工程化免疫细胞的制作方法

1.本发明涉及控制工程化免疫细胞中靶蛋白表达的方法。特别地，本发明涉及通过在细胞内区室中的保留来控制至少两种靶蛋白的表达的方法。
2.发明背景
3.经典地，表面表达的蛋白质通过信号肽序列被引导至内质网(er)，并通过一个或多个疏水性螺旋跨膜结构域锚定在er的膜中。这些蛋白质在er中折叠并通过分泌途径迁移到细胞表面。
4.er中的一些蛋白质被引导至高尔基体而非分泌途径，因此不在细胞表面表达。多种基序将蛋白质引导至高尔基体。
5.最典型的此类基序之一为“sekdel”基序。该基序在蛋白质末端羧基末端的表达将蛋白质从er引导至高尔基体。该基序可用于将通常不会迁移至高尔基体的蛋白质从er引导至高尔基体。例如，pelham等人(methods enzymol.327,279
–
283(2000))描述了具有羧基末端sekdel的单链可变片段(scfv)的表达可以将其同源靶标引导至高尔基体，从而减少或敲除同源靶标的表面表达(参见图1)。
6.单结构域抗体片段(dab)由于其固有的稳定性和简单性，非常适合“sekdel敲低”。
7.在某些情况下，可能期望多种蛋白质的表面表达的降低。这需要许多不同dab-sekdel融合体的共表达。多种转基因蛋白的共表达较为困难，通常需要多次转导(其带有插入诱变的风险)和/或多个内部启动子(其导致启动子干扰和沉默)。此外，诸如内部核糖体进入序列(ires)的基序会导致下游蛋白质低得多的表达。
8.一种替代方法是口蹄疫2a或2a样序列的使用。donnelly等人(j.gen.virol.82,1027
–
1041(2001))描述了这些被非常有效地切割的短肽序列。在某些情况下，具有2a肽的单个开放阅读框是表达多种转基因蛋白的唯一方法，因此迄今为止，在某些情况下，2a肽的使用是可以用sekdel敲低来敲除多种表面蛋白的唯一方法。
9.2a肽的限制是其切割导致2a肽的15-20个残留碱基(终末脯氨酸除外)保留在转基因蛋白的羧基末端。这些残留碱基可抑制sekdel识别，例如通过当这些残留碱基紧邻sekdel细胞内保留信号的c末端时掩蔽sekdel基序。
10.因此，仍然需要能够减少或敲低多种靶蛋白的方法。
11.发明概述
12.本发明人已经开发了一系列能够降低或敲低一种或多种靶蛋白的表达的工程化蛋白质。
13.在第一方面，本发明提供了工程化免疫细胞，其包含：
14.(i)靶标结合多肽，其包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和
15.(ii)定位多肽，其包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
16.该细胞可以包含：
17.(i)至少两个靶标结合多肽，其中每个靶标结合多肽包含靶标结合结构域和第一
蛋白相互作用结构域；和
18.(ii)定位多肽，其包含与每个靶标结合多肽的第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
19.至少两个靶标结合多肽可以结合相同的靶蛋白。例如，所述至少两个靶标结合多肽可以结合相同靶蛋白的不同表位。在这方面，两个或更多个靶标结合多肽可以协同发挥作用以引起靶蛋白在细胞内区室中的保留。
20.或者，至少两个靶标结合多肽可以结合不同的靶蛋白。在这方面，两个或更多个靶标结合多肽可以独立作用以引起两种或更多种靶蛋白在细胞内区室中的保留。
21.细胞内保留信号可以选自下组：高尔基体保留序列；跨高尔基体网络(tgn)回收信号；内质网(er)保留序列；蛋白酶体定位序列或溶酶体分选信号。
22.例如，细胞内保留信号可以选自：
23.a)包含选自以下的氨基酸序列的高尔基体保留序列：sekdel(seq id no:1)、kdel(seq id no:2)、kkxx(seq id no:3)、kxkxx(seq id no:4)，包含序列kyksrrsfidekkmp(seq id no:5)的腺病毒e19蛋白尾部，包含序列mhrrrsrscr(seq id no:6)、kxd/e(seq id no:7)或yqrl(seq id no:8)的hla恒定链片段，其中x为任何氨基酸；和/或
24.b)选自以下的内质网保留结构域：核糖体结合糖蛋白i、核糖体结合糖蛋白ii、sec61或细胞色素b5；和/或
25.c)包含表1至5中所示的任何序列的细胞内保留信号。
26.所述靶标结合结构域或每个靶标结合结构域可以包含单结构域抗体(sdab)。
27.靶蛋白可以是例如cd3/t细胞受体(tcr)复合物的组分、细胞因子、人白细胞抗原(hla)i类分子、mhc ii类分子、下调免疫应答的受体、在t细胞上表达的配体、或调节免疫应答的胞质蛋白。
28.靶蛋白可以选自下组：
29.(i)cd3/tcr复合物的组分，其选自：cd3ε、tcrα、tcrαβ、tcrγ、tcrδ、cd3δ、cd3γ和cd3ζ；
30.(ii)hla i类分子，其选自：b2-微球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白和α3-微球蛋白；
31.(iii)mhc ii类分子，其选自：hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr；
32.(iv)下调免疫应答的受体，其选自：程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、t细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域3(tim3)、杀伤免疫球蛋白样受体(kir)、cd94、nkg2a、tigit、btla、fas、tbr2、lag3和蛋白酪氨酸磷酸酶；
33.(v)在t细胞上表达的配体，其选自：cd5、cd7和cd2。
34.(vi)调节免疫应答的胞质蛋白，其选自：csk、shp1、shp2、zap-70、slp76和akt。
35.该细胞还可以包含嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)。
36.在第二方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：
37.(i)第一核酸序列，其编码包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域的靶标结合多肽；和
38.(ii)第二核酸序列，其编码包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用
结构域以及细胞内保留信号的定位多肽。
39.核酸构建体可以具有以下通用结构:
40.a-coexpr-c
41.其中：
[0042]“a”是编码靶标结合多肽的核酸序列；
[0043]“coexpr”是能够使靶标结合多肽和定位多肽作为单独实体共表达的序列；和
[0044]“c”是编码定位多肽的核酸序列。
[0045]
核酸构建体可以包含:
[0046]
(i)多个核酸序列，其中每个核酸序列编码包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域的靶标结合多肽；和
[0047]
(ii)核酸序列，其编码包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号的定位多肽。
[0048]
核酸构建体可以具有以下通用结构:
[0049]
a-coexpr1-b-coexpr2-c
[0050]
其中：
[0051]“a”是编码第一靶标结合多肽的核酸序列；
[0052]“b”是编码第二靶标结合多肽的核酸序列；
[0053]“coexpr1”和“coexpr2”可以相同或不同，是能够使三种多肽作为单独实体共表达的序列；和
[0054]“c”是编码定位多肽的核酸序列。
[0055]
在核酸构建体编码三种靶标结合多肽的情况下，其可以具有以下通用结构：
[0056]
a-coexpr1-b-coexpr2-d-coexpr3-c
[0057]
其中：
[0058]“a”是编码第一靶标结合多肽的核酸序列；
[0059]“b”是编码第二靶标结合多肽的核酸序列；
[0060]“d”是编码第三靶标结合多肽的核酸序列；
[0061]“coexpr1”、“coexpr2”和“coexpr3”可以相同或不同，是能够使四种多肽作为单独实体共表达的序列；和
[0062]“c”是编码定位多肽的核酸序列。
[0063]
在所有核酸构建体中，可以定位编码定位肽的核酸序列以使其在c末端表达。以这种方式，细胞内保留信号不受在共表达序列(例如，编码自切割肽如2a肽的共表达序列)处切割后留下的任何残基的影响。
[0064]
在第三方面，本发明提供了核酸序列的试剂盒，其包含：
[0065]
(i)第一核酸序列，其编码包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域的靶标结合多肽；和
[0066]
(ii)第二核酸序列，其编码包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号的定位多肽。
[0067]
核酸序列试剂盒可以包含：
[0068]
(i)多个核酸序列，其中每个核酸序列编码包含靶标结合结构域和第一蛋白相互
作用结构域的靶标结合多肽；和
[0069]
(ii)核酸序列，其编码包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号的定位多肽。
[0070]
在第四方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核酸构建体的载体。
[0071]
在第五方面，本发明提供了载体试剂盒，其包含：
[0072]
(i)包含编码靶标结合多肽的核酸序列的第一载体，所述靶标结合多肽包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和
[0073]
(ii)包含编码定位多肽的核酸序列的第二载体，所述定位多肽包含结合第一蛋白结合结构域的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
[0074]
载体试剂盒可以包含:
[0075]
(i)多个载体，其中每个载体包含编码靶标结合多肽的核酸序列，所述靶标结合多肽包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和
[0076]
(ii)包含编码定位多肽的核酸序列的载体，所述定位多肽包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
[0077]
在第六方面，本发明提供了制备根据本发明第一方面的工程化免疫细胞的方法，其包括将根据本发明第二方面的核酸构建体、根据本发明第三方面的核酸序列试剂盒、根据本发明第四方面的载体、或根据本发明第五方面的载体试剂盒离体引入免疫细胞的步骤。
[0078]
在第七方面，本发明提供了包含多个根据本发明第一方面的工程化免疫细胞的药物组合物。
[0079]
在第八方面，根据本发明第七方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
[0080]
在第九方面，提供了治疗疾病的方法，其包括将根据本发明第七方面的药物组合物施用于有需要的受试者的步骤。
[0081]
在第十方面，提供了根据本发明第一方面的细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
[0082]
所述疾病可以是癌症。
[0083]
本发明的其他方面
[0084]
本发明的其他方面总结在以下编号的段落中：
[0085]
1.包含一种或多种核酸构建体的工程化免疫细胞，所述核酸构建体共同编码至少两个靶标结合结构域，其中所述一种或多种核酸构建体共同包含编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列，当在细胞中共表达时，所述细胞内保留信号控制每个靶标结合结构域的细胞定位。
[0086]
2.根据段落1的工程化免疫细胞，其中所述一种或多种核酸构建体编码至少一种工程化蛋白质，所述工程化蛋白质包含与所述细胞内保留信号偶联的至少两个靶标结合结构域。
[0087]
3.根据段落1或2的工程化免疫细胞，其中所述至少两个靶标结合结构域通过接头与细胞内保留信号偶联，所述接头优选为肽接头。
[0088]
4.根据段落1至3的工程化免疫细胞，其中所述至少两个靶标结合结构域通过至少一种异多聚体蛋白质与细胞内保留信号偶联。
[0089]
5.根据段落4的工程化免疫细胞，其中所述至少一种异多聚体蛋白质包含至少两种通过二硫键偶联的多肽。
[0090]
6.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述工程化蛋白质包含含有第一靶标结合结构域和细胞内保留信号的第一肽亚基和至少含有第二靶标结合结构域的第二肽亚基；其中所述第一和第二肽亚基偶联，优选通过肽接头或一个或多个二硫键偶联。
[0091]
7.根据段落1的工程化免疫细胞，其中所述至少两个靶标结合结构域的每个和细胞内保留信号被编码为单独的多肽；每个包含靶标结合结构域的多肽还包含第一蛋白相互作用结构域，并且包含细胞内保留信号的多肽还包含第二蛋白相互作用结构域，其中所述第一和第二蛋白相互作用结构域能够相互结合。
[0092]
8.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述工程化蛋白质包含至少三个靶标结合结构域。
[0093]
9.根据段落8的工程化免疫细胞，其中一条多肽链包含至少两个靶标结合结构域，并且一条多肽链包含至少一个靶标结合结构域和细胞内保留信号。
[0094]
10.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述细胞内保留信号将所述蛋白质引导至高尔基体、内体或溶酶体区室。
[0095]
11.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述细胞内保留信号选自下组：高尔基体保留序列；跨高尔基体网络(tgn)回收信号；内质网(er)保留序列；蛋白酶体定位序列或溶酶体分选信号。
[0096]
12.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中：
[0097]
a)包含选自以下的氨基酸序列的高尔基体保留序列：sekdel(seq id no:1)、kdel(seq id no:2)、kkxx(seq id no:3)、kxkxx(seq id no:4)，包含序列kyksrrsfidekkmp(seq id no:5)的腺病毒e19蛋白尾部，包含序列mhrrrsrscr(seq id no:6)、kxd/e(seq id no:7)或yqrl(seq id no:8)的hla恒定链片段，其中x是任何氨基酸；和/或
[0098]
b)选自以下的内质网保留结构域：核糖体结合糖蛋白i、核糖体结合糖蛋白ii、sec61或细胞色素b5；和/或
[0099]
c)包含表1至5中所示的任何序列的细胞内保留信号。
[0100]
13.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中至少一个靶标结合结构域包含抗体、抗体片段或抗原结合片段、单链可变片段(scfv)、结构域抗体(dab)、单结构域抗体(sdab)、vhh/纳米抗体(nanobody)、纳米抗体、affibody、纤连蛋白人工抗体支架、anticalin、affilin、darpin、vnar、ibody、affimer、fynomer、abdurin/纳米抗体(nanoantibody)、centyrin、alphabody或nanofitin。
[0101]
14.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中至少一个靶标结合结构域是结构域抗体(dab)或单链可变片段(scfv)。
[0102]
15.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中至少一种靶标选自：胞质蛋白、胞内蛋白、胞外蛋白和跨膜蛋白。
[0103]
16.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中至少两种靶标位于不同的细胞区室中。
[0104]
17.根据段落16的工程化免疫细胞，其中所述至少一种工程化蛋白质包含至少一个跨膜结构域。
[0105]
18.根据段落17的工程化免疫细胞，其中：
[0106]
至少一种靶标是胞外蛋白并且至少一种靶标是胞内蛋白；或者
[0107]
至少一种靶标是胞质蛋白并且至少一种靶标是内质网腔蛋白。
[0108]
19.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中至少一个靶标结合结构域与cd3/t细胞受体(tcr)复合物的组分、细胞因子、人白细胞抗原(hla)i类分子、下调免疫应答的受体、在t细胞上表达的配体或调节免疫应答的胞质蛋白结合。
[0109]
20.根据段落19的工程化免疫细胞，其中所述cd3/tcr复合物的组分是cd3ε、tcrα、tcrαβ、tcrγ、tcrδ、cd3δ、cd3γ或cd3ζ。
[0110]
21.根据段落19的工程化免疫细胞，其中所述hla i类分子是b2-微球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白或α3-微球蛋白。
[0111]
22.根据段落19的工程化免疫细胞，其中所述下调免疫应答的受体选自程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、t细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域-3(tim3)、杀伤免疫球蛋白样受体(kir)、cd94、nkg2a、tigit、btla、fas、tbr2、lag3或蛋白酪氨酸磷酸酶。
[0112]
23.根据段落19的工程化免疫细胞，其中所述调节免疫应答的胞质蛋白选自csk、shp1、shp2、zap-70、slp76和akt。
[0113]
24.根据段落19的工程化免疫细胞，其中所述在t细胞上表达的配体是cd5、cd7或cd2。
[0114]
25.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述细胞是t细胞、α-βt细胞、nk细胞、γ-δt细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
[0115]
26.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述细胞还包含嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)。
[0116]
27.根据任一前述段落的工程化免疫细胞，其中所述细胞还包含至少一种标志物，优选地所述标志物是包含至少一个mab特异性表位的细胞外结合结构域。
[0117]
28.包含以下结构的核酸构建体：
[0118]
a-x-b-c
[0119]
其中：
[0120]
a和b是编码如段落1至27中任一项所限定的靶标结合结构域的核酸序列；x是如段落1至27中任一项所限定的接头；c是如段落1至27中任一项所限定的细胞内保留信号。
[0121]
29.根据段落28的核酸构建体，其还包含一种或多种编码如段落1至27中任一项所限定的其他靶标结合结构域的其他核酸序列。
[0122]
30.根据段落28的核酸构建体，其还包含编码car或转基因tcr的核酸序列。
[0123]
31.根据段落28-30中任一项的核酸构建体，其还包含编码至少一种标志物的核酸序列，优选其中所述标志物是包含至少一个mab特异性表位的细胞外结合结构域。
[0124]
32.根据段落30或31的核酸构建体，其中编码所述car、转基因tcr或标志物的核酸序列与编码自切割肽的核酸序列相邻。
[0125]
33.根据段落32的核酸构建体，其中所述自切割肽是来自口疮病毒或心脏病毒的2a自切割肽或2a样肽。
[0126]
34.根据段落32或33的核酸构建体，其中编码2a自切割肽的核酸序列在3'端与编
码所述car、转基因tcr或标志物的核酸序列相邻。
[0127]
35.包含以下的核酸序列试剂盒：
[0128]
(i)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含至少一个与细胞内保留信号连接的靶标结合结构域；和
[0129]
(ii)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质能够与由(i)编码的蛋白质偶联并且包含至少一个靶标结合结构域。
[0130]
36.根据段落35的核酸序列试剂盒，其中如(i)中限定的核酸序列、如(ii)中限定的核酸序列或其他的核酸编码以下中的一种或多种：car或转基因tcr和/或标志物，优选地，所述标志物是包含至少一个mab特异性表位的细胞外结合结构域。
[0131]
37.包含根据段落28至34中任一项的核酸构建体的载体。
[0132]
38.制备根据段落1至27中任一项的工程化免疫细胞的方法，其包括将根据段落28至34中任一项的核酸构建体、如段落35或36所限定的核酸序列的组、或根据段落37的载体引入免疫细胞的步骤。
[0133]
39.用于控制至少两种靶蛋白的细胞定位的方法，其包括以下步骤：将根据段落28至34中任一项的核酸构建体、如段落35或36所限定的核酸序列的组、或根据段落37的载体引入细胞。
[0134]
40.根据段落39的方法，其中一种或多种靶蛋白在细胞表面的表达降低或消除和/或其中所述靶蛋白保留在细胞内区室中。
[0135]
41.药物组合物，其包含根据段落1至27中任一项的工程化免疫细胞、根据段落28至34中任一项的核酸构建体、如段落35或36中所限定的核酸序列的组、或根据段落37的载体。
[0136]
42.药物组合物，其包含根据段落1至27中任一项的细胞或通过根据段落38至40中任一项的方法可获得的细胞。
[0137]
43.根据段落41或42的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
[0138]
44.治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据段落41或42的药物组合物施用于有需要的受试者的步骤。
[0139]
45.根据段落44的方法，其包括以下步骤：
[0140]
(i)分离含有样品的细胞；
[0141]
(ii)引入根据段落28至34中任一项的核酸构建体、如段落35或36中所限定的核酸序列的组或根据段落37的载体；和
[0142]
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
[0143]
46.根据段落45的方法，其中所述核酸构建体或载体通过转导或转染引入。
[0144]
47.根据段落44至46的方法，其中所述细胞是自体的。
[0145]
48.根据段落44至46的方法，其中所述细胞是同种异体的。
[0146]
49.根据段落41至43的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
[0147]
本发明人因此开发了能够减少或敲低一种或多种靶蛋白的表达的一系列工程化蛋白质。本发明的工程化蛋白质基于能够通过将至少两个靶标结合结构域与单个细胞内保留信号偶联而将多个靶蛋白引导至期望的细胞内区室的结构。
[0148]
如本文所用，术语“共同编码”用于表示所述实体作为一个整体时由一个或多个核酸构建体提供的核酸序列编码。换言之，至少两个靶标结合结构域和编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列在一个或多个核酸构建体中存在的核酸序列之间编码。例如，至少两个靶标结合结构域和编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列可以由单个核酸构建体提供。或者，可以由第一核酸构建体提供第一靶标结合结构域和编码细胞内保留信号的核苷酸序列，并且可以由第二核酸构建体提供第二靶标结合结构域。显然，可以设想落入本发明的多种变体和排列，前提是至少两个靶标结合结构域和编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列在一个或多个核酸构建体之间编码。
[0149]
术语“编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列”是指一个或多个核酸构建体仅编码一种控制每个靶标结合结构域的细胞定位的细胞内保留信号。因此，本发明的工程化蛋白质基于能够通过将由一个或多个核酸构建体提供的至少两个靶标结合结构域与单个细胞内保留信号偶联而将多个靶蛋白引导至期望的细胞内区室的结构。
[0150]“当在细胞中共表达时”在本文中是指提供至少两个靶标结合结构域的氨基酸序列和提供细胞内保留信号的氨基酸序列在本发明的细胞中同时表达。相关氨基酸序列可以作为如本文所限定的一种或多种多肽的部分存在。
[0151]
术语“控制每个靶标结合结构域的细胞定位”是指细胞内保留信号将包含其的蛋白质引导或维持至细胞内区室，所述细胞内区室不同于在不存在该细胞内保留信号时该蛋白将被引导至的细胞内区室。适当地，细胞内保留信号将包含其的蛋白质引导或维持至细胞表面膜以外的细胞内区室或细胞外部。
[0152]
无需担心理论束缚，本发明的工程化蛋白质在多种潜在环境中具有实用性。例如，其可以通过靶向如mhc i类、β2微球蛋白、mhc ii类和/或tcr的蛋白质进行敲低以促进类似car t细胞的产生，从而减少或防止移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。其还可用于减少对car t细胞的抑制，并通过敲低例如以下的抑制蛋白来增加敏感性：表面蛋白pd1、tigit、btla、tim3、fas、ctla、tbr2和lag3以及胞质蛋白shp1、shp2和csk。此外，当靶向也在car t细胞上表达的配体组如cd5、cd7和cd2时，本发明的工程化蛋白质可以减少自体攻击。
附图说明
[0153]
图1：a)表面表达的蛋白通过内质网和高尔基体到达细胞膜的说明性运输途径。b)cd3δ通过包含kdel基序的dab在细胞内区室中的说明性保留。
[0154]
图2：包含与单个kdel基序连接的多个靶标结合结构域的单条多肽链的说明性实施方案。
[0155]
图3：a)在单个构建体上编码的由连接到kdel基序的多个靶标结合结构域组成的两条多肽链的说明性实施方案。b)在两个独立构建体上编码的由连接到kdel基序的多个靶标结合结构域组成的两条多肽链的说明性实施方案。c)由连接到kdel基序的多个靶标结合结构域组成的三条多肽链的说明性实施方案。
[0156]
图4：多条多肽链的说明性实施方案，每条多肽链包含至少一个靶标结合结构域和标签，其后是由后接kdel基序的标签结合蛋白组成的最终多肽链。
[0157]
图5：多条多肽链的说明性实施方案，每条多肽链包含至少一个靶标结合结构域和标签，其后是包含至少两个跨膜结构域、内腔驻留标签结合蛋白、胞质驻留标签结合蛋白和
驻留在内腔中的c末端kdel的最终多肽链。
[0158]
图6：可以通过双多肽链构建体介导kdel驱动的tcr敲低a)pbm c被转导以表达编码直接连接到kdel序列的抗tcr_vhh的单个多肽；或两条多肽链：第一条编码与alfa_肽连接的抗tcr_vhh，并且第二条编码与kdel序列直接连接的抗alfa_肽_vhh。这两种多肽通过自切割2a肽分离。作为阴性对照，将atcr_vhh替换为不相关的vhh结合剂。所有构建体都包含用于转导的ires-ebfp标志物。b)转导4天后，对pbmc进行表面cd3染色。结果来自四个独立供体。
[0159]
发明详述
[0160]
本发明涉及包含一种或多种核酸构建体的工程化免疫细胞，所述核酸构建体共同编码至少两个靶标结合结构域，其中所述一种或多种核酸构建体共同包含编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列，当在细胞中共表达时，所述细胞内保留信号控制每个靶标结合结构域的细胞定位。本发明扩展至包含至少一种工程化蛋白质的工程化免疫细胞，该工程化蛋白质包含至少两个与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域。所述工程化蛋白质能够控制至少两种蛋白质的细胞定位。本发明还涉及编码至少一种工程化蛋白质的核酸构建体、核酸序列试剂盒和载体，该工程化蛋白质包含至少两个与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域。本发明还扩展至包含根据本发明的细胞、核酸构建体或载体的药物组合物以及所述药物组合物在治疗或预防疾病中的用途。
[0161]
工程化免疫细胞
[0162]
本发明涉及包含一种或多种核酸构建体的工程化免疫细胞，所述核酸构建体共同编码至少两个靶标结合结构域，其中所述一种或多种核酸构建体共同包含编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列，当在细胞中共表达时，所述细胞内保留信号控制每个靶标结合结构域的细胞定位。
[0163]
如本文所用，“工程化免疫细胞”是指已被修饰以包含或表达不由细胞天然编码的核酸序列的免疫细胞。用于改造细胞的方法在本领域中是已知的并且包括但不限于细胞的遗传修饰，例如通过如逆转录病毒或慢病毒转导的转导，通过包括脂转染、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔的转染(例如瞬时转染—基于dna或rna)。可以使用任何合适的方法将核酸序列引入细胞中。
[0164]
适当地，工程化细胞是例如通过转导或转染已经被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是通过逆转录病毒转导已经被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是通过慢病毒转导已经被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。
[0165]
在一方面，工程化免疫细胞是工程化溶细胞性免疫细胞。
[0166]
如本文所用，“溶细胞性免疫细胞”是直接杀伤其他细胞的细胞。溶细胞性细胞可以杀伤癌细胞、病毒感染的细胞或其他受损细胞。溶细胞性免疫细胞包括t细胞和自然杀伤(nk)细胞。
[0167]
溶细胞性免疫细胞可以是t细胞或t淋巴细胞，其为一类在细胞介导的免疫中起到核心作用的淋巴细胞。t细胞可以通过其细胞表面上tcr的存在与例如b细胞和nk细胞的其他淋巴细胞区分开来。
[0168]
溶细胞性t细胞(tc细胞或ctl)会破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有关。ctl在其表面表达cd8。ctl可以称为cd8 t细胞。这些细胞通过结合与存在于所有
有核细胞表面的mhc i类结合的抗原来识别其靶标。通过调节性t细胞分泌的il-10、腺苷和其他分子，cd8 细胞可被灭活至免疫无能状态，从而预防例如实验性自身免疫性脑脊髓炎的自身免疫性疾病。
[0169]
适当地，本发明的细胞可以是t细胞。适当地，t细胞可以是α-βt细胞。适当地，t细胞可以是γ-δt细胞。
[0170]
自然杀伤细胞(或nk细胞)是一类溶细胞性细胞，其构成先天免疫系统的一部分。nk细胞以mhc非依赖方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
[0171]
nk细胞(属于先天淋巴细胞群体)被界定为大颗粒淋巴细胞(lgl)，构成从产生b和t淋巴细胞的共同淋巴祖细胞分化而来的第三种细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后进入循环。
[0172]
适当地，本发明的细胞可以是野生型杀伤(nk)细胞。适当地，本发明的细胞可以是细胞因子诱导的杀伤细胞。
[0173]
细胞可来自患者自身的外周血(第一方)，或在造血干细胞移植的情况下来自供体外周血(第二方)，或来自非关联供体的外周血(第三方)。例如，t细胞或nk细胞可以在用编码本发明多肽的核酸分子转导之前，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理来激活和/或扩增。
[0174]
或者，细胞可以来源于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化的t细胞。或者，可以使用保持其裂解功能的永生化t细胞系。
[0175]
细胞可以是造血干细胞(hsc)。可以从适当匹配的供体的骨髓，通过在通过施用药理学剂量的细胞因子如g-csf[外周血干细胞(pbsc)]进行动员后对外周血进行白细胞分离术获得hsc；或从分娩后从胎盘采集的脐带血(ucb)获得hsc。骨髓、pbsc或ucb可以不经加工而移植，或者hsc可以通过用针对cd34表面抗原的单克隆抗体的免疫选择进行富集。
[0176]
工程化蛋白质
[0177]
如本文所用，“工程化蛋白质”是指免疫细胞已被工程化以表达的蛋白质。工程化蛋白质可以包含至少两个与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域。
[0178]
工程化蛋白质可包含一条多肽链或多于一条多肽链，例如至少两条、或至少三条、或至少四条、或至少五条或更多条多肽链。
[0179]
工程化蛋白质可以包含一条、两条、三条、四条、五条或更多条多肽链。
[0180]
适当地，至少两个靶标结合结构域可以物理偶联至细胞内保留信号。
[0181]
至少两个靶标结合结构域可以连接或互连至细胞内保留信号。在一方面，至少两个靶标结合结构域可以连接到细胞内保留信号或与细胞内保留信号连接。换言之，工程化蛋白质可以包含含有至少两个靶标结合结构域和细胞内保留信号的一条多肽链。
[0182]
至少两个靶标结合结构域可以直接或间接连接到细胞内保留信号。第一靶标结合结构域可以直接连接到细胞内保留信号，第二靶标结合结构域可以间接连接到细胞内保留信号，例如第二靶标结合结构域可以通过第一靶标结合结构域或通过接头连接到细胞内保留信号。在一方面，至少两个靶标结合结构域中的至少一个直接连接到细胞内保留信号。适当地，至少两个靶标结合结构域可以串联连接到细胞内保留信号，其中靶标结合结构域之一直接连接到细胞内保留信号。
[0183]
参见例如图2，其中至少两个靶标结合结构域(dab-1、dab-2和dab-3)通过接头互相连接，并且一个靶标结合结构域(dab-3)直接连接到细胞内保留信号。在图2中，三个靶标
结合结构域与细胞内保留信号偶联，其中一个靶标结合结构域(dab-3)与细胞内保留信号直接相连，两个靶标结合结构域(dab-1和ab-2)通过接头和靶标结合结构域间接连接到所述细胞内保留信号。
[0184]
在另一方面，至少两个靶标结合结构域可以直接连接到细胞内保留信号。
[0185]
靶标结合结构域可以直接连接到细胞内保留信号。例如，工程化多肽可以由编码至少两个靶标结合结构域的核酸序列编码，其中至少一个靶标结合结构域直接在框内(例如，没有接头)与编码细胞内保留信号的核酸序列相邻。
[0186]
靶标结合结构域可以间接连接到细胞内保留信号。例如，编码至少两个靶标结合结构域的核酸序列可以通过如本文所述的肽接头的接头与编码细胞内保留信号的核酸序列连接。
[0187]
在一方面，至少两个靶标结合结构域可以通过例如肽接头的接头彼此连接。适当地，至少两个靶标结合结构域可以通过接头与细胞内保留信号偶联，所述接头优选为肽接头。
[0188]
本领域中已知许多合适的接头，其适用于将靶标结合结构域连接到细胞内保留信号和/或将靶标结合结构域彼此连接。
[0189]
可以根据本发明使用例如非天然存在的肽，如包含(或组成为)不同长度的亲水残基的多肽，或(ggggs)n(seq id no:9)或多肽或其变体，其中n是例如约3至约12(包含性的)的整数。在一些实施方案中，接头包含ggggsggggs(seq id no:10)或其变体。在特定实施方案中，接头包含sgggsgggsgggs(seq id no:11)或其变体。
[0190]
适当地，长度为约5至约100个氨基酸(包含性的)的肽接头可用于本发明。长度为约20至约40个氨基酸(包含性的)的肽接头可用于本发明。长度为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸或至少40个氨基酸的肽接头也可用于本发明。
[0191]
如本领域技术人员将理解的，此类接头序列以及此类接头序列的变体是本领域已知的。本领域技术人员容易获得设计并入接头序列的构建体的方法以及评估功能性的方法。
[0192]
在一方面，至少两个靶标结合结构域在工程化蛋白质的同一多肽链中与同一细胞内保留信号偶联。适当地，至少两个可以是至少三个、或至少四个或至少五个靶标结合结构域。
[0193]
在一方面，工程化蛋白质由包含至少两个与同一细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域的一条多肽链组成。例如，图2显示了由一条多肽链组成的工程化蛋白质，该多肽链包含三个与同一细胞内保留信号(例如sekdel)偶联的靶标结合结构域(例如dab-1、dab-2和dab-3)。
[0194]
适当地，工程化蛋白质可以包含含有第一靶标结合结构域和细胞内保留信号的第一肽亚基和含有至少第二靶标结合结构域的第二肽亚基；其中第一和第二肽亚基优选通过肽接头或一个或多个二硫键偶联。
[0195]
在一方面，所述至少两个靶标结合结构域通过至少一种异多聚体蛋白质与细胞内保留信号偶联。异多聚体蛋白质可以包含至少两个、至少三个、至少四个异多聚体组分。适当地，异多聚体蛋白质可以是异二聚体。适当地，异多聚体蛋白质可以通过异多聚体组分之
间的二硫键来稳定。
[0196]
例如，图3c显示了包含两个通过至少一种异多聚体蛋白质(例如cd79a和cd79b)与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域(dab-3和dab-4)的工程化蛋白质。图3c还显示了包含两个通过二硫键与细胞内保留信号(例如kdel)偶联的靶标结合结构域(dab-1和dab-2)的工程化蛋白质。
[0197]
异多聚体蛋白质可以是包含至少第一和第二异多聚体组分的稳定的异多聚体复合物。适当地，异多聚体蛋白质可以是异二聚体对。
[0198]
异多聚体蛋白质可以包含蛋白质-蛋白质相互作用对，例如第一蛋白相互作用结构域和第二蛋白相互作用结构域。第一和第二蛋白相互作用对能够结合形成多聚体(例如二聚体)复合物。适当地，第一和第二蛋白相互作用对可以基于表位标签系统。例如，异二聚体对可以包含诸如表位的第一蛋白相互作用结构域和诸如表位标签的第二蛋白相互作用结构域。
[0199]
以下是结合形成稳定的异多聚体复合物的第一和第二异多聚体组分的示例。
[0200]
适当地，至少第一和第二蛋白相互作用对可以基于天然存在的多聚体蛋白质或蛋白质复合物。
[0201]
cd79a/cd79b
[0202]
cd79(分化簇79)是与b细胞受体形成复合物并在识别抗原后产生信号的蛋白质。
[0203]
cd79由称为cd79a和cd79b(以前称为ig-alpha和ig-beta)的两条不同的链组成；它们通常在由二硫键稳定的b细胞表面形成异二聚体。cd79a(uniprot:p11912)和cd79b(uniprot:p40259)都是免疫球蛋白超家族的成员。
[0204]
两条cd79链在其细胞内尾部都包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其用于以类似于在t细胞受体激活期间t细胞上观察到的cd3产生的信号转导的方式在b细胞中传播信号。
[0205]
异多聚体蛋白质可以包含来自cd79a或cd79b的胞外结构域。下面给出了这些结构域的示例性序列，异多聚体蛋白质可以包含以下序列或其变体：
[0206]
cd79a:
[0207]
lwmhkvpaslmvslgedahfqcphnssnnanvtwwrvlhgnytwppeflgpgedpngtliiqnvnkshggiyvcrvqegnesyqqscgtylrvrqppprpfldmgegtknr(seq id no.12)
[0208]
cd79b:
[0209]
arsedryrnpkgsacsriwqsprfiarkrgftvkmhcymnsasgnvswlwkqemdenpqqlklekgrmeesqneslatltiqgirfedngiyfcqqkcnntsevyqgcgtelrvmgfstlaqlkqrntlkd(seq id no.13)
[0210]
图3c显示了说明性的异多聚体排列，其中靶标结合结构域dab-3和dab-4通过包含cd79a胞外结构域和cd79b胞外结构域的异多聚体与细胞内保留序列(例如kdel)偶联。
[0211]
来自igg1的ch1/igg1的kappa恒定结构域
[0212]
igg抗体是具有复杂结构域间相互作用的多结构域蛋白质。人igg重链与轻链结合形成能够结合抗原的成熟抗体。轻链可以是kappa或gamma同种型。
[0213]
重链恒定结构域和轻链恒定结构域的结合形成稳定的异二聚体。异多聚体蛋白质可以包含重链恒定区或轻链恒定区。下面给出了来自igg1的kappa链恒定区和ch1区的氨基酸序列，但是本领域技术人员将理解来自其他抗体的许多其他合适的序列是已知的。
[0214]
kappa链：
[0215]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no.14)
[0216]
ch1:
[0217]
stkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv(seq id no.15)
[0218]
说明性的异多聚体蛋白质可以包含如seq id no:12-15中所示的序列或其与seq id no:12-15中的任一种具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％)同一性的变体，前提是该变体蛋白质能够形成异多聚体复合物。
[0219]
图3b显示了说明性的异多聚体排列，其中靶标结合结构域dab-1和dab-2通过包含含有kappa的结构域和ch1结构域的异多聚体与细胞内保留序列(例如kdel)偶联。
[0220]
下表提供了包括以上未描述的其他多聚体对的第一和第二异多聚体组分的非限制性列表。下面的第一和第二异多聚体组分对可以自发结合以形成用于本发明的异多聚体：
[0221][0222][0223]
异多聚体蛋白质可以由上表中描述的任何两个自发结合对形成。例如，异多聚体蛋白质可以包含如图3c所示的cd79a/cd79b对和含有kappa的结构域/ch1结构域。
[0224]
在一方面，至少一种工程化蛋白质包含至少一个跨膜结构域。适当地，工程化蛋白质可以包含至少两个跨膜结构域。至少两个靶标结合结构域可以位于跨膜结构域跨越的膜的不同侧。适当地，包含跨膜结构域的工程化蛋白质可以包含结合位于不同细胞区室中的靶标的靶标结合结构域。例如，图5显示了包含跨膜结构域的工程化蛋白质，其中至少两个靶标结合结构域位于不同的细胞区室中。适当地，至少一个靶标结合结构域可以结合作为胞质蛋白的靶标。适当地，至少一个靶标结合结构域可以结合作为胞外蛋白的靶标。适当地，至少一个靶标结合结构域可以结合作为跨膜蛋白的靶标。适当地，至少一个靶标结合结构域可以结合作为胞内蛋白的靶标。
[0225]
跨膜结构域可以衍生自任何跨膜蛋白。例如，跨膜结构域可以衍生自人tyrp-1或人cd20。用于本发明的示例性跨膜结构域包含以下序列及其与seq id no:16-17具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少99％)同一性的变体，前体是所述变体起到跨膜结构域的功能：
[0226]
tyrp-tm:iiaiavvgalllvalifgtasyli(seq id no:16)和
[0227]
dcd20_tm:imnglfhialggllmipagiya(seq id no:17)。
[0228]
在一些方面，工程化蛋白质另外包含间隔结构域。间隔结构域可能是将靶标结合结构域与膜分离并使其呈现合适的定向所必需的。如果工程化蛋白质包含一个或多个跨膜结构域，则间隔结构域可能是必需的。图5显示了间隔结构域如何用于定向靶标结合结构域。
[0229]
使用的常见间隔结构域是igg1的fc。例如cd8α的茎以及甚至仅单独的igg1铰链的更多小型间隔区根据所述抗原也可能是足够的。
[0230]
示例性的间隔结构域包括stk和cd20的结构域。在本发明中可用作间隔结构域的序列包括以下序列和与其具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少99％)同一性的变体：
[0231]
cd8stk:
[0232]
ptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdi(seq id no:18)
[0233]
dcd20_n-末端:
[0234]
ttprnsvngtfpaepmkgpiamqsgpkplfrrmsslvgptqsffmresktlgavq(seq id no:19)
[0235]
dcd20_短_环:picvtv(seq id no:20)
[0236]
在一方面，至少一种靶标是胞外蛋白并且至少一种靶标是胞内蛋白；或者
[0237]
至少一种靶标是胞质蛋白并且至少一种靶标是内质网腔蛋白。
[0238]
适当地，至少第一和第二蛋白相互作用对可以基于例如表位标签系统的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。
[0239]
在一方面，至少两个靶标结合结构域中的每个和细胞内保留信号被编码为单独的多肽；包含靶标结合结构域的每种多肽进一步包含第一蛋白相互作用结构域，并且包含细胞内保留信号的多肽进一步包含第二蛋白相互作用结构域，其中第一和第二蛋白相互作用结构域能够互相结合。
[0240]
适当地，至少一个靶标结合结构域连接到第一蛋白相互作用结构域并且细胞内保留信号连接到第二蛋白相互作用结构域，使得当在细胞中共表达时，所述第一和第二蛋白相互作用结构域相互结合并且细胞内保留信号控制靶标结合结构域及其靶标的细胞定位。
[0241]
例如，图4显示了说明性实施方案，其中靶标结合结构域(例如dab-1)连接到第一蛋白相互作用结构域(例如标签)并且细胞内保留信号(例如kdel)连接到第二蛋白相互作用结构域(抗标签)。当在细胞中共表达时，第一和第二蛋白相互作用结构域相互结合(标签-抗标签相互作用)并控制靶标结合结构域(例如dab-1)及其靶标(ab-1)的细胞定位。
[0242]
特别地，图4显示了说明性实施方案，其中至少两个靶标结合结构域(例如dab-1、dab-2、dab-3)和细胞内保留信号(例如sekdel)被编码为单独的多肽。包含靶标结合结构域(例如dab-1、dab-2、dab-3)的每种多肽还包含第一蛋白相互作用结构域(标签)，并且包含细胞内保留信号(例如sekdel)的多肽还包含第二蛋白相互作用结构域(例如抗标签)，其中第一和第二蛋白相互作用结构域能够彼此结合。
[0243]
示例性异二聚体对(也称为第一和第二蛋白相互作用结构域)是alfa肽和纳米抗体nbalfa。
[0244]
可用于本发明的示例性序列包括以下afla标签和抗alfa标签或与其具有至少80％序列同一性的变体：
[0245]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0246]
抗-alfa_标签(nbalfa):
[0247]
evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss(seq id no:22)
[0248]
在一个实施方案中，第一和第二蛋白相互作用结构域可以是表位标签系统。如将被理解的，专门的表位标签被广泛用于检测、操作和纯化蛋白质。
[0249]
可用于本发明的示例性表位标签系统包括alfa-标签、ha-标签(ypydvpdya-seq id no:23)、多聚组氨酸标签(his
3-10
)、flag-标签(dykddddk-seq id no:24)、spot-标签(pdrvravshwss-seq id no:25)、epea/c-标签(epea-seq id no:26)和myc-标签(eqkliseedl-seq id no:27)系统。
[0250]
alfa-标签形成小而稳定的α-螺旋，其功能与其在靶蛋白上的位置无关。纳米抗体nbalfa以低皮摩尔亲和力结合alfa标记的蛋白质。
[0251]
在一个实施方案中，第一和第二蛋白相互作用结构域可以是alfa-标签系统。在一个实施方案中，第一蛋白相互作用结构域可以是alfa肽并且第二蛋白相互作用结构域可以是抗alfa dab。
[0252]
可用于本发明的示例性序列包括以下afla标签和抗alfa标签或与其具有至少80％序列同一性的变体：
[0253]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0254]
抗-alfa_标签(nbalfa):
[0255]
evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss(seq id no:22)
[0256]
细胞内保留信号
[0257]
蛋白质靶向或蛋白质分选是蛋白质被运输到细胞内或细胞外的适当目的地的生物学机制。蛋白质可以通过分泌靶向细胞器的内部空间、不同的细胞内膜、质膜或细胞外部。该递送过程基于蛋白质本身包含的序列信息进行。
[0258]
在真核细胞的粗面内质网(er)中合成的蛋白质使用胞吐途径运输到其最终目的地。缺乏特殊分选信号的蛋白质通过高尔基体和跨高尔基体网络(tgn)以载体方式从er运输到质膜。其他蛋白质具有靶向信号以进入胞吐途径的特定细胞器，如内体和溶酶体。
[0259]
溶酶体是酸性细胞器，其中内源性和内化的大分子被腔内水解酶降解。内源性大分子通过在tgn中分选到达溶酶体，其从tgn中被转运到内体然后到达溶酶体。
[0260]
本发明可以利用细胞用于分选蛋白质到正确的细胞内位置的靶向信号。信号大致可分为以下类型：
[0261]
i)内吞作用信号
[0262]
ii)高尔基体保留信号
[0263]
iii)tgn回收信号
[0264]
iv)er保留信号
[0265]
v)溶酶体分选信号
[0266]
细胞内保留信号可以在从er易位期间引导跨膜蛋白远离分泌途径。
[0267]
细胞内保留信号可以将跨膜蛋白引导至细胞内区室或复合物。细胞内保留信号可
以将跨膜蛋白引导至膜结合的细胞内区室。
[0268]
例如，细胞内保留信号可以将蛋白质引导至溶酶体、内体或高尔基体区室(跨高尔基体网络，“tgn”)。
[0269]
在正常细胞内，由生物发生或内吞途径产生的蛋白质在一系列分选决定后被分选到适当的细胞内区室中。在质膜上，蛋白质可以保留在细胞表面或内化到内体中。在tgn上，选择为去往质膜或者转移到内体。在内体中，蛋白质可以再循环到质膜或去往溶酶体。这些决定取决于蛋白质本身的分选信号。
[0270]
溶酶体是含有分解废物和细胞碎片的酸性水解酶的细胞器。溶酶体周围的膜允许消化酶在其所需的ph下工作。溶酶体与自噬泡(吞噬体)融合，并将溶酶体中的酶分配到自噬泡中，从而消化自噬泡中的内容物。
[0271]
内体是真核细胞内的膜结合区室。内体是从质膜到溶酶体的内吞膜转运途径的区室，并在待分选物质到达降解溶酶体之前为其提供环境。根据内吞物质到达内体所需的时间，内体可分为早期内体、晚期内体或再循环内体。本发明中使用的细胞内保留信号可以将蛋白质引导至晚期内体区室。
[0272]
高尔基体是细胞内膜系统的一部分，高尔基体在蛋白质被送往目的地之前在细胞内对其进行包装；高尔基体在分泌蛋白质的加工过程中尤为重要。
[0273]
调研已知蛋白质中存在的分选信号以及改变分选信号在分子内的序列和/或位置的影响的研究产生了大量的知识(bonifacino和traub(2003)ann.rev.biochem.72:395-447；braulke和bonifacino(2009)biochimica and biophysica acta 1793:605-614；griffith(2001)current biology 11:r226-r228；mellman和nelson(2008)nat rev mol cell biol.9:833-845；dell'angelica和payne(2001)cell 106:395-398；schafer等人(1995)embo j.14:2424-2435；trejo(2005)mol.pharmacol.67:1388-1390)。大量研究表明，可以将一个或多个分选信号插入感兴趣的蛋白质中，以改变感兴趣的蛋白质的细胞内定位(pelham(2000)meth.enzymol.327:279-283)。
[0274]
胞吞信号的实例包括来自转铁蛋白受体和去唾液酸糖蛋白受体的信号。
[0275]
导致tgn内体再循环的信号的实例包括那些形成蛋白质的信号，例如ci-和cd-mpr、sortilin、ldl受体相关蛋白lrp3和lrp10和β-分泌酶、gga1-3、limp-ii、ncp1、粘液素(mucolipn)-1、唾液酸转运蛋白(sialin)、glut8和恒定链。
[0276]
tgn保留信号的实例包括来自定位于tgn的下列蛋白质的信号：激素原加工酶弗林蛋白酶、pc7、cpd和pam；疱疹病毒3的糖蛋白e和tgn38。
[0277]
er保留信号的实例包括c-末端信号，例如kdel、kkxx或kxkxx和钾通道的rxr(r)基序。已知的er蛋白质包括腺病毒e19蛋白和ergic53。
[0278]
溶酶体分选信号的实例包括在溶酶体膜蛋白中发现的信号，例如lamp-1和lamp-2、cd63、cd68、endolyn、dc-lamp、cystinosin、糖磷酸交换剂2和酸性磷酸酶。
[0279]
本发明的工程化免疫细胞包含至少一种工程化蛋白质，该蛋白质包含至少两个与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域。
[0280]
细胞内保留信号在本领域中是众所周知的(参见，例如，bonifacino&traub；annu.rev.biochem.；2003；72；395-447)。
[0281]
本发明还提供了核酸构建体，其包含以下结构：
[0282]
a-x-b-c
[0283]
其中：
[0284]
a和b是编码如本文限定的靶标结合结构域的核酸序列；x是如本文限定的接头；c是如本文限定的细胞内保留信号。
[0285]
适当地，“细胞内保留信号”是指将包含其的蛋白质引导或维持至细胞内区室的氨基酸序列，该细胞内区室不同于在不存在细胞内保留信号的情况下其将被引导至的细胞内区室。适当地，细胞内保留信号将包含其的蛋白质引导或维持至细胞表面膜以外的细胞内区室或细胞外部。
[0286]
细胞内保留信号可以是驻留在给定细胞内区室中的任何蛋白质或蛋白质结构域。这意味着所述蛋白质或结构域大部分位于给定区室。至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的所述蛋白质或结构域位于细胞中的所述区室中。细胞内保留信号防止根据本发明的工程化蛋白质从细胞分泌或转移到质膜。
[0287]
如本文所用，“区室”或“亚细胞区室”是指给定的细胞亚结构域。区室可以是细胞器(例如内质网、高尔基体、内体、溶酶体)或细胞器的元件(例如内体的多泡体、高尔基体的顺面潴泡(cis-cisternae)、中间潴泡(medial-cisternae)、反面潴泡(trans-cisternae)等)或质膜或质膜的亚结构域(例如顶端、基底外侧、轴突结构域)或例如黏着斑或紧密连接的微结构域。
[0288]“细胞内区室”是指细胞内的区室。
[0289]
根据本发明，至少两种靶蛋白可以通过与自身偶联至细胞内保留信号的同源靶标结合结构域相互作用而保留在细胞内或特定细胞内区室中。所述至少两种靶蛋白可以保留在不同的细胞内区室中。
[0290]
在一方面，细胞内保留信号将蛋白质引导至高尔基体(跨高尔基体网络，“tgn”)、内体或溶酶体区室。
[0291]
在一方面，细胞内保留信号选自下组：高尔基体保留序列；跨高尔基体网络(tgn)回收信号；内质网(er)保留序列；蛋白酶体定位序列或溶酶体分选信号。
[0292]
细胞内保留信号可以是驻留在高尔基体中的蛋白质或结构域。适当地，高尔基体保留结构域可以选自：巨蛋白(giantin)(golgb1，genbank登录号nm 004487.3)、tgn38/46、menkes受体和高尔基体酶如manii(α-1,3-1,6甘露糖苷酶，genbank登录号nm_008549)、唾液酸转移酶(β-半乳糖酰胺α2，6-唾液酸转移酶1,nm_003032)、galt(β-1,4-半乳糖基转移酶1,nm_001497)腺病毒e19、hla恒定链或其包含定位结构域的片段。
[0293]
在一方面，高尔基体保留序列包含选自以下的氨基酸序列：sekdel(seq id no:1)、kdel(seq id no:2)、kkxx(seq id no:3)、kxkxx(seq id no:4)、包含序列kyksrrsfidekkmp(seq id no:5)的腺病毒e19蛋白尾部、包含序列mhrrrsrscr(seq id no:6)、kxd/e(seq id no:7)或yqrl(seq id no:8)的hla恒定链片段或其保留了起到高尔基体保留序列功能的能力的具有至少80％序列同一性的变体，其中x是任何氨基酸。
[0294]
适当地，保留信号可以是sekedl(seq id no:1)或kdel(seq id no:2)序列。kdel受体结合er-高尔基体中间区室或早期高尔基体中的蛋白质并将它们返回到er。蛋白质仅在kdel序列被切割后离开er。因此，驻留在er中的蛋白质只要包含kdel序列就会保留在er中。尽管常见的哺乳动物信号是kdel，但已经表明kdel受体与序列hdel结合得更紧密
(scheel等人；j.biol.chem.268；7465(1993))。细胞内保留信号可以是hdel。
[0295]
适当地，保留结构域，特别是例如sekdel(seq id no:1)或kdel(seq id no:2)的高尔基体保留序列，位于工程化蛋白质的c末端，以靶向特定的细胞内区室，特别是高尔基体。
[0296]
适当地，保留结构域，特别是例如sekdel(seq id no:1)或kdel(seq id no:2)的高尔基体保留序列，不紧邻本发明的核酸构建体中的自切割肽(例如2a或2a样肽)的上游/5'。
[0297]
kkx'x'和kx'kx'x'信号是可置于i型膜蛋白的细胞质侧的回收信号(retrieval signal)。这些信号的序列要求由teasdale&jackson(annu.rev.cell dev.biol.；12；27(1996))详细提供。
[0298]
适当地，保留信号可以是kkxx(seq id no:3)基序。适当地，kkxx结构域可以位于蛋白质的c末端。kkxx负责通过与外壳蛋白(copi)复合物的相互作用，通过逆行运输从高尔基体的顺式末端回收er膜蛋白。
[0299]
适当地，保留信号可以是kxkxx(seq id no:4)基序。
[0300]
细胞内保留信号可以来自腺病毒e19蛋白。细胞内保留信号可以来自蛋白质e3/19k，其也称为e3gp 19kda；e19或gp19k。细胞内保留信号可包含如seq id no.5所示的e3/19k的完整胞质尾；或如seq id no.28所示的该尾部的最后6个氨基酸。适当地，保留信号可以是包含序列kyksrrsfidekkmp(seq id no:5)的腺病毒e19蛋白的尾部。适当地，保留信号可以是包含序列seq id no.28:dekkmp的腺病毒e19蛋白的尾部。
[0301]
适当地，保留结构域可以是包含序列mhrrrsrscr(seq id no:6)的hla恒定链的n末端片段或其保留了起到保留信号功能的能力的具有至少80％同一性的变体。
[0302]
保留信号可以是驻留在er中的蛋白质或结构域。
[0303]
er保留信号可以选自：驻留在er中的恒定链的同种型(ii33)、核糖体结合糖蛋白(ribophorin)i、核糖体结合糖蛋白ii、sec61或细胞色素b5或其包含定位结构域的片段。er定位结构域的实例是核糖体结合糖蛋白ii的er定位结构域，genbank登录号bc060556.1。
[0304]
在一方面，内质网保留信号选自：核糖体结合糖蛋白i、核糖体结合糖蛋白ii、sec61或细胞色素b5。
[0305]
细胞内保留信号可以是基于酪氨酸的分选信号、基于二亮氨酸的分选信号、酸性簇信号、溶酶体回避信号、npfx'(1,2)d-型信号、kdel、kkx'x'或kx'kx'x'信号(其中x'是任何氨基酸)。
[0306]
基于酪氨酸的分选信号介导跨膜蛋白从质膜的快速内化和蛋白质向溶酶体的靶向(bonifacino&traub；同上)。基于酪氨酸的分选信号的两种类型由npx'y和yx'x'z'共有基序表示(其中z'是具有庞大疏水侧链的氨基酸)。
[0307]
npx'y信号已被证明可介导i型跨膜蛋白的快速内化，其存在于诸如ldl受体、整合素β和β-淀粉样前体蛋白家族成员的家族中。
[0308]
表1中提供了npx'y信号的示例。
[0309]
表1-npx'y信号
[0310][0311][0312]
括号中的数字表示存在于同一蛋白质内多于一个拷贝的基序。此表和其他表中的信号应视为示例。关键残基以粗体表示。指示了在信号之前(即氨基末端)和之后(即羧基末端)的氨基酸数量。缩写：tm，跨膜；ldl，低密度脂蛋白；lrp1，ldl受体相关蛋白1；app，13-淀粉样前体蛋白；aplp1，app样蛋白1。
[0313]
yx'x'z'型信号存在于：内吞受体，例如转铁蛋白受体和去唾液酸糖蛋白受体；细胞内分选受体，例如ci-和cd-mpr；溶酶体膜蛋白，例如lamp-1和lamp-2；和tgn蛋白，例如tgn38和弗林蛋白酶；以及定位于例如抗原加工区室(例如hla-dm)和细胞毒性颗粒(例如gmp-17)的专门的内体-溶酶体细胞器的蛋白质。yx'x'z'型信号与质膜中蛋白质的快速内化有关。然而，其功能不限于内吞作用，因为相同的基序与跨膜蛋白靶向溶酶体和溶酶体相关细胞器有关。
[0314]
表2中提供了yx'x'z'型信号的示例。
[0315]
表2-yx'x'z'型信号
[0316][0317][0318]
基于二亮氨酸的分选信号([de]x'x'x'll[li])在许多i型、ii型和多跨跨膜蛋白的分选中起关键作用。基于二亮氨酸的分选信号涉及跨膜蛋白的快速内化和溶酶体降解以及蛋白质向晚期内体-溶酶体区室的靶向。包含该信号的组成型活性形式的跨膜蛋白主要定位于晚期内体和溶酶体。
[0319]
表3提供了[de]x'x'x'll[li]分选信号的示例。
[0320]
表3-[de]x'x'x'll[li]分选信号
[0321][0322][0323]
dx'x'll信号构成了独特类型的基于二亮氨酸的分选信号。这些信号存在于多种跨膜受体和其他在tgn和内体之间循环的蛋白质中，信号例如ci-和cd-mpr、sortilin、ldl受体相关蛋白lrp3和lrp10、以及β-分泌酶。
[0324]
表4提供了dx'x'll分选信号的示例。
[0325]
表4-dx'x'll分选信号
[0326][0327][0328]
另一类分选基序是由含有ckii磷酸化位点的酸性残基簇提供的。这种类型的基序通常存在于稳定状态下定位于tgn的跨膜蛋白中，基序包括激素原加工酶弗林蛋白酶、pc6b、pc7、cpd和pam、以及疱疹病毒3的糖蛋白e。
[0329]
表5中提供了酸性簇信号的示例。
[0330]
表5-酸性簇分选信号
[0331][0332]
细胞内保留信号可以选自：npx'y、yx'x'z、[de]x'x'x'l[li]、dx'x'll、dp[fw]、fx'dx'f、npf、lzx'z[de]、lldll、pwdlw、kdel、hdel、kkx'x'或kx'kx'x'；其中x'是任何氨基酸，z'是具有庞大疏水侧链的氨基酸。
[0333]
细胞内保留信号可以是表1至表5中所示的任何序列。
[0334]
细胞内保留信号可以包含酪氨酸酶相关蛋白(tyrp)-1细胞内保留信号。细胞内保留信号可以包含tyrp-1细胞内结构域。细胞内保留信号可以包含序列nqplltd(seq id no.29)或其变体。
[0335]
tyrp1是已充分表征的黑素体蛋白，其以》99％的效率保留在黑素体(特化的溶酶体)中。tyrp1是537个氨基酸的跨膜蛋白，具有内腔结构域(1-477氨基酸)、跨膜结构域(478-501)和胞质结构域(502-537)。驻留在胞质结构域上的二亮氨酸信号导致蛋白质的保留。该二亮氨酸信号具有如seq id no.29(nqplltd)所示的序列。
[0336]
靶标结合结构域
[0337]
靶标结合结构域可以是能够结合其细胞定位将被控制的特定靶分子(或靶蛋白)的蛋白质或多肽链。
[0338]
在一方面，至少一种靶标选自：胞质蛋白、胞内蛋白、胞外蛋白和跨膜蛋白。
[0339]
适当地，靶标可以是内源性蛋白质。例如，靶标可以是由细胞天然表达的蛋白质。换言之，细胞未被工程化以表达靶标。
[0340]
在一方面，靶标结合结构域可以是蛋白质-蛋白质相互作用结构域。适当地，靶标结合结构域可以包含蛋白质相互作用结构域。
[0341]
在一方面，靶标结合结构域包括与靶标结合的抗体、抗体片段或抗原结合片段、单链可变片段(scfv)、结构域抗体(dab)、单结构域抗体(sdab)、vhh/纳米抗体、纳米抗体、affibody、纤连蛋白人工抗体支架、anticalin、affilin、darpin、vnar、ibody、affimer、fynomer、abdurin/纳米抗体、centyrin、alphabody或nanofitin。
[0342]
在一方面，至少一个靶标结合结构域是结构域抗体(dab)。
[0343]
在一方面，至少一个靶标结合结构域是单链可变片段(scfv)。
[0344]
在一方面，靶标结合结构域可以是结合靶分子的受体或配体。例如，靶标可以是pd-1并且靶标结合分子可以是结合pd-1的配体(例如，pd-l1或pd-l2)。
[0345]
靶标可以是预期控制其定位的任何蛋白质，例如预期控制(例如减少或抑制)其分泌的任何蛋白质。可预期控制(例如减少或抑制)调节肿瘤环境的蛋白质的分泌，该蛋白质例如为白细胞介素12(il-12)等免疫调节细胞因子或引起炎症的蛋白质。
[0346]
或者，靶标可以是预期控制其细胞表面表达的任何蛋白质。例如，如果car t细胞靶向也在所述car t细胞表面上表达的配体组(例如cd2、cd5或cd7)，可预期控制(例如减少或抑制)细胞表面蛋白的表达以减少自体攻击。
[0347]
还可预期控制(例如减少或抑制)通常存在于细胞表面的抑制性蛋白质(例如pd1、tigit、btla、tim3、fas、ctla、tbr2或lag3)的表达。
[0348]
在一些情况下，靶标可以是预期控制其细胞内细胞定位的蛋白质。可预期控制蛋白质在特定细胞区室中的定位以消除其功能。例如，其功能取决于质膜位置的胞质蛋白(例如zap70、slp76或akt)的细胞定位。
[0349]
在一方面，至少两个靶标结合结构域可以结合相同靶标的不同区域。
[0350]
或者，至少两个靶标结合结构域可以结合不同的靶标。适当地，至少两种靶标可以位于同一细胞区室中。适当地，至少两种靶标可以位于不同细胞区室中。
[0351]
在一方面，至少一个靶标结合结构域与cd3/t细胞受体(tcr)复合物的组分、细胞因子、人白细胞抗原(hla)i类分子、下调免疫应答的受体、在t细胞上表达的配体或调节免疫应答的胞质蛋白结合。
[0352]
适当地，cd3/tcr复合物的组分可以是cd3ε、tcrα、tcrαβ、tcrγ、tcrδ、cd3δ、cd3γ或cd3ζ。
[0353]
可用于本发明的示例性靶标结合结构域是抗-cd3εucht(在图2中显示为ab-1)或其具有至少80％同一性的变体：
[0354]
ab-1(acd3e_ucht):
[0355]
diqmtqspsslsasvgnrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveiksggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss(seq id no:30)
[0356]
适当地，hla i类分子可以是b2-微球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白或α3-微球蛋白。
[0357]
可用于本发明的示例性靶标结合结构域是抗-b2-微球蛋白_dn6b2m(在图2中显示为ab-2)或其具有至少80％同一性的变体：
[0358]
ab-2(ab2m_dn6b2m):
[0359]
qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytdsrycmawfrqapgkerewvarinsgrdityyadsvkgrftfsqdnakntvylqmdslepedtatyycatdiplrcrdivakggdgfrywgqgtqvtvss(seq id no:31)
[0360]
适当的，靶蛋白可以是mhc ii类分子。在人类中，mhc ii类蛋白复合物由人白细胞抗原基因复合物(hla)编码。对应于mhc ii类的hla是hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr。
[0361]
hla ii类分子形成为两条多肽链:α和β。这些分子通常从一个个体到另一个个体是高度多态的，但是某些单倍型在某些群体中比在其他群体更常见。
[0362]
任何单倍型或任何单倍型组合的多肽可用作本发明中的靶标，包括hla-drb、hla-drb03、hla-drb15、hla-drb04、hla-drb07、hla-drb01。
[0363]
hla-dr具有非常低的多态性，使得hla-drα和/或hla-drβ特别适合用作本发明的靶标。
[0364]
hla-dp和hla-dq具有多态α和β链。因此，可以选择常见的hla-dp或hla-dqα或β链，并限制仅来自具有该单倍型的受体的同种异体产生。适当地，受体可以针对该单倍型是纯合的。当受体针对该单倍型不是纯合的时，可以使用两种hla-dp和两种hla-dq(任选地与例如hla-drα的hla-dr组合)。
[0365]
immunogenetics(imgt)数据库中提供了mhc多肽的序列(lefranc,m.-p.等人,nucleic acids res.,27:209-212(1999)；doi:10.1093/nar/27.1.209)。
[0366]
适当地，下调免疫应答的受体可以选自程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、t细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域-3(tim3)、杀伤性免疫球蛋白样受体(kir)、cd94、nkg2a、tigit、btla、fas、tbr2、lag3或蛋白酪氨酸磷酸酶。
[0367]
可用于本发明的示例性靶标结合结构域是抗pd1_克隆10(在图2中显示为ab-3)或其具有至少80％同一性的变体：
[0368]
ab-3(apd1_克隆10):
[0369]
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrsgqnivhsngntylewylqkpgqspklliykvsnrffgvpdrisgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcfqgshvpftfgsgtkleiksggggsggggsggggsdvqlqesgpglvkpsqslsltctvtgysitsdyawnwirqfpgnklewmgyinysgstsynpslksrisitrdtsknqfflqlnsvttedtatyycarwigssawyfdvwgagttvtvss(seq id no:32)
[0370]
适当地，调节免疫应答的胞质蛋白可以选自csk、shp1、shp2、zap-70、slp76和akt。
[0371]
适当地，在t细胞上表达的配体可以是cd5、cd7或cd2。
[0372]
在一方面，根据本发明的工程化免疫细胞进一步包含嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)。
[0373]
可用于本发明的示例性car序列是cd19car或其具有至少80％同一性的变体：
[0374]
acd19car:
[0375]
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitkaggggsggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:33)
[0376]
标志物
[0377]
在一方面，一种或多种核酸构建体或工程化蛋白质可以进一步包含至少一种标志物，优选地，所述标志物是包含至少一种mab特异性表位的细胞外结合结构域。表位可以是由抗体识别的细胞外结构域。
[0378]
标志物可用于测量转导效率，以允许转导细胞的纯化和/或促进工程化细胞的耗尽。适当地，标志物可以由自杀基因编码并且在毒性条件下促进工程化细胞的消耗。
[0379]
可用于本发明的示例性标志物是rqr8或其具有至少80％同一性的变体：
[0380]
rqr8:
[0381]
cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvvra(seq id no:34)
[0382]
利妥昔单抗可用于消耗表达rqr8的工程化细胞。
[0383]
信号肽
[0384]
经典的蛋白质分泌途径通过内质网(er)。本文所述的工程化蛋白质、标志物、car和转基因tcr可以包含信号序列，使得当所述蛋白质在细胞内表达时，新生蛋白质被引导至er。
[0385]
术语“信号肽”与“信号序列”同义。
[0386]
信号肽是通常长度为5-30个氨基酸的短肽，一般存在于大多数新合成的注定要进入分泌途径的蛋白质的n末端。这些蛋白质包括驻留在某些细胞器(例如，内质网、高尔基体或内体)内、从细胞分泌的蛋白质和跨膜蛋白质。
[0387]
信号肽通常包含核心序列，该核心序列是具有形成单个α-螺旋的趋势的一长段疏水性氨基酸。信号肽可以以一段带正电荷的氨基酸短链开始，这有助于在易位过程中加强多肽的合适拓扑结构。在信号肽的末端通常有一段氨基酸被信号肽酶识别和切割。信号肽酶可以在易位过程中或完成后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。游离信号肽随后被特定蛋白酶消化。
[0388]
尽管已知一些羧基末端信号肽，但信号肽通常位于分子的氨基末端。
[0389]
信号序列通常具有三部分结构，由侧接n区和c区的疏水核心区(h区)组成。c区包含信号肽酶(spase)共有切割位点。通常，信号序列被共翻译地切割，得到的切割的信号序列被称为信号肽。
[0390]
信号序列可以使用软件技术检测或预测(参见例如http://www.predisi.de/)。
[0391]
大量的信号序列是已知的，并且可以在数据库中获得。例如，http://www.signalpeptide.de在其数据库中列出了2109个已确认的哺乳动物信号肽。
[0392]
在一个实施方案中，蛋白质可以可操作地连接至能够使蛋白质易位进入内质网(er)的信号肽。可以将蛋白质工程改造为可操作地连接至能够使蛋白质易位进入er的信号肽。适当地，蛋白质可以可操作地连接至原本通常不能可操作地连接的信号肽。适当地，蛋白质和信号肽的组合可以是合成的(例如在自然界中不存在)。
[0393]
在一些实施方案中，可以使用改造的信号肽(例如效率较低的信号肽)。改造的信号肽的使用可以允许系统根据临床需要进行调整。可以通过调节一种或多种信号肽对两种蛋白质的效率来改变蛋白质的比例。用于调节信号肽效率的方法描述于wo2016/174409(其通过引用并入本文)。
[0394]
适当地，信号肽可以是鼠ig kappa链v-iii区信号肽或其变体。鼠ig kappa链v-iii区信号肽的氨基酸序列在seq id no:35中列出。适当地，信号肽可以包含示例性序列seq id no 35或其具有至少80％同一性的变体。
[0395]
metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0396]
适当地，信号肽可以包含示例性序列seq id no:36中列出的序列或其具有至少80％同一性的变体。
[0397]
mgtsllcwmalcllgadhada(seq id no:36)。
[0398]
变体序列可以与seq id no:35-36具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前体是该序列能够起到信号肽的功能。变体序列保留了将新生蛋白引导至er的能力。
[0399]
嵌合抗原受体(car)
[0400]
经典的car是将细胞外抗原识别结构域(结合剂)连接到细胞内信号转导结构域(胞内域)的嵌合i型跨膜蛋白。结合剂通常是源自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但其也可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式或基于靶抗原的配体。可能需要间隔结构域以将结合剂与膜分离并使其具有合适的取向。使用的常见间隔结构域是igg1的fc。取决于抗原，例如cd8α的茎以及甚至仅单独的igg1铰链区的更小型间隔区也可能足够。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔物连接到胞内域。
[0401]
早期的car设计具有源自fcεr1的γ链或cd3ζ的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传递的免疫信号1足以触发t细胞对同源靶细胞的杀伤，但未能完全激活t细胞增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：将t细胞共刺激分子的细胞内部分与cd3ζ的细胞内部分融合产生第二代受体，该受体可以在抗原识别后同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是cd28的细胞内部分。这提供了最有效的共刺激信号，即触发t细胞增殖的免疫信号2。还描述了一些包括tnf受体家族胞内域的受体，例如传递存活信号的密切相关的ox40和4-1bb。现在已经描述了具有能够传递激活、增殖和存活信号的胞内域的更有效的第三代car。
[0402]
可以使用例如逆转录病毒载体将编码car的核酸转移至t细胞。通过这种方式，可以产生大量抗原特异性t细胞用于过继细胞转移。当car结合靶抗原时，这会导致激活信号向其表达的t细胞的传递。因此，car将t细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶向抗原的细胞。
[0403]
抗原结合结构域
[0404]
抗原结合结构域是经典car识别抗原的部分。
[0405]
许多抗原结合结构域是本领域已知的，包括基于抗体的抗原结合位点、抗体模拟物和t细胞受体的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：源自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)；靶抗原的野生型配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单结构域结合剂，例如camelid；作为darpin的人工结合剂；或源自t细胞受体的单链。
[0406]
已知多种肿瘤相关抗原(taa)，如下表所示。本发明中使用的抗原结合结构域可以是如其中所示的能够结合taa的结构域。
[0407]
表6
[0408][0409][0410]
跨膜结构域
[0411]
跨膜结构域是经典car的跨膜序列。其可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可来源于提供了良好的受体稳定性的cd28。
[0412]
car或tcr信号肽
[0413]
用于本发明的car或转基因tcr可包含信号肽，从而当其在诸如t细胞的细胞中表达时，新生蛋白被引导至内质网并随后引导至其被表达的细胞表面。
[0414]
信号肽的核心可以含有倾向于形成单个α-螺旋的一长段疏水性氨基酸。信号肽可以以一段带正电荷的氨基酸短链开始，这有助于在易位过程中加强多肽的合适拓扑结构。在信号肽的末端通常有一段氨基酸被信号肽酶识别和切割。信号肽酶可以在易位过程中或完成后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。游离信号肽随后通过特定蛋白酶消化。
[0415]
间隔结构域
[0416]
受体可以包含间隔序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域。柔性间隔物允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进结合。
[0417]
例如，间隔序列可以包含igg1 fc区、igg1铰链或人cd8茎或小鼠cd8茎。间隔物可选地包含与igg1 fc区、igg1铰链或cd8茎具有相似的长度和/或结构域间隔特性的替代接头序列。可以改造人igg1间隔物以去除fc结合基序。
[0418]
细胞内信号传导结构域
[0419]
细胞内信号传导结构域是经典car的信号传递部分。
[0420]
最常用的信号传导结构域组分是包含3个itam的cd3-zeta胞内域的组分。其在抗原结合后将激活信号传递给t细胞。cd3-zeta可能无法提供完全有效的激活信号并且可能需要额外的共刺激信号。例如，嵌合cd28和ox40可与cd3-zeta共同使用，或三者共同使用以传递增殖/存活信号。
[0421]
细胞内信号传导结构域可以是或包含t细胞信号传导结构域。
[0422]
细胞内信号传导结构域可以包含一种或多种基于免疫受体酪氨酸的激活基序
(itam)。itam是在免疫系统的某些细胞表面蛋白的胞质尾部重复两次的四个氨基酸的保守序列。该基序包含通过任何其他两个氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸隔开的酪氨酸，标记为yxxl/i。这类基序中的两个通常由分子尾部的6至8个氨基酸隔开(yxxl/ix
(6-8)
yxxl/i)。
[0423]
itam对免疫细胞中的信号转导具有重要意义。因此，其存在于重要的细胞信号传导分子的尾部，细胞信号传导分子例如为cd3和t细胞受体复合物的ζ链、cd79α和b细胞受体复合物的β链以及某些fc受体。这些基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并为参与细胞信号传导途径的其他蛋白质形成对接位点。
[0424]
细胞内信号传导结构域组分可以包含、基本上组成为或组成为含有三个itam的cd3-ζ胞内域。经典地，cd3-ζ胞内域在抗原结合后将激活信号传递给t细胞。
[0425]
细胞内信号传导结构域可以包含其他共刺激信号传导。例如，4-1bb(也称为cd137)可以与cd3-ζ一起使用，或者cd28和ox40可以与cd3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号。
[0426]
适当地，car可以具有通用格式:抗原结合结构域-tcr元件。
[0427]
如本文所用,“tcr元件”指tcr受体复合物组分的结构域或其部分。tcr元件可以包含(例如具有)细胞外结构域和/或跨膜结构域和/或细胞内结构域，例如tcr元件的细胞内信号传导结构域。
[0428]
tcr元件可以选自tcrα链、tcrβ链、cd3ε链、cd3γ链、cd3δ链、cd3ε链。
[0429]
适当地，tcr元件可以包含tcrα链、tcrβ链、cd3ε链、cd3γ链、cd3δ链或cd3ε链的细胞外结构域。适当地，tcr元件可以包含tcrα链、tcrβ链、cd3ε链、cd3γ链、cd3δ链或cd3ε链的跨膜结构域。适当地，tcr元件可以包含tcrα链、tcrβ链、cd3ε链、cd3γ链、cd3δ链或cd3ε链的细胞内结构域。适当地，tcr元件可以包含tcrα链、tcrβ链、cd3ε链、cd3γ链、cd3δ链或cd3ε链。
[0430]
转基因t细胞受体(tcr)
[0431]
t细胞受体(tcr)是在t细胞表面存在的分子，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽的抗原片段。
[0432]
tcr是由两种不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人体中，在95％的t细胞中，tcr由alpha(α)链和beta(β)链(分别由tra和trb编码)组成，而在5％的t细胞中，tcr由gamma和delta(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。
[0433]
当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)结合时，t淋巴细胞通过信号传导被激活。
[0434]
与传统的抗体导向的靶抗原相比，tcr识别的抗原可以包括潜在的细胞内蛋白质的完整阵列，这些蛋白质被加工并作为肽/mhc复合物被传递到细胞表面。
[0435]
通过人工引入tra和trb基因或使用载体将trg和trd基因导入细胞，可以改造细胞以表达异源(即非天然)tcr分子。例如，工程化tcr的基因可被重新引入自体t细胞并转移回患者体内进行t细胞过继治疗。这种“异源”tcr在本文中也可称为“转基因tcr”。
[0436]
核酸构建体/核酸序列的试剂盒
[0437]
本发明提供共同编码至少两个靶标结合结构域的一种或多种核酸构建体，其中所述一种或多种核酸构建体共同包含编码细胞内保留信号的单个核苷酸序列，当在细胞中共表达时，所述细胞内保留信号控制每个靶标结合结构域的细胞定位。
[0438]
适当地，一种或多种可以指一种、两种、三种或四种核酸构建体。
[0439]
适当地，本发明提供共同编码根据本发明的元件的一种或两种核酸构建体。最小化提供本发明的元件所需的核酸构建体的总数减少了与需要将多个构建体引入靶细胞相关的缺点。
[0440]
在一方面，至少两个靶标结合结构域中的每个和细胞内保留信号被编码为单独的多肽；包含靶标结合结构域的每种多肽进一步包含第一蛋白相互作用结构域，并且包含细胞内保留信号的多肽进一步包含第二蛋白相互作用结构域，其中第一和第二蛋白相互作用结构域能够相互结合。
[0441]
在另一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含以下结构：
[0442]
a-x-b-c
[0443]
其中：
[0444]
a和b是编码如本文限定的靶标结合结构域的核酸序列；x是如本文限定的接头；c是如本文限定的细胞内保留信号。
[0445]
适当地，核酸构建体还可以包含一种或多种编码其他靶标结合结构域的其他核酸序列。其他靶标结合结构域优选地偶联到细胞内保留信号。
[0446]
核酸构建体还可以包含编码car或转基因tcr或至少一种诸如细胞外结合结构域的标志物的核酸序列。示例性标志物为rqr8或其变体。
[0447]
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
[0448]
适当地，核酸构建体可以包含多个核酸序列，其编码例如至少两个靶标结合蛋白和细胞内保留信号的本发明的组分，任选地进一步包含其他靶标结合结构域、car、转基因tcr、标志物。例如，核酸构建体可以包含两种、三种、四种或更多种编码本发明的不同组分的核酸序列。适当地，多个核酸序列可以由本文限定的共表达位点分隔开。
[0449]
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸替换，以反映将表达多肽的任何特定宿主生物的密码子使用。适当地，本发明的多核苷酸是密码子优化的，以能够在哺乳动物细胞特别是如本文所述的溶细胞性免疫细胞中表达。
[0450]
根据本发明的核酸可以包含dna或rna。其可以是单链或双链的。其也可以是在其中包含合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知许多不同类型的寡核苷酸修饰。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架，并在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解多核苷酸可通过本领域可用的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰以增加感兴趣的多核苷酸的体内活性或使用期限。
[0451]
与核苷酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括对来自序列或到序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加。
[0452]
共表达位点
[0453]
本文使用的共表达位点是指能够使编码根据本发明的工程化免疫细胞的靶标结合蛋白和其他工程化组分的核酸序列共表达的核酸序列，其他工程化组分例如为：car、转基因tcr和异多聚体多肽组分。
[0454]
适当地，在第一核酸序列和第二核酸序列之间可以存在共表达位点。适当地，在工程化多核苷酸中存在多个共表达位点的实施方案中，可以使用相同的共表达位点。
[0455]
优选地，共表达位点是切割位点。切割位点可以是能够使两种多肽分离的任何序列。切割位点可以是自切割的，使得当多肽产生时，其立即被切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。
[0456]
为方便起见，本文使用术语“切割”，但切割位点可导致肽通过经典切割以外的机制分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽(见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自身蛋白水解或转化效应(donnelly等人(2001)j.gen.virol.82:1027-1041)。这种“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要，只要切割位点位于编码蛋白质的核酸序列之间时会导致蛋白质作为单独的实体表达即可。
[0457]
切割位点可以是烟草蚀刻病毒(tev)切割位点。
[0458]
tev蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其为糜蛋白酶样蛋白酶。tev蛋白酶对其靶切割位点非常特异，因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有的tev切割位点是enlyfq\s(其中“\”表示切割的肽键)。诸如人细胞的哺乳动物细胞不表达tev蛋白酶。因此，在本核酸构建体包含tev切割位点并在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，外源tev蛋白酶也必须在哺乳动物细胞中表达。
[0459]
切割位点可以编码自切割肽。“自切割肽”是指起到此种功能的肽：当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其会立即被“切割”或分离成不同的和离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。
[0460]
自切割肽可以是来自口疮病毒或心脏病毒的2a自切割肽。口疮病毒或心脏病毒的初级2a/2b切割是由2a在其自身c末端的“切割”介导的。在例如口蹄疫病毒(fmdv)和a型马鼻炎病毒等的口蹄疫病毒中，2a区域是约18个氨基酸的一小段，其与蛋白质2b的n端残基(保守的脯氨酸残基)共同表示能够在其自身的c末端介导“切割”的自主元件(donelly等人(2001)同上)。
[0461]
如上所述，“2a样”序列已在除口疮病毒(apthovirus)或心脏病毒(cardiovirus)之外的小核糖核酸病毒(picornavirus)、“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒、c型轮状病毒(rotavirus)和锥虫属(trypanosoma spp)内的重复序列和如上的细菌序列(donnelly等人，2001)中发现。
[0462]
可用于本发明的示例性2a序列包括：
[0463]
egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)或其变体，该变体与seq id no:37具有至少80％的序列同一性并保留起到切割位点功能的能力。
[0464]
共表达序列可以是内部核糖体进入序列(ires)。共表达序列可以是内部启动子。
[0465]
载体
[0466]
本发明还提供了包含一种或多种本发明的核酸序列或核酸构建体的载体。此类载体可用于将核酸序列或构建体引入宿主细胞，以使其表达如本文限定的包含至少两个与细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域的工程化蛋白质。
[0467]
适当地，载体可以包含编码如本发明提供的不同组分的多种核酸序列。例如，载体可以包含两种、三种、四种或更多种编码本发明的不同组分的核酸序列，该组分例如为至少两个靶标结合结构域、细胞内保留信号和标志物、car或转基因tcr。适当地，多种核酸序列可以由本文限定的共表达位点分离。
[0468]
例如，载体可以是质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。
[0469]
载体可以能够转染或转导细胞。
[0470]
药物组合物
[0471]
本发明还涉及包含根据本发明的工程化免疫细胞或通过根据本发明的方法可获得(例如得到)的细胞的药物组合物。
[0472]
本发明还提供了包含根据本发明的核酸构建体、如本文限定的核酸序列的组或根据本发明的载体的药物组合物。特别地，本发明涉及含有根据本发明的细胞的药物组合物。
[0473]
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。例如，这种制剂可以是适于静脉内输注的形式。
[0474]
治疗方法
[0475]
本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明或通过根据本发明的方法可获得(例如得到)的工程化免疫细胞、或根据本发明的核酸构建体、或如本文限定的核酸序列的组、或根据本发明的载体(例如在如上药物组合物中所述)施用于受试者的步骤。
[0476]
适当地，本发明用于治疗和/或预防疾病的方法可以包括将根据本发明的工程化免疫细胞(例如在如上药物组合物中所述)施用于受试者。
[0477]
治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗用途。在这方面，可以将细胞施用于患有现有疾病或病症的受试者以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
[0478]
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防用途。在这方面，可以将细胞施用于尚未感染疾病和/或未表现出任何疾病症状的受试者以预防或削弱疾病的病因或减少或预防至少一种与疾病相关的症状的发展。受试者可能具有该疾病的易感性或被认为有发生该疾病的风险。
[0479]
该方法可以涉及以下步骤：
[0480]
(i)分离含有样品的细胞；
[0481]
(ii)将根据本发明的核酸构建体、如本文限定的核酸序列的组或根据本发明的载体引入细胞；和
[0482]
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
[0483]
该方法可以涉及以下步骤：
[0484]
(i)将根据本发明的核酸构建体、如本文限定的核酸序列的组或根据本发明的载体引入细胞；和
[0485]
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
[0486]
适当地，可以通过转导引入核酸构建体、载体或核酸。适当地，可以通过转染引入核酸构建体、载体或核酸。
[0487]
适当地，细胞可以是自体的。适当地，细胞可以是同种异体的。
[0488]
本发明提供根据本发明的工程化免疫细胞、根据本发明的核酸构建体、如本文限定的核酸序列的组或根据本发明的载体，其用于治疗和/或预防疾病。特别地，本发明提供
了本发明的工程化免疫细胞，其用于治疗和/或预防疾病。
[0489]
本发明还涉及根据本发明的工程化免疫细胞、根据本发明的核酸构建体、如本文限定的核酸序列的组或根据本发明的载体在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。特别地，本发明涉及根据本发明的工程化免疫细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
[0490]
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌症。
[0491]
癌症可以是例如神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞癌)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌和甲状腺癌的癌症。
[0492]
本发明的细胞可以能够杀伤例如癌细胞的靶细胞。靶细胞可以通过taa的表达来识别，例如上表中列出的taa的表达。
[0493]
制备细胞的方法
[0494]
本发明的工程化免疫细胞可以通过以包括病毒载体的转导、dna或rna的转染的多种方式中的一种引入编码工程化蛋白质的dna或rna来产生，所述工程化蛋白质包含至少两个与如本文限定的细胞内保留信号偶联的靶标结合结构域。
[0495]
本发明的细胞可以通过将根据本发明的核酸构建体或载体、或如上限定的核酸序列的组、或根据本发明的载体引入细胞(例如通过转导或转染)来制备。
[0496]
适当地，细胞可以来自从受试者分离的样品。
[0497]
如本文所用，术语“引入”或“并入”是指将外源dna或rna插入细胞的方法。如本文所用，术语引入包括转导和转染方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。转导是通过病毒载体将外源dna或rna引入细胞的过程。
[0498]
根据本发明的工程化细胞可以通过以包括病毒载体的转导、dna或rna的转染的多种方式中的一种引入编码可释放蛋白和保留蛋白的dna或rna来产生。
[0499]
可以在引入核酸序列之前激活和/或扩增细胞，例如通过抗cd3单克隆抗体或抗cd3和抗cd28单克隆抗体处理。如本文所用，“激活”是指细胞已被刺激，从而导致细胞增殖、分化或启动效应器功能。
[0500]
用于测量细胞激活的方法是本领域已知的并且包括例如，通过流式细胞术测量激活标志物的表达，如cd69、cd25、cd38或hla-dr的表达或测量细胞内细胞因子。
[0501]
如本文所用，“扩增”是指细胞或细胞群已被诱导增殖。
[0502]
例如，可以通过对存在于群体中的细胞数量进行计数来测量细胞群体的扩增。细胞的表型可以通过本领域已知的方法如流式细胞术确定。
[0503]
图中描述的示例性核酸构建体编码包含按其列出的顺序的各种组分的以下多蛋白。本发明的一种或多种核酸构建体可以编码如图所示的多蛋白；或其如本文所述的变体。
[0504]
图2构建从n端到c端的氨基酸序列信号序列:mgtsllcwmalcllgadhada(seq id no:36)
[0505]
rqr8:
[0506]
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[0507]
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[0508]
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[0509]
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[0510]
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[0511]
接头(l1):sgggsgggsgggs(seq id no:11)
[0512]
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[0513]
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[0514]
接头(l2):sgggsgggsgggs(seq id no:11)
[0515]
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[0516]
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[0517]
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[0518]
图3a构建从n到c端的氨基酸序列
[0519]
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[0520]
rqr8:
[0521]
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[0524]
acd19car:
[0525]
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ch1:
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[0541]
图3b构建从n到c端的氨基酸序列
[0542]
质粒1
[0543]
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[0548]
ab-1(acd3e_ucht):
[0549]
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[0550]
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[0554]
质粒2
[0555]
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[0556]
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[0557]
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[0558]
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[0561]
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[0562]
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[0563]
stkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv(seq id no:15)
[0564]
kdel:sekdel(seq id no:1)
[0565]
图3b构建从n到c端的氨基酸序列
[0566]
信号序列:mgtsllcwmalcllgadhada(seq id no:36)
[0567]
rqr8:
[0568]
cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvvra(seq id no:34)
[0569]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0570]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0571]
ab-1(acd3e_ucht):
[0572]
diqmtqspsslsasvgnrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveiksggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss(seq id no:30)
[0573]
kappa c:
[0574]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:14)
[0575]
ab-2(ab2m_dn6b2m):
[0576]
qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytdsrycmawfrqapgkerewvarinsgrdityyadsvkgrftfsqdnakntvylqmdslepedtatyycatdiplrcrdivakggdgfrywgqgtqvtvss(seq id no:31)
[0577]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0578]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0579]
ab-3(apd1_克隆10):
[0580]
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrsgqnivhsngntylewylqkpgqspklliykvsnrffgvpdrisgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcfqgshvpftfgsgtkleiksggggsggggsggggsdvqlqesgpglvkpsqslsltctvtgysitsdyawnwirqfpgnklewmgyinysgstsynpslksrisitrdtsknqfflqlnsvttedtatyycarwigssawyfdvwgagttvtvss(seq id no:32)
[0581]
cd79a:
[0582]
lwmhkvpaslmvslgedahfqcphnssnnanvtwwrvlhgnytwppeflgpgedpngtliiqnvnkshggiyvcrvqegnesyqqscgtylrvrqppprpfldmgegtknr(seq id no:12)
[0583]
ab-4(acd52_):
[0584]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnidkylnwyqqkpgkapklliyntnnlqtgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyyclqhisrprtfgqgtkveiksggggsggggsggggsqvqlqesgpglvrpsqtlsltctvsgftftdfymnwvrqppgrglewigfirdkakgytteynpsvkgrvtmlvdtsknqfslrlssvtaadtavyycareghtaapfdywgqgslvtvss(seq id no:39)
[0585]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0586]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0587]
ab-5(atbr2_e11):
[0588]
qvqlqesggglvqpggslrlscaasgiilsskavawyrqppgqqregvahssvsgttiyadsvkgrftvsrdnakntvylemnslkpedtavyyctapvghwgqgtqvtvss(seq id no:40)
[0589]
cd79b:
[0590]
arsedryrnpkgsacsriwqsprfiarkrgftvkmhcymnsasgnvswlwkqemdenpqqlklekgrmeesqneslatltiqgirfedngiyfcqqkcnntsevyqgcgtelrvmgfstlaqlkqrntlkd(seq id no:13)
[0591]
接头:sgggsgggsgggs(seq id no:11)
[0592]
ch1:
[0593]
stkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv(seq id no:15)
[0594]
kdel:sekdel(seq id no:1)
[0595]
图4构建从n到c端的氨基酸序列
[0596]
信号序列:mgtsllcwmalcllgadhada(seq id no:36)
[0597]
rqr8:
[0598]
cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvvra(seq id no:34)
[0599]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0600]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0601]
ab-1(acd3e_ucht):
[0602]
diqmtqspsslsasvgnrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveiksggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrls
caasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss(seq id no:30)
[0603]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0604]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0605]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0606]
ab-2(ab2m_dn6b2m):
[0607]
qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytdsrycmawfrqapgkerewvarinsgrdityyadsvkgrftfsqdnakntvylqmdslepedtatyycatdiplrcrdivakggdgfrywgqgtqvtvss(seq id no:31)
[0608]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0609]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0610]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0611]
ab-3(apd1_克隆10):
[0612]
dvlmtqtplslpvslgdqasiscrsgqnivhsngntylewylqkpgqspklliykvsnrffgvpdrisgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcfqgshvpftfgsgtkleiksggggsggggsggggsdvqlqesgpglvkpsqslsltctvtgysitsdyawnwirqfpgnklewmgyinysgstsynpslksrisitrdtsknqfflqlnsvttedtatyycarwigssawyfdvwgagttvtvss(seq id no:32)
[0613]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0614]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0615]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0616]
抗-alfa_标签(nbalfa):
[0617]
evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss(seq id no:22)
[0618]
kdel:sekdel(seq id no:1)
[0619]
图5构建从n到c端的氨基酸序列
[0620]
信号序列:mgtsllcwmalcllgadhada(seq id no:36)
[0621]
rqr8:
[0622]
cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvvra(seq id no:34)
[0623]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0624]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0625]
acd19car:
[0626]
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitkaggggsggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:38)
[0627]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0628]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0629]
ab-1(acd3e_ucht):
[0630]
diqmtqspsslsasvgnrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveiksggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss(seq id no:30)
[0631]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0632]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0633]
ab-2(ab2m_dn6b2m):
[0634]
qvqlqesgggsvqaggslrlscaasgytdsrycmawfrqapgkerewvarinsgrdityyadsvkgrftfsqdnakntvylqmdslepedtatyycatdiplrcrdivakggdgfrywgqgtqvtvss(seq id no:31)
[0635]
alfa_标签:psrleeelrrrltep(seq id no:21)
[0636]
2a:egrgslltcgdveenpgp(seq id no:37)
[0637]
信号序列:metdtlilwvllllvpgstg(seq id no:35)
[0638]
抗-alfa_标签(nbalfa):
[0639]
evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss(seq id no:22)
[0640]
cd8stk:
[0641]
ptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdi(seq id no:18)
[0642]
tyrp-tm:iiaiavvgalllvalifgtasyli(seq id no:16)
[0643]
接头:sgggsgggsgggs(seq id no:11)
[0644]
抗-alfa_标签(nbalfa):
[0645]
evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss(seq id no:22)
[0646]
dcd20_n-末端:
[0647]
ttprnsvngtfpaepmkgpiamqsgpkplfrrmsslvgptqsffmresktlgavq(seq id no:19)
[0648]
dcd20_tm:imnglfhialggllmipagiya(seq id no:17)
[0649]
dcd20_短_环:picvtv(seq id no:20)
[0650]
kdel:sekdel(seq id no:1)
[0651]
本公开不受本发明公开的示例性方法和材料的限制，并且与本发明所述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0652]
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中任一限制、无一限制或两个限制均不包括在较小范围内的每个范围也包括在本公开内，但受
制于规定的范围中任何明确排除的限制。在所述范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
[0653]
必须注意，如本发明和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
[0654]
如本发明所用的术语“包含”、“含有”和“由
……
构成”与“包括”、“具有”或者“含”、“含有”同义，并且是包容性或开放式的，并且不排除额外的、非-列举的成员、元素或方法步骤。术语“包括”、“包含”和“含有”还包括术语“由...组成”。
[0655]
本发明所讨论的出版物仅针对其在本技术的提交日期之前的公开而提供。本发明中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0656]
现将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明并且不以任何方式限制本发明的范围。
[0657]
现将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明并且不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0658]
实施例1—“菊花链(daisy-chain)”连接的结合剂
[0659]
针对cd3e、b2m和pd1的靶标结合结构域依次连接，后跟c末端的kdel序列。该构建体包含rqr8标志物，后跟2a自切割肽，后跟c末端具有kdel序列的菊花链结合剂(参见图2)。将该构建体转导到pd1阳性jurkat和激活的pbmc中，并通过流式细胞术评估tcr、hla和pd1的表面表达水平。
[0660]
实施例2—异多聚偶联蛋白
[0661]
针对cd3e和b2m的靶标结合结构域提供在含有kappa结构域的多肽链上，另外的针对pd1的靶标结合结构域提供在包含后跟c末端kdel序列的第二ch1结构域的多肽链上。这两条多肽链在由2a肽分离的同一质粒上编码(参见图3a)或者在两个单独的质粒上编码并用于双转导(参见图3b)。在其他实施方案中，可以在添加cd79异二聚体的情况下添加两种其他结合剂(参见图3c)。将这些构建体转导到pd1阳性jurkat和激活的pbmc中，并通过流式细胞术评估tcr、hla和pd1的表面表达水平。
[0662]
实施例3—“肽-标签”连接的结合剂
[0663]
针对cd3e、b2m和pd1的靶标结合结构域在n末端或c末端用alfa肽(小α螺旋肽结构)标记并由2a自切割肽分离。最终的多肽链包含后跟c末端kdel序列的抗alfadab标签结合蛋白(nbalfa)(参见图4)。将该构建体转导到pd1阳性jurkat和激活的pbmc中，并通过流式细胞术评估tcr、hla和pd1的表面表达水平。
[0664]
实施例4—针对细胞外和细胞内靶蛋白的连接结合剂
[0665]
针对b2m和shp2的靶标结合结构域用alfa肽标记并由2a自切割肽分离(shp2标记的结合剂将不包含信号序列以确保胞质定位)。最终的多肽链包含信号序列；后跟cd8茎的抗alfa dab；跨膜结构域，接头；第二摇摆抗alfa dab；后跟c末端kdel序列的截短的cd20(包含其n末端、tm和小环)(参见图5)。将该构建体转导到pd1阳性jurkat和激活的pbmc中，并通过流式细胞术评估hla的表面表达水平。通过杀伤、细胞因子分泌和对与表达同源配体(cd19)和pdl1的靶细胞共培养的增殖反应来评估分隔shp2的功能后果。
[0666]
实施例5—“肽-标签”连接的结合剂的概念验证实验
[0667]
为了证明kdel驱动的tcr敲低可以通过双多肽链构建体来介导，转导pbmc以表达直接连接到kdel序列的编码抗tcr_vhh的单个多肽；或两条多肽链：第一条编码与alfa_肽连接的抗tcr_vhh；第二条编码直接连接到kdel序列的抗alfa_肽_vhh(图6a)。这两种多肽通过自切割2a肽分离。作为阴性对照，将atcr_vhh替换为不相关的vhh结合剂。所有构建体都包含用于转导的ires-ebfp标志物。
[0668]
转导四天后，对pbmc进行表面cd3染色并通过流式细胞术进行分析。结果来自如图6b所示的四个独立供体。在表达抗tcr-kdel的细胞或表达抗tcr vhh肽和抗肽vhh-kdel的两条多肽链的细胞中，tcr在细胞表面的表达显著降低。在表达不相关的vhh肽和抗肽vhh-kdel的两条多肽链的细胞中没有观察到细胞表面tcr表达的显著降低。这表明肽-标签连接的结合剂可与抗肽kdel一起使用以阻断靶蛋白如tcr的细胞表面表达。类似的方法可用于阻断或减少两种或多种蛋白质的表面表达，其通过使用具有不同靶标结合结构域但肽相同的肽-标签连接的结合剂。通过相同的抗肽结合kdel(即相同的定位多肽)将两种或所有此类肽-标签连接的结合剂(即靶标结合多肽)保留在细胞内区室中。
[0669]
以上说明书中提到的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，要求保护的本发明不应过度限于这些具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。