰老和代谢功能障碍。这些细胞和组织的变化反映了线粒体、蛋白平衡、细胞间通讯、营养传感、表观遗传学和dna修复等潜在的分子畸变，这些畸变导致基因组不稳定和包括端粒功能障碍在内的损伤。作为人类死亡的最重要的危险因素，衰老导致功能衰退，增加虚弱，并增加对慢性疾病的易感性。
4.目前人类延长寿命的策略可以分为三大类：(i)治疗那些直接死亡原因，(ii)减缓或减弱生物衰老过程，以及(iii)实现返老还嫩(即逆转衰老)。第一类涉及年龄相关重大疾病的治疗，第二类涉及健康个体的寿命延长，第三类返老如新。虽然前两种主要策略已被广泛研究，但对系统逆转机体衰老近年来更引起了研究热潮。一些公认的返老还嫩疗法最近被引入，并通过老化生物标志物和生理年龄指数来证明年龄逆转。
5.关于最新的抗衰老研究，主要集中在：
6.(1)表观遗传失调成为衰老的关键标志
7.衰老是一种退化过程，会导致组织功能障碍和死亡。来自酵母和哺乳动物的证据支持老龄化的信息理论。表观遗传信息的丢失破坏了年轻基因的表达模式，导致细胞功能障碍和衰老。衰老的一个主要原因是表观遗传噪声的积累，其破坏基因表达模式，导致组织功能和再生能力的下降。由于遗传学只能解释衰老过程的20％-30％，最近的研究集中在表观遗传景观的改变上。有研究显示，随着年龄增长，人类和小鼠基因组中被称为cpg位点的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的胞嘧啶甲基化模式发生改变。这些变化非常准确地与实足年龄相关，因此代表了实足年龄的一个多变量指标。在此基础上，建立了表观遗传时钟，用以测量不同组织类型的细胞年龄。在特定的组织中，细胞间dna甲基化模式的异质性变异被认为是表观遗传时钟后面的滴答率。由于表观遗传老化与人类和小鼠的预期寿命有关，因此它有可能反映生物学年龄而不是实足年龄。除了甲基化谱，其他表观遗传标记，如组蛋白乙酰
化，将有助于更好地定义和区分老化和衰老。组蛋白乙酰转移酶p300下调后组蛋白h3和h4低乙酰化也可诱导衰老。这一机制独立于p53、p21cip1和p16ink4a的激活，如人二倍体成纤维细胞(hdf)通过表达人端粒酶逆转录酶(htert)实现永生。研究显示，生理衰老的驱动因素包括dna损伤的积累、ros生成的增加、端粒缩短、细胞衰老和核膜结构缺陷。衰老这种在胚胎发育过程中被重置的表观遗传程序，也可以在生命后期通过部分细胞重编程在实验中被改变。
8.重编程因子与生物年龄逆转相关研究显示，在体内异位表达oct4,sox2，klf4和/或c-myc四种山中重编程因子(takahashi&amp；yamanaka,2006)实现了眼损伤后轴突再生，这种策略还可以让老鼠恢复因衰老或青光眼而失去的视力。研究认为，osk诱导的重编程在轴突再生和视力方面的有益作用需要dna去甲基化酶tet1和tet2。同时研究表明，哺乳动物组织保留了部分由dna甲基化编码的年轻表观遗传信息记录，可用于改善组织功能和促进体内再生(lu等人，2020年)；一种药物鸡尾酒也显示出胸腺再生的潜力，进一步挑战了单向老化的观念。传统的重编程方法完全改变了细胞的血统和身份，从而导致细胞失去了它们的结构和功能，当这种完全重编程的方法应用于小鼠体内时，会促进肿瘤的形成，干扰再生效应。
9.在体外对细胞进行完全的重新编程可以逆转胚胎的生物学年龄，但这种方法在体内可能导致肿瘤。然而，部分重编程可以在不改变细胞特性的情况下逆转细胞的生物年龄，大多数人类和老鼠的生物钟由于重编程而发生年龄逆转已达成了普遍共识。最终，与诱导多能干细胞能够促进整个新胚胎这一事实相一致，证实了重编程是一种关键的再生干预措施。一些研究已经在体内应用了这些方法。通过在全身调节重编程因子的瞬时表达，避免细胞被完全重编程为可诱导的多能干细胞(ipscs)，研究人员能够延长早衰症小鼠的寿命，并改善组织修复(ocampo等人，2016)。使用腺相关病毒(aav)诱导的类似方法实现了表观遗传年龄的逆转和视网膜中的神经元再生(lu等人，2020年)。人类肌肉细胞中的重编程因子表达可以增强肌肉干细胞库的功能恢复。细胞培养研究表明，人类细胞可以在不改变细胞谱系标记身份的情况下实现表观遗传年龄逆转。因此，调查细胞身份逆转和生物年龄逆转之间的内在联系和差异至关重要，研究显示，osk/oskm表达与其他干预或生物事件共同的下游基因表达动力学状态，可引起由分子老化生物标志物评估的强劲衰老逆转，使研究oskm下游的替代重编程因子成为可能。因此，体内oskm诱导可能通过阻止与衰老相关的分子变化(包括表观遗传改变、细胞衰老途径的激活和成体干细胞数量的耗尽)来延缓衰老过程。体内重编程诱导的分子改变可能会导致组织稳态的更好维持和寿命延长。
10.表观遗传重编程可以促进组织修复，逆转人类与年龄相关的衰退，lu等人通过表达osk，实现了表观遗传年龄的逆转和视网膜中的神经元再生(lu等，2020年)。展示了在体内安全逆转复杂组织的年龄和恢复其生物功能是可能的。认为利用眼睛作为模型系统，提供的证据证明，异位表达的osk可以安全地诱导衰老的cns神经元在体内的表观遗传恢复，而不会导致细胞特性或多能性的丧失。相反，osk促进了一种年轻的表观遗传特征和基因表达模式，使神经元的功能表现重返年轻状态。这一过程中对主动去甲基化的需求支持了这样一种观点，即dna甲基化模式的改变参与了衰老过程及其功能逆转。其可能涉及其他转录因子和表观遗传修饰，如prc2复合体和h3k27me3，两者都参与维持干细胞的可塑性，并与dnam时钟位点有关。
11.体内oskm的循环诱导可促进年龄相关疾病的恢复，短期oskm诱导人4f细胞显著减少了每个细胞的组蛋白γ-h2ax病灶数量。此外，在人4f细胞中短期诱导oskm可显著恢复h3k9me3的水平。结果表明，短期诱导oskm可以改善晚期传代小鼠和人类细胞的多种衰老特征，包括dna损伤的积累、细胞衰老和表观遗传失调，从而证明在生理衰老过程中观察到的表型年轻化的部分重编程潜力，增加抗代谢性疾病和肌肉损伤的恢复。骨骼肌减少症定义为衰老过程中骨骼肌质量的丧失，是老年人身体丧失能力的主要原因之一。衰老过程中与年龄相关的肌肉质量损失是由于肌肉干细胞(也被称为卫星细胞)再生能力的下降。卫星细胞在生命过程中处于静止状态，在肌肉损伤时被激活，生成新的肌肉纤维。在衰老过程中，由于环境和细胞内在因素的影响，卫星细胞的数量和功能会减少，这些细胞会从静止状态切换到衰老前状态，从而阻碍它们的再生能力。以往研究表明，yamanaka因子在体内的表达可导致癌症的发展或畸胎瘤的形成，成为现有技术一大问题。
12.(2)dna甲基化时钟是一种新型的衰老生物标志物
13.dna甲基化模式在胚胎发育过程中被确立，以建立细胞类型和功能。随着时间的推移，dna甲基化模式的改变形成了衰老时钟的基础。dna甲基化时钟可以用来计算dna甲基化(dnam)年龄，预测未来的健康和寿命。衰老的关键特征之一是生理完整性的逐渐丧失，这削弱了身体功能，增加了死亡的风险。dna甲基化时钟是一种新型的衰老生物标志物，由一组胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸组成，其dna甲基化状态可用于准确测量主观年龄。该时钟被认为是人类和其他脊椎动物实足年龄的精确生物标记。诸多研究已经证明，这些时钟可以量化生物衰老的速度，以及长寿和抗衰老干预的效果。dna甲基化时钟作为衰老的生物标志物，其正确的理解将有助于量化生物衰老的速度，并为有效的治疗衰老干预的发展提供基础。有效和可靠的衰老生物标志物的实现对于理解延缓、停止甚至逆转衰老过程的方法是至关重要的。
14.基于dna甲基化的生物标记物是合适的衰老分子标记物。dna甲基化的可逆性是表观遗传钟最有趣的特征，这表明其可能用于测量抗衰老干预的有效性。研究显示，时钟在捕捉生物衰老差异方面具有独特的功能，其在预测衰老、认知和生理功能的变化、与年龄相关疾病相关的生存率以及识别和/或验证有效的抗衰老干预方面也有很大潜力。
15.(3)端粒及端粒酶是老化与健康的重要标志
16.衰老伴有组织干细胞耗竭、组织炎症、基质改变、细胞衰老和代谢功能障碍。相关细胞和组织的变化反映了线粒体、蛋白平衡、细胞间通讯、营养传感、表观遗传学和dna修复等潜在的分子畸变，进而导致基因组不稳定和包括端粒功能障碍在内的损伤，端粒是驱动衰老过程及其相关疾病的分子回路的煽动者或放大器。限制端粒储备是细胞永生的障碍，但端粒功能的丧失、与年龄相关的健康下降和致癌基因不稳定同时发生。事实上，端粒功能障碍已被描述为衰老的九种细胞和分子特征之一。
17.衰老细胞在衰老组织中积累，并通过各种机制导致衰老和与衰老有关的疾病。两个重点问题包括：第一，阻碍组织干细胞(衰老的另一个标志:干细胞衰竭)、免疫细胞(所谓免疫衰老)和基质细胞的复制潜力；第二，衰老细胞通过释放包括但不限于白介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnfα)的促炎因子破坏器官功能。组织干细胞衰竭是衰老的一个主要特征。在晚期tert-或terc-null小鼠中，进行性端粒侵蚀导致组织干细胞依赖p53的凋亡消除，这有助于器官萎缩，特别是在自我更新率高的高度增殖组织中。基因组不稳定是衰老的
另一个标志，它会导致干细胞衰竭并引发炎症，端粒功能障碍会加剧染色体不稳定性。端粒和线粒体密切相关，在衰老过程中，线粒体功能下降，导致能量(atp)生产减少以及细胞内ros增加。能量生产减少导致全身虚弱，而ros增加导致细胞损伤。具体来说，端粒功能障碍激活p53，进而抑制pgc1α和pgc1β的表达。pgc1α/β表达减少，进而导致线粒体生物生成和功能减少，并降低了控制氧化防御的基因的表达。端粒p53 pgc1α/β线粒体信号通路导致ros水平升高，并进一步由ros介导的端粒鸟苷碱基的8-羟基脱氧鸟苷修饰。该轴形成了连接端粒功能障碍、线粒体和氧化应激通路的前反馈回路，导致衰老加速。表观遗传景观中年龄相关的变化包括局部甲基化增加和整体甲基化减少。直接端粒和表观遗传相互作用反映在sirtuins的调控上，端粒功能障碍和sirt(sirt1和sirt6)之间的相互作用，可以通过端粒功能障碍诱导p53介导的所有7种sirtuins的抑制得到证明。端粒功能障碍和p53介导的sirt1表达抑制也与蛋白稳态(proteostasis)改变的衰老标志有关。端粒功能障碍诱导的sirt1的抑制以及由此导致的hsp70水平的降低可能会损害应激过程中的蛋白稳态和热休克反应。衰老过程中的营养感知失调与一个高度保守的网络有关，该网络由igf-1和mtor-s6信号通路以及foxo和ampk蛋白家族成员组成，这些途径相互调节以维持代谢稳态。包括来自基因组受损或衰老细胞的炎症信号，端粒功能障碍可在多个水平上引发和维持炎症。首先，端粒功能障碍引起细胞衰老，从而刺激白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnfα)等炎症因子的产生和分泌。其次，端粒功能障碍会导致染色体外片段的产生，这些片段可通过激活cgas/sting通路导致细胞自噬死亡。最近的研究已经在端粒功能障碍和组织炎症之间建立了直接联系，可以部分解释老年人群中出现的与年龄相关的炎症反应增加。该研究也强调了细胞内在端粒功能障碍驱动的分子途径和微生物组在驱动炎症反应中的合作。端粒功能障碍通过激活atm/cabl/yap1轴和驱动成熟il18分泌来招募和增强t细胞和巨噬细胞，从而导致组织炎症，tert启动子中最常见的单核苷酸突变发生在g228a和g250a位点。遗传性和获得性退行性疾病的发展已经催化了人们对端粒酶恢复治疗的兴趣，将其作为一种潜在的抗衰老策略。
18.该治疗的最佳应用可能是短暂的端粒酶诱导，以恢复端粒储备和愈合。同时避免因端粒酶激活而引发癌症的可能性。事实上，在具有长端粒的临床前小鼠模型中，tert表达增加了40％的寿命，尽管这些小鼠也含有额外的p53、p16和arf拷贝，这增强了其抗癌能力。尚不清楚的是，强制的tert表达延长寿命和疾病修饰活动是否与tert对端粒的作用有关，还是与其激活wnt有关，以增强干细胞储备。端粒缩短导致衰老、纤维化、炎症和有功能的p53检查点存在的干细胞耗竭。这些过程会导致衰老和其他退化性和炎症性疾病。端粒酶激活剂和消老剂可抑制相关过程，抑制衰老和衰老相关疾病。端粒缩短也会导致端粒融合和断裂-融合-桥的循环。在缺少p53检查点的情况下，相关事件会导致肿瘤的发生。
19.(4)htert诱导和端粒酶激活是细胞重编程所必需
20.werner综合征(ws)是一种常染色体隐性遗传综合征，其特征是在成年早期出现过早衰老和与年龄相关的疾病，主要由编码recq helicase1 4的wrn基因的功能缺失突变引起。研究表明，htert诱导和端粒酶激活是细胞重编程所必需的。由于tert或terc突变而导致端粒酶缺乏的细胞表现出低能力甚至失去重编程潜能。
21.因此，基于衰老导致身体退化、组织功能障碍、年龄相关疾病增加和死亡的问题，如何延缓衰老、实现返老还嫩，成为现有技术存在的主要缺点。
发明内容
22.鉴于解决现有技术存在的相关缺陷，本发明的目的是提供一种基于重编程因子的抗衰老疫苗及其制备方法。
23.第一方面，本发明提出了一种基于重编程因子的抗衰老疫苗；
24.进一步地，所述疫苗包括但不限于oct4、sox2、klf4和c-myc四种重编程因子；包括但不限于htert人端粒酶逆转录酶；
25.进一步地，本发明所述疫苗所使用的载体包括但不限于mrna疫苗载体、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒载体；
26.进一步地，本发明所述表达体可以通过脂质递送系统和病毒感染的方式作用于人体。
27.第二方面，本发明提出了一种基于重编程因子的抗衰老疫苗的制备方法。
28.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：抗衰老疫苗包括重编程因子及其表达载体和脂质递送系统。
29.进一步地，重编程因子包括但不限于oct4、sox2、klf4及c-myc转录因子。
30.进一步地，重编程因子还包括细胞重编程相关的转录因子和细胞因子，包括但不限于gata4，gata6，sox3。
31.进一步地，重编程因子还包括人端粒酶逆转录酶htert。htert是维持端粒长度、端粒酶活性及osk/oskm重编程作用的重要因子。htert也可以实现重编程和诱导ipsc细胞生成。
32.进一步地，抗衰老疫苗还包括重编程因子表达载体，包括但不限于基于mrna疫苗表达载体、腺病毒、慢病毒及逆转录病毒表达载体。
33.进一步地，重编程因子表达载体还包括其他相关病毒表达载体和噬菌体表达载体。
34.进一步地，重编程因子为无载体表达，或重编程因子蛋白疫苗。
35.进一步地，抗衰老疫苗还包括脂质递送系统；所述脂质递送系统配方包含但不限于电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇；优选地，lnp配方包括rna-脂质复合物、提供结构刚性的脂质以及能够修饰颗粒表面特性的脂质化聚合物涂层。
36.进一步地，抗衰老疫苗还包括部分重编程，所述部分重编程为重编程因子在体内的瞬时、非持续表达，不改变细胞身份，不引起细胞无限制恶性增生，以达到逆转表观遗传年龄时钟，进而使身体年轻化。
37.进一步地，抗衰老疫苗还包括该疫苗的制备方法。
38.本发明实施例具有如下有益效果：通过基于重编辑因子的抗衰老疫苗，预防和延缓衰老的发生，实现人类及相关组织、器官、细胞返老还新、返老还嫩的技术效果；该疫苗作用于人体后，可短期内瞬时表达，实现部分重编程，逆转表观遗传年龄时钟，改善组织细胞的代谢和功能，实现整体组织器官和人体年轻化，预防和延缓年龄相关性疾病，不改变细胞身份，不诱导细胞无限增生，进而达到实现返老还新(嫩)的效果。
附图说明
39.图1为本发明一实施例中mrna抗衰老疫苗表达体的分子结构特征和脂质纳米包裹
递送系统图；
40.图2为本发明一实施例中基于mrna及病毒载体的osk/oskm及htert的假病毒转染及细胞表达试验结果图；
41.图3为本发明一实施例中免疫印迹技术结果图；
42.图4为本发明一实施例中健康人成纤维细胞和werner综合征患者成纤维细胞诱导为ipsci细胞(可诱导的多能干细胞)的试验结果图；
43.图5为本发明一实施例中采用本发明的htert疫苗，单独诱导ws和wt细胞重编程为ipsc细胞相关数据图；
44.图6为本发明一实施例中抗衰老疫苗部分重编程的有效性和安全性数据图。
45.图7为本发明一实施例中老年小鼠和青光眼小鼠的抗衰老疫苗治疗效果数据图。
46.图8为本发明一实施例中就400名健康志愿者进行抗衰老疫苗临床试验结果图。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本技术进行进一步的介绍。
48.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
49.为了清楚地定义返老还童的影响并系统地描述它们的特征，需要对生物年龄进行初始、准确的评估，以及随后对这些干预措施的生物年龄动态进行量化。在这里，本发明将生物体年轻化定义为通过精确的生理和/或分子生物标记物来测量的生物年龄或损伤的强劲、持续和系统性的下降。根据这个定义，大多数验证和假定的再生干预和现象可以分为三大类：(i)异源移植，(ii)细胞重编程，(iii)早期胚胎动力学。
50.衰老的逆转本质上是多维的，其可能包括在分子水平上的损伤减少，在细胞水平上的细胞功能更新，以及在生物体水平上有意义的生理改善。从根本上说，生物组织的一个层次上的效应通常伴随着其他层次上的关联效应。例如，重编程因子osk(oct4 sox2 klf4)或oskm(osk c-myc)的表达被证明可以逆转表观遗传年龄，增加干细胞功能，逆转与年龄相关的视力丧失，并增加早衰症小鼠模型的寿命。从生理学的角度来看，虚弱指数已被建立为评估生物年龄的有力工具，而基于该指数的时钟已成功地用于评估蛋氨酸限制作为一种长寿干预措施。现有研究显示，体内oskm诱导可能通过阻止与衰老相关的分子变化(包括表观遗传改变、细胞衰老途径的激活和成体干细胞数量的耗尽)来延缓衰老过程。体内重编程诱导的分子改变可能会导致组织稳态的更好维持和寿命延长。
51.衰老涉及的慢性疾病主要包括神经退行性变、癌症和糖尿病等，葡萄糖稳态的改变是发病率和死亡率的主要原因之一，虽然胰岛素抵抗和胰腺β细胞分泌能力的下降在糖尿病的发展中发挥了关键作用，但β细胞对胰腺损伤反应的增殖能力的丧失已成为衰老过程中胰腺功能障碍的基本机制。本发明的结果表明，在体内循环诱导oskm可促进老年动物β细胞种群的扩大，并增加胰腺损伤后的葡萄糖耐量。
52.损伤后10天肌肉的组织学分析和层粘连蛋白免疫染色显示，通过循环oskm诱导，肌肉的再生能力显著提高。损伤区域的纤维截面积增加，中心有核纤维数量减少。通过山中
因子短期表达的部分重编程具有恢复小鼠和人类衰老的细胞表型的能力。本发明证明了短期诱导oskm可以避免肿瘤的形成。体内oskm的循环诱导改善了衰老的标志，延长了小鼠早衰模型的寿命。此外，短期诱导oskm可改善生长期小鼠胰腺和肌肉损伤后的再生能力。
53.研究表明，部分体内重编程可被用来调节衰老特征，并显著有益于机体健康，这可能会加强表观遗传变化作为衰老驱动因素的潜在作用，并突出了衰老过程的可塑性。表观遗传改变(如dna甲基化、组蛋白翻译后修饰和染色质重塑)已经成为最保守的衰老特征之一。细胞重编程到多能性是通过逐步的整体表观遗传重塑发生的。另外，衰老细胞经历了一个分子年轻化的过程，这有利于衰老细胞的代谢及功能改善，有利于生物体整体生理功能和生命力的改善，有利于生物体衰老特征和表型的改变。
54.dna甲基化是基因组核苷酸碱基的一种化学修饰形式，可以在不改变dna序列的情况下改变基因表达。胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(cpgs)是哺乳动物dna甲基化修饰的主要目标，通过在胞嘧啶上添加甲基(-ch3)基团形成5-甲基胞嘧啶(5mc)。大多数cpg在哺乳动物基因组中分布不规则，相对稀少。然而，在某些区域，cpg以群或簇的形式存在，称为cpg岛(cgi)，大约60％～70％的基因启动子与cgi相关。然而，个体对衰老的生理反应是不同的。dna甲基化年龄和实际年龄之间的差异(dnam年龄加速)被认为是与所有原因死亡率和年龄相关疾病相关的生物衰老的指标。近期，大量的研究集中在dnam年龄加速与寿命或死亡率之间的相关性。dna甲基化年龄较高与冠心病风险增加相关，第一项研究显示，hannum和horvath时钟估计的缺血性中风患者的dna甲基化年龄更高；第二项研究表明，dna甲基化年龄的增加与卒中后3个月预后较差相关；第三项研究报道，dnam年龄的加速与死亡率有统计学相关性。dna甲基化时钟是一种新型的衰老生物标志物，被认为可以用来测量实际年龄，同时也能反映生物衰老的一些特征。
55.端粒维持染色体的完整性，是维持健康跨度和物种繁殖所必需的。端粒末端保护在进化上的保守功能从低级的多细胞生物(如嗜热t.)延伸到高级生物(包括智人)。从结构上看，端粒由ttaggg串联重复序列组成，长度从几个碱基到几十个碱基，在端粒3端终止，形成一个75-300个核苷酸的单链悬垂，富含鸟嘌呤核苷酸。端粒高阶结构的功能是抑制端粒末端的dna损伤信号，防止dna修复程序通过重组或经典/替代非同源端连接融合末端，并调节端粒酶在末端的访问和活性。
56.另外，为了阐明ws成纤维细胞重编程失败的机制，本发明检测了相关细胞的htert表达和端粒酶活性，并确定内源性htert表达的诱导受损是ws细胞重编程过程中的一个关键缺陷。htert通过延长端粒可显著提高正常细胞的ipsc效率。
57.若分子年轻化不能消除老化的关键标志，可能会导致难以治愈的细胞群和细胞衰老的持续。所以，抗衰老疫苗的反复应用，将有利于衰老特征的充分改变。
58.衰老这种在胚胎发育过程中被重置的表观遗传程序，也可在生命后期通过部分细胞重编程被改变。通过表观遗传重编程重置衰老时钟，实现衰老生命年轻化，已经成为现实；并将导致以改善与年龄相关疾病为目标的治疗战略的发展，从而改善健康和寿命。本发明结合灯塔水母不死基因调控的研究，结合重编程因子，尤其是部分重编程可以逆转生物年龄、恢复衰老疾病的成果，以及mrna疫苗的发展，形成了基于重编程因子的抗衰老疫苗。
59.如图1所示，列出本发明一实施例中mrna抗衰老疫苗表达体的分子结构特征和脂质纳米包裹递送系统。
60.四种山中转录因子oct4、sox2、klf4和c-myc(oskm)中，c-myc是一种降低小鼠寿命的致癌基因，其不是细胞重编程启动所必需的。另外，nanog是一个指示多能性和致癌性的转录因子，也不必用其进行诱导。本发明构建了两种表达载体，osk包括oct4、sox2、klf4和osmk，包括osk c-myc(oskm)。以进行对照研究。另外，构建了mrna表达载体(图1a)，及其脂质递送系统(图1b)；研究表明，人端粒酶逆转录酶(htert)诱导和端粒酶激活是细胞重编程所必需的。因此，本发明也构建了htert逆转录病毒表达载体。
61.为了传递和控制osk在小鼠中的表达，本发明在四环素反应元件(tre)启动子的严格控制下，设计了一个双腺病毒(dual adeno-associated virus，aavs)系统(图1c-e)。在存在四环素衍生物多西环素(dox)的情况下，tre启动子可以被反四环素控制的反式激活剂(rtta)激活；在没有dox的情况下，可以被四环素控制的反式激活剂(tta)激活。将多余的aav序列从载体中移除，以适应osk作为多顺反子的存在。
62.1.抗衰老疫苗osk/mmrna表达载体及慢病毒载体的构建
63.本发明在构建mrna表达体方面，结合了既往的研究经验以及在研发covid-19疫苗的经验，进行密码子优化和质粒优化。mrna疫苗的分子结构特征见图1a。本发明利用包含每个所需的寡核苷酸进行多重pcr片段扩增，并利用重叠片段组装生成osk/oskm的完整序列。进一步地，本发明在前述密码子优化基础上，对表达质粒优化构建的背景下，对plvs质粒含有c-末端18个氨基酸的缺失，本发明在前期相关实验证明这些缺失可以导致更高的假病毒滴度。另外，本发明进行rna自扩增设计和mrna加帽一步完成设计。利用in-fusion hd克隆试剂盒(takara)将组装好的片段插入noti/xbai消化后的ptwist-cmv-betagloin-wpre-neo慢病毒表达载体中。研究中使用的所有质粒dna均经过全质粒深度测序(illumina)验证，以确认仅存在预期的突变。mrna表达载体是对慢病毒载体的线性化获得。
64.2.重编程因子腺病毒(avv)及htert逆转录病毒(rv)载体构建
65.将小鼠oct4、sox2和klf4 cdna克隆到由四环素响应元件(tre3g启动子)和sv40元件组成的aav质粒中，制备aav-tre-on-osk，aav-tre-off-osk载体(图1d)。其他自制载体采用类似的方法或直接化学合成，包括构建的htert逆转录病毒载体prv-htert。将所有paavs、plvs及prvs包装并转染293t细胞，从培养液上清中收获假病毒颗粒，并定量aavs、lvs及rvs病毒滴度(滴度：5
×
10
12
个基因组拷贝/ml)。
66.3.mrna的体外转录(ivt)及纯化
67.用于生成mrna的体外转录(ivt)酶促反应依赖于t7、sp6或t3rna聚合酶催化从相应的dna模板合成靶mrna。通过纯化质粒的线性化，rna聚合酶反应体系中即可合成mrna。mrna在实验室规模的纯化过程包括dnase i酶切，然后licl沉淀。更大规模的净化是使用成熟的色谱策略结合切向流动过滤获得。
68.4.脂质纳米递送系统包裹
69.mrna疫苗的脂质递送系统配方通常包含可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇(peg)。脂质纳米颗粒可以保护mrna免受酶的攻击，并提高细胞对mrna的摄取和表达。
70.5.mrna疫苗连续生产的微流体方法
71.mrna疫苗精确、安全、灵活，易于大规模生产，但它依赖于使用昂贵和有限的材料。本发明提出了一个微流体方法原位酶反应加上产品去除处(ispr)、底物上料和监控模块及
多通道使用色谱法取代使用多个色谱步骤，该新的连续生产方法，结合高通量纯化和定义明确的分析方法的化合物再循环，可以实现可持续、灵活和成本效益高的疫苗生产，从而实现按需定制和规模化生产。
72.实施例1
73.本实施例通过基于mrna及病毒载体的osk/oskm及htert的假病毒转染及细胞表达试验，证明本发明构建的osk/oskm及htert mran和paavs及plvs病毒载体的转染及表达成功有效。
74.(1)方法
75.流式细胞术滴度法确定假病毒的感染单位和感染率。简单地说，通过脂质体(pei)转染编码pcmv-luciferasi-ires-zsgreen的慢病毒和avv载体，以及慢病毒和avvs表达质粒，在293t细胞中产生假病毒。病毒收集和过滤除菌后，通过流式细胞仪滴度法定量运行。
76.本发明在12孔板上每孔种植40万个293t细胞。并用相同条件下24小时后平行生产的osk/oskm及htert假病毒上清液，以3-10倍顺序稀释后加入培养液。细胞在37℃/5％co2条件下孵育48小时，以表达zsgreen报告基因，并用胰蛋白酶-edta(康宁公司)收集细胞。将细胞重悬于含2％胎牛血清(pbs )的pbs中，用stratedigm s1300exi流式细胞仪检测zsgreen 细胞的百分比。感染单位的计算方法是：通过测定细胞中转导呈线性下降的感染细胞百分率，并乘以试验开始时测定的每孔平均细胞数。在低moi(感染率《10％)时，假设每个转导的zsgreen 细胞代表一个单一的感染单位。用抗人oskm及htert alexa fluor 647偶联抗体(r&amp；d)1μl染色，证实oskm及htert在293t细胞表达。细胞在25℃孵育10分钟，然后在stratedigm s1300exi流式细胞仪上运行。
77.(2)结果分析
78.如图2用流式细胞术，以未转染的293t细胞作对照，证实293t转染成功后，对假病毒转染表达细胞进行检测。(a)代表性点图显示共培养48小时后，感染野生型vehicle、paav-trc-on-osk/oskm、paav-trc-off-osk/oskm、plv-osk/oskm、plv-htert假病毒(zsgreen )的293t细胞(左图)和293t-osk/oskm/htert细胞(右图)的百分比。假病毒是在相同的条件下平行产生的。(b)在293t细胞上对osk/oskm/htert假病毒进行滴度测定，并通过qpcr测定与基因组拷贝中假病毒浓度(gc)/ml相关计算。假设在感染率《10％时，病毒浓度与受感染细胞之间存在线性关系，本发明进行了线性回归来拟合数据(n＝3)。通过计算相对于vehicle的每个假病毒相对于(b)的斜率的相对变化，对(b)中每个因子的假病毒转染效率进行了测量。
79.该体外感染试验表明，本发明设计的新型抗衰老疫苗序列，经过包装生产的假病毒，能够体外进行转染，感染靶细胞的效率比对照组假病毒高4倍。总之，该研究结果突出表明，抗衰老疫苗的osk/oskm/htert病毒载体构建和转染细胞成功。
80.实施例2
81.本实施例通过免疫印迹技术，证实上述构建的oskm和tert表达载体，能够在人成纤维细胞表达，用于说明本发明抗衰老疫苗在人细胞内的表达情况。
82.(1)方法
83.1)细胞培养：
84.人类真皮成纤维细胞从两种不同来源获得，细胞应用(圣地亚哥，ca)和早衰症研
究基金会(prf)。来自prf的细胞来自没有早衰症相关突变的健康捐赠者。成纤维细胞以冷冻储存的方式获得。使用含有8mm葡萄糖和2％fcs补充的人成纤维细胞生长(hgf)培养基(细胞应用)培养成纤维细胞。每代培养开始时细胞密度为20万细胞/15ml/皿。4-6天后细胞达到融合状态，收集细胞，测定细胞总数。在每个传代阶段，将未使用的细胞冷冻用于dnam分析。
85.2)诱导osk表达：
86.强力霉素(1mg/ml；mp biochemicals)于aav注射后3周，连续给药至试验结束。并在37℃下用含有非必需氨基酸、10％不含四环素胎牛血清的dmem(invitrogen)培养(takara bio，631106)含1％青霉素/链霉素(thermofisher scientific,15140122)。将转基因oskm和osk小鼠的efs传代到p3，并在培养基中用强力霉素(2g/ml)按指定时间段处理。所有细胞系支原体均为阴性。
87.免疫印迹根据标准方案进行western blot分析。主要抗体包括anti-osk/m，htert(ab200,abcam,cambridge,ma,usa)、γh2ax(9718,cell signaling technology(cst)，danvers,ma,usa)、rpa32(2208,cst)、rad51(sc-8349,santa cruz biotechnology,dallas,texas,usa)和actin(cw0096m,cwbio，北京，中国)。
88.(2)结果分析
89.重编程因子表达如图3所示，本发明选择早衰综合症患者成纤维细胞(werner综合征，ws)，一种常染色体隐性疾病，由recq类解旋酶(wrn)基因突变引起，成年后出现过早衰老；以及一个健康成人真皮成纤维细胞。本发明选择的这位werner综合征患者，由于htert表达缺陷，首先进行了htert转染表达，3天后即可进行重编程因子诱导表达。本实施例结果表明，本发明构建的mrna、avvs及lvs基osk/m、htert表达载体，能够在体外对人对程纤维细胞进行转染，并表达重编程因子蛋白。
90.实施例3
91.本实施例通过对健康人成纤维细胞和werner综合征患者成纤维细胞诱导为ipsci细胞(可诱导的多能干细胞)的试验，以验证本发明构建的osk/oskm，htert抗衰老疫苗，具有重编程因子的作用和诱导ipsc的活性。
92.(1)方法
93.1)ipscs诱导：
94.werner综合征成纤维细胞(ag03141)和野生型健康成人对照成纤维细胞的生成和表征来自于coreell生物库。ag03141成纤维细胞来源于ws患者wrn基因2476核苷酸c到t突变纯合子(c2476t)，导致终止密码子在748[gln748ter(q748x)突变。前期研究发现，该患者细胞缺乏htert活性，osk不能诱导成为ipsc。所以，本发明直接用hpert进行诱导。
[0095]
在重新编程之前，利用表达htert和嘌霉素耐药基因的逆转录病毒载体将人tert引入ws(ag03141)和野生型(ag10803)成纤维细胞。经嘌呤霉素筛选后，用稳定表达htert的成纤维细胞生成ipscs。诱导型htert。
[0096]
2)用表达可诱导htert的细胞生成诱导多能干细胞：
[0097]
慢病毒载体-plv-htert构建见上。将htert直接引入到ag03141 ws和wt成纤维细胞中。利用表达人oct4、sox2、klf4和c-myc的慢病毒颗粒，可诱导htert的细胞生成诱导多能干细胞。感染5天后，感染细胞培养两周，ipscs菌落出现在培养系统中。人工采集菌落，转
移到martigel涂层24孔板上，在mtesr培养基(stemcell,vancover,bc,canada)中培养扩增。为了传代，用accutase在37℃条件下处理汇合的ipscs 2分钟，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗，用2ml移液管的尖端从培养皿中刮掉。然后将细胞群收集到离心管中，按1:6的比例离心。为了描述ips克隆的特征，本发明使用免疫细胞化学染色检测了多功能标记物oct4、sox2、klr4和c-myc的表达。将诱导多能干细胞注射到scid/beige小鼠的后肢肌肉中，以检测其发生畸胎瘤的能力。采用rt-pcr及免疫荧光检测多效性基因oct4、sox2、klr4和c-myc的表达情况。用免疫荧光法检测三胚层表达标志蛋白afp、α-sma和tuj-1的表达，以证实ipsc细胞向三胚层的分化能力。
[0098]
用传统方法进行核型分析及wrn缺失的检测。细胞在人esc培养基中保持在丝裂霉素c灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)上，或在mtesr培养基中保持在matrigel(bd biosciences)上(stemcell technology)。采用αmem glutamax(invitrogen)、10％胎牛血清(fbs,gemcell)、1％青霉素/链霉素(invitrogen)、0.1mm非必需氨基酸(gibco)和1ng/ml bfgf(joint protein central)培养。
[0099]
(2)结果分析
[0100]
对健康人成纤维细胞和werner综合征患者成纤维细胞诱导为ipsci细胞(可诱导多能干细胞)的试验结果见图4。本实施例结果表明，本发明构建的osk/oskm，htert抗衰老疫苗，具有重编程因子的作用和诱导ipsc的活性。
[0101]
werner综合征(ws)，一种常染色体隐性疾病，由recq类解旋酶(wrn)基因突变引起，成年后出现过早衰老。本发明发现本实施例使用的特异性ws成纤维细胞为纯合子突变系，即使在低氧条件下，由于山中(yamanaka)因子在端粒酶催化单元htert的诱导上存在缺陷，使用该因子也很难被重编程。htert的异位表达恢复了ws成纤维细胞的tert水平，但效率较低(见图4a，图4b)。在此基础上，本发明应用osk/m，实现了诱导ipscs的成功，为了检测wrn缺陷多能干细胞的表型，本发明还进行了核型检测(见图4c)，证实ws成纤维细胞wrn表达缺失。为了证实ipsc细胞的多能性，本发明做了多能因子的pcr和免疫组化染色检测(见图4d)，说明ws成纤维细胞和wt细胞已经表达多能性因子并具有多能性分化特性，进一步地，本发明用免疫荧光法检测证实ipsc细胞表达分泌三胚层表达标志蛋白afp(内胚层)、α-sma(中胚层)和tuj-1(外胚层)，证明了用htert和osk/m诱导的ipsc细胞具有向三胚层的分化能力。同时，本发明也做了ipsc细胞的致肿瘤性检测，多能干细胞注射到scid/beige小鼠的后肢肌肉中，未见肿瘤生长。
[0102]
总之，上述结果表明，本发明的osk/oskm和htert抗衰老疫苗，不仅能使正常健康成人成纤维细胞诱导转化为ipsc细胞，更能够使werner综合征(wrn表达缺失)的成纤维细胞诱导转化为ipsc细胞。而且未诱导肿瘤生长。
[0103]
实施例4
[0104]
本实施例通过用本发明的htert疫苗，单独诱导ws和wt细胞重编程为ipsc细胞，进一步证明htert在重编程中的重要作用，也说明本发明的htert疫苗能够单独诱导ipsc细胞成功。
[0105]
(1)方法
[0106]
ws综合症患者的ag03141成纤维细胞，来源于wrn基因2476核苷酸c到t突变纯合子(c2476t)，导致终止密码子在748[gln748ter(q748x)突变。前期研究发现，该患者细胞缺乏
htert活性，osk不能诱导成为ipsc。为了证实本发明提供的htert疫苗的成功，直接用hpert进行诱导，同时，对该细胞进行了端粒长度和端粒酶活性的检测。
[0107]
1)端粒定量fish(q-fish)和流式fish分析：
[0108]
根据已发表的方法对ipscs端粒q-fish进行分析。简单地说，诱导的多能干细胞被转到superfrost加载片上。载玻片在液氮中冻融后，在0.1n hcl中培养10分钟。然后加入pna-端粒探针(panagene inc.，大田，韩国)。使用leica confocal tcs sp5对高分辨率图像进行采集和分析，并进行488nm连续激光扫描。简单地说,第一次细胞用4％pfa室温固定10分钟,10分钟后pbs洗，pbst洗，在20％甘油中重悬和孵化45分钟，然后收集细胞，在液氮冻融3-5次，去除细胞膜，处理后的细胞经3次冲洗(每次用pbst 5min,0.1nhcl 5min,pbst 5min)，准备端粒探针杂交。杂交时，首先将细胞与170μl杂交混合液充分混合于pcr管中，在黑暗条件下室温孵育10min。将带有杂交混合物的试管转移到87℃水浴中，孵育15分钟。将试管从水浴中取出后，在黑暗环境下杂交90～120分钟。杂交后，将细胞悬浮液从pcr管转移到1.5ml eppendorf管中，预充900μl洗涤液。细胞悬液1500g,16c离心5min，收集细胞颗粒。抽吸上清液，用剩余100μl缓冲液后，再加入1ml洗涤缓冲液。该洗涤步骤重复四次。最后将细胞重悬于300μl复染液中，冰上孵育20-60min。用流式细胞仪检测样品。在流式细胞仪(bd callibur ii)上进行，用flowjo进行分析。
[0109]
2)端粒酶活性测定：
[0110]
采用罗氏生物科学公司(roche bioscience,palo alto,ca,usa)的telo taggg端粒酶pcr elisa试剂盒测定端粒酶活性。简单地说，用200μl裂解试剂处理细胞微球，在冰上孵育30min。16000g裂解液在4℃下离心20分钟，收集上清液，用新的预冷ep管在适当的体积中混匀。未使用的上清液保存在-80℃，在85℃水浴中加热，10微升上清液作为后续pcr反应的阴性对照。基于pcr的分析。在含有2μl细胞裂解液的50μl反应混合物中进行。根据厂家提供的条件扩增样品、阳性对照(试剂盒提供)和阴性对照。pcr产物变性后与地高辛(dig)标记的端粒重复特异性检测探针杂交。所得产物通过生物素标记的引物固定在链霉亲和素包被的酶标板上。通过测定样品在450nm处的吸光度来检测端粒酶活性。
[0111]
(2)结果分析
[0112]
研究表明，htert诱导和端粒酶激活是细胞重编程所必需的。为了证实htert也能够单独诱导ipsc成功，本发明对ws和wt细胞进行了端粒活性检测和端粒长度扫描(见图5a-f)。由于tert或terc突变而导致端粒酶缺乏的细胞表现出低能力甚至失去重编程潜能。为了阐明ws成纤维细胞(ag03141)重编程失败的机制，本发明检测了这些细胞的htert表达和端粒酶活性，并确定内源性htert表达诱导受损是ws细胞重编程过程中的一个关键缺陷。在yamanaka因子编码的病毒感染后，ws细胞htert表达和端粒酶活性的增加有限(图4b)，而在健康成人重编程的wt成纤维细胞中观察到其强劲的诱导。可以想象，如此低水平的htert表达不足以阻止端粒缩短，从而抑制重编程。异位表达htert的确使ws细胞进行了重编程。除了在ws细胞中观察到htert表达缺陷外，端粒缩短加速可能是ipscs的另一层屏障。recq解旋酶是端粒维持所必需的，其功能缺失突变会显著破坏端粒的稳定。事实上，端粒过度侵蚀在ws细胞中广泛存在，并在ws患者中作为早衰和衰老相关疾病发病的驱动力。因此，端粒功能障碍在ws-derived细胞中很容易发生不同程度的功能障碍，并导致重编程的干扰。然而，本发明中使用的ws和wt成纤维细胞的平均端粒长度相当(图5e)，而ipscs仅由正常wt细胞
诱导生成。为了解决这个问题，本发明进一步在单细胞水平上进行了q-fish，并注意到ws和wt成纤维细胞在端粒长度(tl)中均存在显著的异质性。wt成纤维细胞携带最长端粒的比例远高于ws细胞。很可能tl的阈值水平是ipscs重新编程所必需的，而端粒越长，细胞就越有优势。正如本实施例和其他报告所显示的，htert通过延长端粒可显著提高正常细胞的ipsc效率。
[0113]
总之，本实施例结果进一步说明，本发明的htert疫苗，也能单独诱导ws和wt细胞重编程为ipsc细胞。说明不仅是重编程因子能诱导ipsc细胞，htert抗衰老疫苗也能单独诱导。
[0114]
实施例5
[0115]
本实施例为抗衰老疫苗的部分重编程有效性和安全性的进一步检测。实施例1～4的完全重编程诱导ipsc细胞成功，已经证明了本发明疫苗的有效性和安全性，但部分重编程将是未来临床可能主要的应用方式，因此，需要进一步进行动物试验检测其部分重编程的有效性和安全性。,
[0116]
(1)方法
[0117]
动物选择c57bl6/j及老年野生型小鼠，24月龄。所有的动物工作按照日内瓦动物保护公约，及国家有关动物保护条例和动物试验法则进行，并得到了有关动物护理和使用委员会(iacucs)的批准。60只小鼠，分为6组x10/组：mran疫苗osk、oskm组及htert组；aav疫苗osk/oskm组，以及rv疫苗(逆转录病毒)htert组。
[0118]
将小鼠osk/oskm cdna克隆到由四环素响应元件(tre3g启动子)和sv40元件组成的aav质粒中，制备aav-tre-osk/oskm系列载体(见上述)。mrna osk/oskm/htert疫苗构建如同上述。其他自制载体采用类似的方法或直接化学合成。
[0119]
诱导osk表达。强力霉素(1mg/ml；mp biochemicals)于aav注射后3周，连续一年给药至试验结束。mrna疫苗分组注射多能干细胞到小鼠的后肢肌肉中，每周注射一次，连续一年给药观察。
[0120]
rt-pcr检测oskm及和htert表达，及相关成肿瘤性因子检测。小鼠的尾尖成纤维细胞，在37℃下用含有非必需氨基酸、10％不含四环素胎牛血清的dmem(invitrogen)培养(takara bio，631106)含1％青霉素/链霉素(thermofisher scientific,15140122)。提取细胞dna，按常规pcr操作说明进行。
[0121]
dna提取和甲基化分析：
[0122]
dna甲基化年龄检测，增加1月龄小鼠，与24月龄小鼠对照研究。按上述抗衰老疫苗接种处理进行。使用qiagen dna提取试剂盒(cat#51304)，从200-300万个细胞/样本中提取和纯化dna。为了去除rna，在dna提取过程中，在细胞悬液缓冲液中加入rnaase(thermofisher cat#en0531，终值100μg/ml)。根据制造商的说明，在illumina 450k阵列上测量dna甲基化水平。illumina beadchip(450k)测量了人类基因组中不同cpg位点基于亚硫酸氢盐转换的单cpg分辨率dnam水平。该数据是根据illumina甲基化分析的标准方案生成的，该标准方案通过使用甲基化和未甲基化等位基因之间的强度比值的β值来量化甲基化水平。具体来说，根据甲基化(m对应信号a)和未甲基化(u对应信号b)等位基因的强度计算得到β值，即荧光信号β的比值＝max(m,0)/[max(m,0) max(u,0) 100]。因此，β值范围从0(完全未甲基化)到1(完全甲基化)。
[0123]
dnam老化签名：
[0124]
为了评估产生的甲基化老化特征，本发明使用双加权修正(biweightmidcorrelation)来评估cpgs的年龄趋势。考虑到样本来自发育中的动物(1个月大的老鼠)，本发明应用了年龄转换。这种转变反映了开发过程中的非线性变化。然后应用双加权修正来测试损伤和osk治疗后cpgs变化的相关性，并通过四项测试对结果进行比较。在所有四项测试中绝对双加权最强的前30％cpgs中，并显示出相关性方向一致的cpgs被选择。(例如两批都随年龄而低甲基化，随损伤而低甲基化,随osk而超甲基化hypermethylated)。在考虑的703，583个cpg中，选择了1226个(723个随年龄增长呈高甲基化趋势，503个随年龄增长呈低甲基化趋势，主成分分析(pca)是使用1mo的训练样本,进行控制(n＝14)。pc1解释了本样本中25％的方差。因此，pc1被用来代表老化签名，并被标准化为均值＝0和s.d.＝1。然后对独立验证样本中的老化签名进行分析，以测试与年龄和osk的相关性。
[0125]
(2)结果分析
[0126]
本实施例结果见图6。如图所示，老年小鼠经过本发明的抗衰老疫苗强化注射，如mrna osk和htert疫苗每周股骨肌注射一次，avv osk疫苗每周强化诱导五天，主要是观察疫苗的安全性。安全第一是基本准则。在强化注射一年后，没有动物死亡，没有肿瘤形成。相反，疫苗的抗衰老作用明显体现。动物的毛色、体重和反应能力明显改善。老年小鼠的脱毛、无光泽基本消失，体重也增加约5-10％，动物的活动能力和反应能力明显增强。也就是说，从表观上恢复了年轻化。
[0127]
本发明特别观察了oskm和htert的表达水平。如图6a所示，oskm和htert分泌明显增加，但可能致肿瘤的有关因子没有显著差异(图6b)。dna甲基化年龄与一月龄小鼠相比较，老年小鼠明显增加，经过疫苗治疗后，老年小鼠的dna甲基化年龄和dnam老化签名明显降低(图6c，6d)。
[0128]
总之，本实施例结果说明，本发明提供的抗衰老mrna osk/oskm和htert疫苗，以及腺病毒avv osk疫苗，不仅疗效显著，使老年小鼠的实际表观年龄及dna甲基化年龄明显年轻化，而且非常安全。强化一年治疗，未见肿瘤形成。
[0129]
实施例6
[0130]
本实施例通过对老年小鼠和青光眼小鼠的抗衰老治疗，观察小鼠的视力，以及dna甲基化年龄的恢复情况，进一步证实抗衰老疫苗对老年小鼠神经损失恢复的疗效。
[0131]
(1)方法
[0132]
青光眼是世界范围内年龄相关性失明的主要原因，其特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，rgcs)及其轴突的进行性丧失，并经常伴有眼压升高。通过将微珠注射到前房，单侧诱导眼内压(iop)升高21天，同时注射生理盐水作为非青光眼对照组。在4周时间点在体内注射mrna-osk、mrna-htert、aav-osk抗衰老疫苗，并诱导osk表达再持续4周。与接受pbs或mrna、aav且无osk诱导(osk)的青光眼对比。
[0133]
另外，对自然老化引起的视力丧失也进行了抗衰老疫苗的对照治疗观察。本发明对3个月和12个月大的小鼠使用mrna-osk/htert或aavs-osk，并诱导osk 4周。然后进行了omr和perg的测量观察。在没有osk诱导的情况下，1岁时视力显著降低，osk诱导恢复了视力。
[0134]
微珠诱导眼压升高：
[0135]
聚苯乙烯微珠(fluospheres；表达载体,卡尔斯巴德,ca)在外科显微镜下，可以观察到每只动物右眼的前房后注射。简单地说，在无菌生理盐水中以5
×
106珠/ml的浓度制备微珠。使用锋利的玻璃微移液管连接到汉密尔顿注射器(world precision instruments inc.，sarasota,fl)，通过角膜切口将2μl体积的液体注入前房，然后用一个气泡防止渗漏。任何出现炎症症状(角膜混浊或水肿)的小鼠都被排除在外。
[0136]
眼内压(iop)测量：
[0137]
用反弹tonolab眼压计(colonial medical supply,espoo,finland)测量眼内压(iop)。小鼠用3％的氧异氟醚麻醉(诱导麻醉)，随后用精密汽化器给予1.5％的氧异氟醚麻醉(维持麻醉)。iop测量是在脚趾或尾巴挤压反射丧失后2～3分钟内开始。麻醉的老鼠被放置在平台上，压力传感器的尖端被放置在离角膜中央大约1/8英寸的地方。剔除最高和最低值后，平均iop在6次测量后自动显示。机器生成的平均值为一个读数，每只眼睛获得6个读数。由于全天iop的变化，所有iops都是在当天的同一时间(10点至12点)采集。
[0138]
使用基于视动反射的空间频率阈值测试小鼠的视敏度：
[0139]
老鼠被放置在由四边形排列的四个电脑显示器组成的区域中心的一个基座上。显示器显示一个移动的垂直黑白正弦光栅图案。一个失明的观察者，无法看到移动条的方向，监视鼠标的跟踪行为。当头部运动(运动反应)到杆的方向或身体在与刺激一致的方向旋转时，追踪运动认为是主动和有视力。根据光栅的旋转方向分别对每只眼进行测试。采用阶梯法测定空间频率，起始频率为0.15～0.40cycles/deg，间隔为0.05cycles/deg。旋转速度(12/s)和对比度(100％)保持恒定。对动物组和治疗不知情的个体在治疗前后测量了反应。在玻璃体内注射或注射后发生玻璃体内出血或出现炎症症状(角膜混浊或水肿)的小鼠被排除在omr和组织学分析之外。
[0140]
(2)结果分析
[0141]
青光眼小鼠osk疫苗治疗前后视力功能恢复见图7a，接受osk治疗小鼠的视力显著提高，在视动反应(omr)试验中恢复了约一半的视力(图7a)。这是青光眼损伤发生后osk疫苗逆转视力下降的先例，此前的尝试主要集中在早期提供神经保护，以防止疾病进一步进展。osk疫苗诱导可有效恢复损伤后视网膜神经节细胞(rgcs)的dnam年龄(图7b)，提示自然老化引起的视力丧失也可能是可逆的。为了验证这一点，本发明对3个月和12个月大的小鼠使用mrna-osk/htert和aavs-osk疫苗，并诱导osk 4周(图7c)。然后进行了omr和perg的测量。osk诱导恢复了老年小鼠的视力损失及老化的dna甲基化年龄损失(图7d)。
[0142]
总之，本实施例通过对老年小鼠和青光眼小鼠的抗衰老疫苗治疗，小鼠不但恢复了视力，而且表观遗传甲基化修饰也获得了年轻化。进一步证实经抗衰老疫苗osk重编程因子诱导，对老年小鼠抗衰老和视神经损伤和视力恢复非常有疗效。
[0143]
实施例7
[0144]
本实施例通过对工厂、大学、实验室及养老院的400名健康志愿者进行了抗衰老疫苗临床试验，进一步在人体观察本发明抗衰老疫苗的安全性和有效性。
[0145]
(1)方法
[0146]
志愿者年龄划分，20-35岁为青年，35-55岁为中年，大于55岁为老年。男女比例均等，平均年龄48.5岁。体检排除肿瘤患者、严重过敏史患者和肝肾功能异常者。根据年龄分
为青年组，平均年龄29.5岁、中年组平均年龄47.4岁、老年组平均年龄68.6岁，和对照组平均年龄45.8岁，每组100人。每30日上肢皮下深部注射本发明提供的mrna-osk脂质体包裹疫苗一支，50微升/50微克/支。由职业医务人员按疫苗接种要求，按医疗常规进行接种。接种完成后至少观察30分钟尚可离开。
[0147]
所有项目均按照国家药检局疫苗和药品临床试验要求及国家法律法规要求进行。所有人员试验开始前完成志愿者协议签字，并完成血生化、肝肾功能、血脂血糖、血尿便常规、血沉、胸部x线片、肿瘤标记物全套项目检查。以及dna甲基化年龄检测(试验方法见上述)。体检项目完成后，发现老年组有40人血脂高，30人血糖高，50人血压高。中年组30人高血脂，20人高血糖，40人高血压。都继续进行服药治疗。
[0148]
观察指标：精神状态、食欲、睡眠、体力、反应能力、性欲能力及毛发、指甲生长状态、面部颜色、声音和精气神状态。均包含有差、正常、好、佳四个等级进行统计。
[0149]
试验时间12个月，试验完成后，均需进行上述血生化和全套体检项目，并再次进行dna甲基化年龄检测。
[0150]
(2)结果分析
[0151]
所有志愿者均全程完成了临床试验，无一人因不适或有不良反应退出或提前退出。试验完成时的所有生化、肿瘤标记物均无异常，未发现肿瘤生长。中老年组的高血压、高血脂和高血糖患者，有57％的人已经停止了治疗药物服用，其余43％的人全都减低了药量。
[0152]
特别值得指出的是，所有志愿者均感到自己年轻了，有活力了，有体力了，食欲睡眠精神状态均有改善，特别是老年组，感受最明显。具体结果见图8。
[0153]
志愿者的精神状态、食欲、睡眠、体力、反应能力、性欲能力均明显改善(图8a)；志愿者的毛发、指甲生长状态、面部颜色、声音和精气神状态也同样改善明显(图8b)。特别是老年组改善最明显。
[0154]
另外，中老年组有40人血脂高，30人血糖高，50人血压高。中年组30人高血脂，20人高血糖，40人高血压，均继续进行服药治疗。osk疫苗治疗后，有57％的人已经停止了治疗药物服用，其余43％的人全都减低了药量(见图8c，图8d)。
[0155]
特别有意义的是，osk疫苗治疗后，志愿者的整体dna甲基化年龄都明显降低，说明他们都年轻了。人年轻了，整体健康状态就会改善，年龄相关性疾病就会减少或消失。这在本实施中也进一步得到了证实。
[0156]
总之，本实施例说明，本发明提供的osk疫苗，通过部分重编程因子的诱导，在人体实现了表观遗传修饰改善，使dna甲基化年龄明显下降，年龄相关性疾病明显恢复。通过疫苗使人年轻，真正使人实现返老还童或返老还新，这在人类历史上尚是首次。
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应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。