用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物及其筛选方法和应用与流程

1.本发明属于抗青枯病烟草的筛选技术领域，特别是筛选烟草抗青枯病育种材料的相斥相分子标记方法。


背景技术：

2.烟草是卷烟的主要原料作物，也是中国的重要经济作物，而品种是烟叶生产的基础。近年来，由于连作年限的延长，青枯病在烟草上的危害日趋严重，严重降低了烟草产量和品质，已成为烟叶生产的重要制约因素。虽然农业综合防治和化学药剂防治等方法对防治青枯病有一定作用，但实践证明，种植抗青枯病品种是控制青枯病危害的最经济有效的方法。
3.烟草青枯病是一种由雷尔氏细菌(ralstoniasolanacearum)寄生引起的细菌性土传病，是威胁世界烟草生产的毁灭性病害。烟草上抗青枯病育种使用的抗原品种主要是ti448a，但ti448a及其衍生烟草品种对青枯病的抗性是由多对加性基因控制的，表现为数量性状遗传特点。传统的个体选择方法是对符合育种目标的农艺性状如高产、优质、抗病等进行直接选择，即选择的是个体表现型而不是基因型。一般而言，这种方法对质量性状的选择是有效的；但对于数量性状的选择，由于存在一因多效、多因一效、调控基因以及修饰基因等的作用，个体的表现型与基因型存在较大差异。因此，通过田间表型性状进行个体选择的准确性较差。尽管传统的育种方法在抗青枯病品种的选育中取得了不少成绩，但由于青枯病病害的复杂性，受环境影响很大，导致抗病品种的选育进展缓慢。
4.据大量报道，根据抗病性状遗传规律建立的分子标记辅助选择(mas)技术能减少基因间、环境和基因型互作等影响，可提高筛选效率，加快育种进程。例如中国专利申请cn112410463a提供了一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用，其公开了一种用于鉴定番茄抗青枯病基因型，或鉴定番茄抗青枯病品种的snp分子标记。然而，虽然番茄和烟草同属于茄科植物，但是其具体的品种不同，其发挥抗青枯病的基因型也会存在明显差异。又例如cn113278729b提供了一种烟草青枯病的snp分子标记、其获得方法及其应用，然而这种snp分子标记(基因上单个核苷酸变异形成的遗传标记)在电泳前必须进行酶切，将snp分子可标记转化为可应用的pcr标记，而且对电泳凝胶要求高，一般用page胶才行，操作繁琐，稳定性差，成本高。此外，该标记需要通过条带数量来区分抗病纯合植株、抗病杂合植株和感病纯合植株。
5.由此可见，目前国内外虽然开发了少量与抗青枯病相关的通常类型的分子标记，但令人遗憾的是，由于烟草青枯病抗性属于数量遗传，这些分子标记与育种辅助选择利用要求相距甚远；至今仅发现了极少量的分子标记能直接应用于烟草抗青枯病品种筛选上。因此，开发出能用于抗青枯病烟草品种选育的分子标记是一项非常迫切的工作。


技术实现要素：

6.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物，以及利用这种相斥相分子或引物，筛选具有抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法。采用该方法既可以鉴别出抗青枯病品种和感青枯病品种，也可以将杂种后代群体中感青枯病植株全部剔除，剩下的即为抗病植株，进而将剩下的植株培育成抗青枯病品种。具体通过以下技术实现。
7.用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记，为烟草基因4370的相斥相分子标记，或烟草基因37372的相斥相分子标记；
8.烟草基因4370的相斥相分子标记引物扩增的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；烟草基因37372的相斥相分子标记引物扩增的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。
9.相比于现有技术cn113278729b，本发明的相斥相分子标记是直接根据基因序列设计的，检测方便，pcr扩增后直接电泳就可以检测，无需酶切等繁琐的步骤，操作方便简单，稳定性好。
10.上述烟草基因4370的cds序列(编码序列)如序列表seq id no.7所示；上述烟草基因4370的dna序列如序列表seq id no.8所示；上述烟草基因37372的cds序列(编码序列)如序列表seq id no.9所示；上述烟草基因37372的dna序列如序列表seq id no.10所示。
11.本发明还提供了一种用于扩增上述相斥相分子标记的引物对，扩增烟草基因4370的相斥相分子标记的utr引物对中，正向引物和反向引物的长度为18-25bp，gc含量30-60％，复性温度为56-62℃，pcr产物的长度为100-350bp；
12.扩增烟草基因37372的相斥相分子标记的ssr引物对中，正向引物和反向引物的长度为18-25bp，gc含量为30-60％，复性温度为56-62℃，pcr产物长度为100-350bp。
13.本发明的引物是相斥相标记，可以排除杂合基因的干扰。若有标记，则表明该育种材料或品种不抗青枯病，可同时剔除纯合和杂合不抗病基因型；若无标记，则表明该育种材料或品种抗青枯病，可筛选纯合抗病基因型。因此，本发明只需要根据条带有无来区分抗病和感病植株，非常简单。
14.优选地，扩增烟草基因4370的相斥相分子标记的utr引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；即：
15.正向引物：5
′‑
gcatgagatacattaagccaaaatc-3
′
；
16.反向引物：5
′‑
cctggagccatcactggg-3
′
；
17.扩增烟草基因37372的相斥相分子标记的ssr引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；即：
18.正向引物：5
′‑
gtactctcgtaactgcagcattaaa-3
′
；
19.反向引物：5
′‑
tgagccatcacaggaaagaag-3
′
。
20.本发明的申请人以抗青枯病和感青枯病烟草品种为研究材料，对其在青枯病菌侵染条件下的基因差异表达进行了分析。通过对转录组数据的kegg分析，发现感染后24h的苯丙烷代谢通路，抗感品种出现显著差异，即抗病品种较感病品种而言，其苯丙烷代谢通路的支路东莨菪苷代谢出现显著上调表达，且东莨菪苷与抗青枯病病有重要的关系。
21.申请人由此获得一些有价值的基因片段，并对这些基因片段采用crispr/cas9技术进行验证，对编辑率较高的t1代进行青枯病接菌鉴定，从中发现烟草抗青枯病密切相关
基因id：gene_4370(scopoletinglucosyltransferaselike)和id：gene_37372(scopoletinglucosyltransferase)。申请人进一步针对这两个基因设计了不同分子标记引物，通过pcr扩增，发现开发的两个基因的分子标记均为相斥相分子标记，即与目标性状相斥连锁的分子标记。如果有分子标记，则植株不表现目标性状；如果无分子标记，则植株表现目标性状。申请人通过反复的实验得以验证，凡是感青枯病品种均显示电泳条带，而抗青枯病品种均不显示电泳条带。
22.因此，申请人确认，这两个相斥相分子标记可用于烟草抗青枯病品种辅助选择育种。通过采用上述相斥相分子标记的选择，可将群体中含标记的感青枯病植株全部剔除，仅剩下无标记的抗病植株，有效克服了常规类型的分子标记对数量性状选择的低效性问题。
23.本发明还提供了一种检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法，可以针对上述相斥相分子标记，或直接使用上述相斥相分子标记的引物对，进行抗青枯病的烟草育种材料或品种的检测或筛选。
24.优选地，上述相斥相分子标记的应用方法，包括以下步骤：
25.s1、提取并以待测的烟草育种材料或品种的dna为扩增模板，使用扩增烟草基因37372的相斥相分子标记的引物对，或扩增烟草基因4370的相斥相分子标记的引物对进行pcr扩增；
26.s2、利用电泳分离技术读取差异条带；如果电泳凝胶上显示条带，则待测烟草育种材料或品种不抗青枯病；若不显示条带，则待测烟草育种材料或品种抗青枯病。
27.优选地，步骤s1中，pcr扩增反应体系为：16.1μl的ddh2o、2μl的10
×
buffer、0.3μl的dntp、0.2μl的正向引物、0.2μl的反向引物、0.2μl的easytaq pcr、1μl的cdna，反应体积为20μl；
28.反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度为56℃30s，72℃30s，34个循环，72℃延伸7min。
29.优选地，上述应用方法中，步骤s2的电泳分离技术采用全自动毛细管电泳系统或凝胶电泳。
30.更优选地，步骤s2中，电泳分离技术采用全自动毛细管电泳系统时，则按系统的说明书要求进行操作，采用型号为800和900的fa dsdna gel，选择系统携带的gel primer ouly电泳程序进行电泳，电泳时间60min，电泳结束后采用系统自带软件分析电泳结果并读取差异条带。
31.更优选地，步骤s2中，电泳分离技术采用凝胶电泳时，采用银染技术显色并读取差异条带，银染技术的试剂包括固定液、染色液和显色液；
32.所述固定液是将冰醋酸加至ddh2o中制成，且冰醋酸浓度为10％；所述染色液是将agno3和甲醛加至ddh2o中制成，且agno3浓度为1g/l，甲醛浓度为0.056％；所述显色液是将na2co3、甲醛、na2s2o3·
5h2o加至ddh2o中制成，且na2co3浓度为30g/l，甲醛浓度为0.056％，na2s2o3浓度为2mg/l。
33.进一步优选地，步骤s2中，银染技术的染色过程为：
34.s21、将电泳凝胶放置于固定液中，滴入二甲苯青指示剂，振荡30min，直至溶液变无色；取出电泳凝胶用ddh2o漂洗，沥干，重复处理2次；
35.s22、将电泳凝胶放入染色液中，振荡30min；取出电泳凝胶用ddh2o漂洗5-10s；
36.s23、将电泳凝胶放入显色液中，迅速摇动10s，倒掉显色液；再次倒入显色液继续显色直至显色；显色后取出电泳凝胶放入固定液终止显色，轻轻摇动5min后，用自来水冲洗干净。
37.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
38.1、本发明利用反向遗传学的方法首次公开了烟草类东莨菪内酯糖基转移酶(scopoletinglucosyltransferase-like)基因id：gene_4370和东莨菪内酯糖基转移酶(scopoletinglucosyltransferase)基因id：gene_37372在调控烟草对青枯病抗性中的应用；
39.2、本发明在国际上首次获得2个与烟草抗青枯病密切相关基因id：gene_4370和id：gene_37372的相斥相分子标记；可直接应用于烟草抗、感青枯病育种材料或品种的鉴别，可同时剔除纯合和杂合不抗病基因型，而筛选出纯合抗病基因型，显著提高了抗青枯病育种材料或品种的鉴别准确性和鉴别效率；还可辅助应用于烟草育种，不仅有效克服了性状表型鉴定的困难，还克服了通常类型分子标记在对数量性状选择时的低效性问题，避免了表型推测基因型不准确等缺点。
40.3、由于目前用于qti、作图所用群体较小，qtl上位性检测能力较弱，可能低估qtl上位性效应，进而影响应用通常类型分子标记进行分子标记辅助选择的效率。采用本发明获得的相斥相分子标记，就可以将群体中感青枯病植株全部剔除，剩下的全部为抗病植株，进而提高分子标记辅助选择的效率，更好地发挥分子标记辅助选择在作物育种中的重要作用；
41.4、应用本发明方法可在苗期完成烟草抗青枯病育种材料或品种筛选，不受环境和表型鉴定影响，显著减少田间种植群体的大小，节约人力、物力和财力，大大降低了工作量，加快了育种进程。
附图说明
42.图1为基因id：gene_4370的相斥相分子标记的utr引物对在seq id no.8序列上的插入位点；
43.图2为基因id：gene_37372的相斥相分子标记的ssr引物对在seq id no.10序列上的插入位点；；
44.图3为基因id：gene_4370分子标记胶图。图中，1：岩烟97；2：db101；3：corker176；4：反帝三号；5：系3；6：毕纳1号；7：rg17；8：nc95；9：ht05；10：ti448a；11：红花大金元；12：长脖黄；13：翠碧1号；14：中烟90；15：中烟100；16：nc89；17：6388；18：云烟100；19：云烟85；20：b0851；r：抗青枯病；s：感青枯病；
45.图4为基因id：gene_37372分子标记胶图。图中，1：岩烟97；2：红花大金元；r：抗青枯病；s：感青枯病。
具体实施方式
46.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例1：与烟草抗青枯病密切相关基因id：gene_4370和id：gene_37372的发现与功能验证
48.采用易感青枯病品种“红花大金元”和高抗青枯病品种“岩烟97”作为实验材料。将两份材料的种子消毒处理后播种于ms固体培养基(采购自coolaber公司)中；长出小苗后，单独移栽至分装的ms培养基中光照培养，待烟苗长至5-6片真叶时，选取长势相近的同一批烟苗，以湖北致病力较强的青枯菌小种lc3-6(由湖北省烟草科学研究院烟草病虫害研究中心提供)为菌株材料，采用茎部注射法接种病原菌。
49.分别于接种后0h、12h、24h、36h、48h、3d、5d时间点取样，每个时间点实验和对照各两颗苗混合取样，共78个样品(包含3组生物学重复)，分别用天根试剂盒(采购自天根生物科技有限公司)提取总rna。
50.通过对转录组数据的kegg分析，发现感染后24h的苯丙烷代谢通路，抗感品种出现显著差异，即抗病品种较感病品种而言，其苯丙烷代谢通路的支路东莨菪苷代谢出现显著上调表达。采用crispr/cas9技术进行进一步的结果验证，从东莨菪苷代谢支路中挑选一些上调表达特别显著的基因，利用重叠延伸pcr、infusion连接反应构建入含有u6-7启动子的crispr表达载体(由华中农业大学棉花课题组提供)中，crispr载体构建完成之后，以材料岩烟97品种为转化材料，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了19个特定基因敲除的转基因烟草，并获得了t0代的种子。
51.通过对t0代植株的hi-tom靶点检测，发现阳性植株存在多种编辑类型，完全被编辑的植株每个基因都有5株以上，可以满足后续的研究。于是，每个基因随机挑选3个系，每个系种6棵植株，并对每棵植株进行hi-tom靶点检测。
52.结果发现，在预测的编辑位点确实发生了不同程度的缺失和插入情况，编辑率偏高的靶点可以达到60-70％。进一步分别对每个基因的3个系中检测编辑率较高的植株进行接菌抗病验证，统计不同基因和不同系的发病情况，发现基因id：gene_4370和id：gene_37372这2个基因与烟草青枯病抗性密切相关。
53.分别用tiangen公司植物基因组dna提取试剂盒提取易感青枯病品种红花大金元和高抗青枯病品种岩烟97植株的dna，进一步针对这2个候选基因设计了不同分子标记引物，并对红花大金元和岩烟97的dna进行pcr扩增，通过电泳技术检测分子标记，结果均在抗感材料中得到了不同的带型，证实这两个基因确与烟草青枯病抗性密切相关。
54.基因id：gene_4370和id：gene_37372分子标记胶图如图3、4所示。图3中，1号孔为抗病品种岩烟97，11号孔为感病品种红花大金元；图4中，r为抗病品种岩烟97、s为感病品种红花大金元。
55.通过测序，基因id：gene_4370(ncbi id:107800062)基因cds序列如seq id no.7所示，dna序列如序列表seq id no.8所示。基因id：gene_37372(ncbi id基因cds序列如seq id no.9所示，dna序列如序列表seq id no.10所示。
56.实施例2：基因id：gene_4370(ncbi id:107800062)相斥相分子标记的开发与验证
57.首先，使用软件batchprimer3(https://wheat.pw.usda.gov/demos/batchprimer3/)基于基因id：gene_4370的相斥相分子标记序列(utr序列)开发相应的utr引物对，其中：
58.正向引物：5
′‑
gcatgagatacattaagccaaaatc-3
′
；
59.反向引物：5
′‑
cctggagccatcactggg-3
′
；
60.插入位点如图1所示。图1中，utr分子标记位点为seq id no.8所示序列自5’端起第5位碱基的位点g，所述电泳产生的254bp条带的材料为感病品种。
61.然后，用tiangen公司植物基因组dna提取试剂盒分别提取高抗青枯病品种岩烟97、db101、corker176、反帝三号、系3、毕纳1号、rg17、nc95、ht05、ti448a和高感青枯病品种红花大金元、长脖黄、翠碧1号、中烟90、中烟100、nc89、6388、云烟100、云烟85、b0851植株的基因组dna；
62.高抗青枯病品种岩烟97、db101、反帝三号、系3、rg17、ti448a，以及高感青枯病品种翠碧1号、由福建省烟草农业科学研究所提供；
63.高抗青枯病品种corker176、nc95，以及高感青枯病品种红花大金元、nc89由安徽省农科院烟草研究所提供；
64.高抗青枯病品种毕纳1号由贵州省烟草公司毕节市公司提供；
65.高抗青枯病品种ht05、由湖南省烟草公司永州市公司提供
66.高感青枯病品种长脖黄、6388由河南农业科学院烟草研究所提供；
67.高感青枯病品种中烟90、中烟100由中国农科院烟草研究所提供；
68.高感青枯病品种云烟100、云烟85由云南省烟草农业科学研究院提供；
69.高感青枯病品种b0851为湖北省烟草科学研究院自行培育的品种。
70.接着，采用所设计的上述utr引物对所提取的上述20个烟草品种基因组dna进行pcr扩增。pcr扩增反应体积为20μl，其中包括16.1μl的ddh2o、2μl的10
×
buffer、0.3μl的dntp、0.2μl的正向引物、0.2μl的反向引物、0.2μl的easytaq pcr、1μl的cdna。
71.扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，退火温度为56℃30s，72℃30s，34个循环，72℃延伸7min。
72.最后，利用毛细管电泳仪器fragment analyzer(fa)和zero agarose gel(zag)，按仪器操作说明书进行电泳分离，并读取差异条带。
73.电泳试剂准备方法如下。
74.(1)配胶：采用型号为800和900的fa dsdna gel，参考下表所列毛细管配胶用量进行配胶。配胶操作为：用干净的量筒量取胶，然后转入250ml锥底瓶，用移液枪吸取荧光试剂(intercalation dye-profect from light)。插入胶面以下缓慢加入，然后倾斜锥底瓶缓慢旋转使其混合均匀。毛细管配胶用量如下表1所示。
75.表1毛细管配胶用量
[0076][0077]
试剂5
×
930 dsdna inlet buffer：稀释5倍，加入96孔深孔板，每孔1.1ml。
[0078]
试剂5
×
capillary conditioning buffer：稀释5倍，转入250ml锥底瓶。
[0079]
storage solution：用pcr板分装，每孔100μl。
[0080]
试剂maker：用pcr板分装，每孔33μl。
ddh2o中，点完样后，放在-20℃预冷。在使用前几分钟加入6ml 37％甲醛和400μl浓度为10mg/ml的硫代硫酸钠。
[0103]
染色过程为：
[0104]
(1)固定：将粘附胶的长玻璃板放置于固定液中，置于摇床上振荡30min，直至二甲苯青全部消失即可；
[0105]
(2)漂洗：将玻璃板放置于ddh2o中，漂洗3min，将玻璃板取出，稍微沥干，重复处理2次；
[0106]
(3)染色：将玻璃板放入准备好的装有染色液的塑料盒中，放在摇床上振荡30min；
[0107]
(4)漂洗：将玻璃板从染色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，时间严格控制在5-10秒内；
[0108]
(5)显色：将玻璃板放入1l显色液中，迅速摇动10s，倒掉显色液，导入剩余显色液继续显色。显色后，放入固定液终止显色反应。轻轻摇动5min后，再将玻璃板用自来水冲洗干净。
[0109]
所得分子标记胶图如4所示。图4中，左边为抗性品种岩烟97、右边为感病品种红花大金元。图4的分子标记胶图结果表明，高感青枯病品种红花大金元显示出条带，而高抗青枯病品种岩烟97不显示条带。这说明基于基因id：gene_37372核苷酸序列所开发的上述ssr引物为相斥相分子标记，可用于烟草抗青枯病品种的鉴别和分子标记辅助选择育种。在实际应用中，可根据分子标记聚丙烯酰胺凝胶上是否显示条带来筛选烟草抗青枯病育种材料或品种，若有条带，则表明该育种材料或品种不抗青枯病并予以剔除；若无条带，则表明该育种材料或品种抗青枯病并予以保留。