花生启动子及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种花生启动子及其应用。


背景技术：

2.在基因表达中，启动子是其中重要的元件之一，根据来源不同，启动子分为来源于宿主之外的外源性启动子和来源于宿主自身的内源性启动子。目前花生转基因中用到的启动子主要是外源启动子，如花椰菜花叶病毒启动子35s启动子。然而，外源启动子由于不属于宿主本身，因此，在用于稳定转基因是常出现效率低下，且传代时间长之后容易出现丢失或被甲基化的现象。
3.植物基因工程中常用的启动子有源于t-dna的nos，ocs，mas；源于病毒的camv19s、camv35s；源于植物的ubi-1，act-1，phal-1等。其中，泛素启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的ubi-1启动子、水稻泛素rubq2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素ubb1启动子、烟草泛素ubi-u4启动子、马铃薯泛素ubi7启动子、番茄泛素ubi1-1启动子，大麦泛素mub1启动子。玉米泛素ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中。其次，水稻泛素rubq2启动子在水稻和甘蔗中也得到较多的应用。
4.目前，适用于花生的内源强启动子还未见报道。因此，开发适合花生转基因使用的内源强启动子是进一步发展花生转基因技术的基础，对花生基因编辑以及育种有极其重大的意义。现有的花生内源性启动子，多为组织特异性启动子，而类似泛素启动子这类具有广谱性表达的启动子还未见有相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种花生启动子及其应用，以解决现有技术中花生转基因应用中缺少具有广谱性表达的内源启动子的问题。
6.为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种花生启动子。该花生启动子包括(a)花生内源启动子pahubq4，pahubq4具有seq id no：1所示的核苷酸序列；或(b)包括(a)中的核苷酸序列的花生启动子；或(c)与(a)中的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的花生启动子。
7.为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种重组载体，该重组载体包含上述花生启动子。
8.为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有上述重组载体。
9.进一步地，宿主细胞包括大肠杆菌或农杆菌。
10.为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种转化方法，该转化方法包括利用上述宿主细胞，向目标植物中转化外源基因，外源基因位于重组载体上。
11.进一步地，目标植物包括花生或本氏烟草。
12.进一步地，转化方法为瞬时转化方法，对于花生的瞬时转化方法包括：将花生的种子在暗处培养生长15天，获得黄花苗；培养农杆菌后在侵染液中重悬，28℃静置0.5～2h，形成农杆菌菌液；将黄花苗的上、下胚轴分别切成茎圆片，将茎圆片置于农杆菌菌液中侵染；将茎圆片置于培养皿中培养，获得基因瞬时转化的花生；优选地，茎圆片的厚度为0.5～2mm；优选地，侵染的时间为0.5～2h；优选地，将茎圆片置于含有湿润滤纸的培养皿中培养。
13.进一步地，侵染液包括含有20μg/l乙酰丁香酮的ms液体培养液；优选地，农杆菌包括gv3101、lba4404、eha105或agl1。
14.进一步地，转化方法为瞬时转化方法，对于本氏烟草的瞬时转化方法包括：培养农杆菌后在侵染液中重悬，28℃静置0.5～2h，形成农杆菌菌液；将农杆菌菌液注射入本氏烟草的叶背，获得基因瞬时转化的本氏烟草；优选地，侵染液包括含有20μg/l乙酰丁香酮的ms液体培养液；优选地，农杆菌包括gv3101、lba4404、eha105或agl1。
15.为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种上述花生启动子、重组载体、宿主细胞、或者转化方法在植物遗传转化和/或育种中的应用。
16.应用本发明的技术方案，利用花生内源启动子pahubq4或其同源基因，或含有该启动子的重组载体、宿主细胞，能够在花生中大量表达外源基因。
附图说明
17.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
18.图1示出了根据本发明实施例1的18个花生泛素基因在花生发育过程15个组织中表达量的示意图。
19.图2示出了根据本发明实施例1的pahubq4启动子及周围序列的琼脂糖凝胶电泳图。
20.图3示出了根据本发明实施例2和对比例1的gus组织化学染色结果。
21.图4示出了根据本发明实施例2和对比例1的gus基因在烟草叶片中表达量的示意图。
22.图5示出了根据本发明实施例2和对比例1的gus基因在花生茎圆片中表达量的示意图。
具体实施方式
23.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
24.术语解释：
25.启动子是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如trna启动子)位于转录起始点的下游,这些dna序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。
26.如背景技术所提到的，目前适用于花生的内源强启动子还未见报道。因此，开发适
合花生转基因使用的内源强启动子是进一步发展花生转基因技术的基础，对花生基因编辑以及育种有极其重大的意义。
27.因而，在本技术中发明人尝试，以花生tifrunner基因组数据为参考，鉴定花生泛素基因，进一步分析其在多个组织中的表达量，找到在多组织中，组成型强表达的泛素基因。进一步，克隆其atg上游971bp启动子片段pahubq4，连接到启动gus标记的载体上，用于转基因。比较其与2x35s的启动子启动强度，证明pahubq4是来源于花生的内源强启动子，可以用于后期转基因。因而提出了本技术的一系列保护方案。
28.在本技术第一种典型的实施方式中，提供了一种花生启动子，包括(a)花生内源启动子pahubq4，pahubq4具有seq id no：1所示的核苷酸序列；或(b)包括(a)中的核苷酸序列的花生启动子；或(c)与(a)中的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的花生启动子。
29.seq id no：1：tcagctgccgattaatggacagtggatcccaccgtgataataaaatctataaaagcccacttgtctatttttttattttgatttttgatttggtataccgtatacccctttctcagcccacttgccaattactacaacttgtgtgggcccaaatattatgttaaggatccacttataataagataacatctattaccacaaaaaaagagataataacaccgtggcggtcaatacgagaagagcgtttgcgtggtttgttgtttgtttgtgatggggaggtctgaggtgccttaactccaaccaacgccttccaatttccaacccttcacgtctggccaaacattgccgtgtctatagtgtcaattgacacctcaaccgtacacgtgtcgcaaactgataaggtaaatggtcaccctctttctgttgcgtaaataaggcggacacctctttatgctataaaggaacctccagaccccattgtttcttcacaattctcattttcattctctctttgttgtccgaaatccttcaaggtaccttcctcctctttctctttgcttttgattctggttccctttagttacatctgtagggttttggcatttcttcttaatcaccaatattatcggttttagattcgttatattatgtcttttgttgcctcgttccttggaaattttctctagatctgtttatactgcaatgatttatgatatttaattgttaaatctgatcggttttgatcacgcttttaaactgcaatttttagttgctttctgaaagatcgaaggcctttgtttcggatcgtaaattttctgaaaaaatctgagatcaattgtaccaattttgattataggttttttttttttttccgttgttgatcctgattcatctgtttatgacgatgcgaattttaatgtacgtttccttaactagtttcttatttaattgttgttaacgatgatgcagat。
30.上述花生内源启动子pahubq4具有seq id no：1所示的核苷酸序列，其中包括核心启动子、上游启动子元件、rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列等关键元件。在pahubq4的核苷酸序列的5’端和/或3’端增加核苷酸，获得新的核苷酸序列，新的核苷酸序列包括seq id no：1所示的核苷酸序列，也具有相同或相近的启动子活性，能够作为花生启动子而使用。对于花生启动子而言，对pahubq4的核苷酸序列进行非关键元件位置的核苷酸进行替换、插入、删除等更改，获得的核苷酸序列仍具有相同或相近的启动子活性，同样能够作为花生启动子而使用。即与pahubq4的核苷酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列，其关键元件等核苷酸序列与(a)中提供的pahubq4大概率相同，也能够作为花生启动子。
31.本技术在花生基因组中鉴定了所有的泛素基因，并利用公共转录组数据库，探究花生中所有泛素基因在15个不同组织部位的表达量差异，即相应的泛素启动子的启动能力的差异。克隆了高表达的泛素基因的启动子序列，即pahubq4，并将其应用于花生中。
32.在实际探究中，虽然花生的基因组已公开，但对于花生的泛素基因，大多只停留在
预测其为花生泛素基因。本技术通过与拟南芥泛素基因进行对比和blast查找，准确度更高，不容易遗漏，并对所有泛素基因进行克隆验证，真正鉴定了花生中所有的泛素基因，克服了真核生物基因组中存在大量内含子，易影响基因预测结果，导致后续试验产生偏差的问题。
33.相较于原核生物，真核生物的启动子区域较长，结构复杂，甚至有可能存在于目标基因的下游。因此对于真核生物基因的启动子，难以通过简单的预测而获得启动子的位置，必须进行实际的克隆和后续转录验证，才能确定启动子的功能。
34.在本技术第二种典型的实施方式中，提供了一种重组载体，该重组载体包含上述花生启动子。
35.上述重组载体中包括上述的花生启动子，该重组载体可以为不包含目的基因的空载体，也可以为插入了待表达的目的基因的重组载体。在重组载体上、花生启动子的下游，可以存在有想要表达的基因片段。花生启动子能够活化rna聚合酶，促进下游的基因片段大量转录、表达。利用现有技术中常见的酶切连接、同源重组等方法，能够在空载体中插入目的基因，构建能够大量转录、表达目的基因的重组载体。重组载体(包括空载体)上，可以根据需求，灵活选择多种元件，如复制起始位点、多克隆位点、翻译控制信号、抗性基因或选择标记等多种元件。
36.在本技术第三种典型的实施方式中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有上述重组载体。在一种优选的实施例中，宿主细胞包括大肠杆菌或农杆菌。
37.上述宿主细胞中转化有重组载体，可以携带重组载体进行如重组载体拷贝、基因表达、基因整合到染色体等多种作用。宿主细胞可以为大肠杆菌、根瘤农杆菌等多种菌株，其中大肠杆菌可以为常用的dh5α，根瘤农杆菌可以为常用的、实施例中使用的gv3101。
38.在本技术第四种典型的实施方式中，提供了一种转化方法，该转化方法包括利用上述宿主细胞，向目标植物中转化外源基因，外源基因位于重组载体上。
39.利用上述转化方法，能够向目标植物中转化入携带有外源基因的重组载体，该重组载体上有花生启动子，能够促进外源基因的转录、表达。
40.在一种优选的实施例中，目标植物包括花生或本氏烟草。
41.通过向目标植物中转化入携带有外源基因的重组载体，能够在花生、本氏烟草等植物中，表达外源基因。通过选用现有技术中的不同的重组载体和转化方法，能够使外源基因目标植物中以游离质粒的形式存在和表达，也能够通过同源重组等方法将目的基因整合到目的植物的染色体上，获得外源基因能够稳定遗传的转基因植物。
42.在一种优选的实施例中，转化方法为瞬时转化方法，对于花生的瞬时转化方法包括：将花生的种子在暗处培养生长15天，获得黄花苗；培养农杆菌后在侵染液中重悬，28℃静置0.5～2h，形成农杆菌菌液；将黄花苗的上、下胚轴分别切成茎圆片，将茎圆片置于农杆菌菌液中侵染；将茎圆片置于培养皿中培养，获得基因瞬时转化的花生；优选地，茎圆片的厚度为0.5～2mm；优选地，侵染的时间为0.5～2h；优选地，将茎圆片置于含有湿润滤纸的培养皿中培养。
43.在一种优选的实施例中，侵染液包括含有20μg/l乙酰丁香酮的ms液体培养液；优选地，农杆菌包括gv3101、lba4404、eha105或agl1。
44.利用上述瞬时转化方法，能够向花生中转化入携带有外源基因的重组载体，获得
基因瞬时转化的花生。由于使用的启动子为来源于花生本身的内源启动子，或与该内源启动子具有较高同源性的启动子，能够克服外源启动子存在的效率低下，传代时间长之后遗传不稳定、容易出现丢失，或容易被甲基化的问题。且该花生启动子的启动强度高，能够在多组织中高效表达基因。
45.在一种优选的实施例中，转化方法为瞬时转化方法，对于本氏烟草的瞬时转化方法包括：培养农杆菌后在侵染液中重悬，28℃静置0.5～2h，形成农杆菌菌液；将农杆菌菌液注射入本氏烟草的叶背，获得基因瞬时转化的本氏烟草；优选地，侵染液包括含有20μg/l乙酰丁香酮的ms液体培养液；优选地，农杆菌包括gv3101、lba4404、eha105或agl1。
46.利用该启动子，能够在本氏烟草中大量表达外源基因，扩展了能够在本氏烟草中使用的启动子序列。在实际应用中，能够与在花生中进行探究的所构建的分子生物学元件通用，大大降低了工作量和工作成本。也解决了在不同植物中使用不同启动子而导致基因表达量存在差异的问题。
47.在本技术第五种典型的实施方式中，提供了一种上述花生启动子、重组载体、宿主细胞、或者转化方法在植物遗传转化和/或育种中的应用。
48.下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本技术的有益效果。
49.实施例1 pahubq4启动子的获取
50.1.花生泛素基因的鉴定以及表达量的分析
51.从https://www.peanutbase.org/home下载栽培花生arachis hypogaea cv.tifrunner(编号cv-93,pi 644011)的基因组数据。在tair(https://www.arabidopsis.org/)下载已报道的拟南芥atubq10(at4g05320)的蛋白质序列为参考序列，通过blastp检索花生基因组蛋白质序列库，获取候选花生泛素基因序列，获得的花生泛素基因使用cdd保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)确认，共得到18个花生泛素基因。
52.从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/prjna291488下载栽培花生arachis hypogaea cv.tifrunner发育过程15个组织(叶、根、花、未入土果针、入土后果针、初膨大荚果、初膨大荚果的空中果柄、3期荚果、5期果壳、5期种子、6期果壳、6期种子、7期种子、8期种子、10期种子)的转录组数据。荚果的时期命名由pattee1974建立。在转录组数据寻找花生18个泛素基因在15个组织中的表达量数据，定位到一个ahubq4基因，其在15个组织中组成高表达(如图1所示)。
53.2.花生ahubq4基因的启动子的克隆
54.采用ctab法提取栽培花生arachis hypogaea cv.tifrunner的dna，基于栽培花生arachis hypogaea cv.tifrunner基因组序列，以栽培花生arachis hypogaea cv.tifrunner的dna为模版，设计引物pahubq4-f：tcagctgccgattaatggaca(seq id no：3)和引物pahubq4-r：gggtcttcacaaagatttgcat(seq id no：4)以扩增目标启动子序列及周围序列共计991bp：
55.seq id no：2：tcagctgccgattaatggacagtggatcccaccgtgataataaaatctataaaagcccacttgtctatttttttatt ttgatttttgatttggtataccgtatacccctttctcagcccacttgccaattactacaacttgtgtgggcccaaatattatgttaaggatccacttataataagataacatctattaccacaaaaaaagagataataacaccgtggcggtcaatacgagaagagcgtttgcgtggtttgttgtttgtttgtgatggggaggtctg
aggtgccttaactccaaccaacgccttccaatttccaacccttcacgtctggccaaacattgccgtgtctatagtgtcaattgacacctcaaccgtacacgtgtcgcaaactgataaggtaaatggtcaccctctttctgttgcgtaaataaggcggacacctctttatgctataaaggaacctccagaccccattgtttcttcacaattctcattttcattctctctttgttgtccgaaatccttcaaggtaccttcctcctctttctctttgcttttgattctggttccctttagttacatctgtagggttttggcatttcttcttaatcaccaatattatcggttttagattcgttatattatgtcttttgttgcctcgttccttggaaattttctctagatctgtttatactgcaatgatttatgatatttaattgttaaatctgatcggttttgatcacgcttttaaactgcaatttttagttgctttctgaaagatcgaaggcctttgtttcggatcgtaaattttctgaaaaaatctgagatcaattgtaccaattttgattataggttttttttttttttccgttgttgatcctgattcatctgtttatgacgatgcgaattttaatgtacgtttccttaactagtttcttatttaattgttgttaacgatgatgcagatgcaaatctttgtgaagaccc。
56.pcr扩增采用高保真酶(takara r045a)，50μl体系：primestar max premix 25μl，pahubq4-f(10μm)和pahubq4-r(10μm)各2μl，dna模版200ng，补足ddh2o至50μl。pcr程序为：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s，35个循环。pcr产物用1％琼脂糖胶电泳，胶回收目的条带(如图2所示)。
57.实施例2
58.1.pcambia1381-pahubq4-gus载体的构建
59.采用同源重组的方法构建目的载体。使用引物pahubq4-42bp-ingus-f：tgggcccggcgcgccgaattccctcagctgccgattaatgga(seq id no：5)和引物pahubq4-42bp-ingus-r：tcgacggatccccgggaattcatctgcatcatcgttaacaac(seq id no：6)，以上一步胶回收的目的条带为模版扩增，pcr体系和程序与上述一致。pcr产物用1％琼脂糖胶电泳，胶回收目的条带，此时条带为带有同源臂的pcr产物。
60.采用ecori-hf
tm
(neb)酶切质粒pcambia1381-gus，酶切体系为：酶切buffer 3μl，ecori-hf
tm
酶1μl，质粒500ng，补足ddh2o至30μl。37℃，2小时，1％琼脂糖胶电泳，胶回收酶切后的线性片段。采用诺唯赞同源重组酶(c112)构建pcambia1381-pahubq4-gus载体，反应体系为：线性化载体2μl，插入片段2μl，5
×
ce ii buffer 2μl，exnase ii 1μl，补足ddh2o至10μl。37℃反应30min，置于冰上冷却。取2μl重组产物，采用热激法转化大肠杆菌dh5α(全式金，cd201-01)，挑取单克隆扩繁，测序正确的阳性克隆添加甘油至终浓度25％后置于-80℃保存。在同源重组过程中，插入片段的原料为目标启动子序列及周围序列共计991bp(seq id no：2)，同源重组构建质粒过程中去掉了3’末端的部分cds序列，真正连在载体上是971bp的pahubq4(seq id no：1)。
61.2.农杆菌介导的本氏烟草和花生茎圆片的瞬时转化
62.取农杆菌gv3101感受态细胞于冰上，待融化后加入2μl pcambia1381-pahubq4-gus载体，混匀，冰浴5min，液氮5min，37℃ 5min。加入500μl lb液体培养基，28℃，200rpm培养2小时。离心后涂布于含利福平(25mg/l)，链霉素(25mg/l)以及卡那霉素(50mg/l)的lb培养基上，28℃培养48小时。挑取单克隆扩繁，采用引物pahubq4-f：tcagctgccgattaatggaca(seq id no：3)和gus-seq-r：tggcacagcaattgcccg(seq id no：7)菌落pcr验证，阳性克隆添加甘油至终浓度25％后置于-80℃保存。
63.用含有pcambia1381-pahubq4-gus表达载体的gv3101农杆菌菌株，采用注射法瞬时侵染本氏烟草叶片，以pcambia1381-2
×
35s-gus为对照。gv3101农杆菌1:200接种于lb液
体培养基中(含有利福平以及卡那霉素)，28℃，200rpm过夜培养。5000rpm离心10min收集菌株，ms液体培养液清洗两遍，侵染液(含有20μg/l乙酰丁香酮的ms液体培养液)重悬菌体，28℃静置1小时后待用。
64.本氏烟草瞬时转化：将重悬好的上述农杆菌菌液注射入烟草叶片叶背，遮光24h，光下培养24h后取叶片，一份待gus染色，一份-80℃保存。
65.花生茎圆片的瞬时转化：将花生暗中生长15天的黄花苗上、下胚轴分别切成1mm左右厚度的茎圆片，放置于重悬好的含有pcambia1381-pahubq4-gus表达载体的gv3101农杆菌菌液，侵染1h，置于含有湿润滤纸的培养皿中暗培养48h后取材，一份待gus染色，一份-80℃保存。
66.3.gus组织化学染色
67.将侵染后的烟草叶片切片(5mm左右宽度)，花生茎圆片以及阴性对照材料加入gus染色液(gus染色试剂盒，coolaber，sl7160)中，于25-37℃保温5-8小时。随后，100％乙醇脱色转入70％乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。染色结果参见图3。
68.4.qrt-pcr计算外源基因表达量
69.使用takara minibest plant rna extraction kit(takara，9769)提取侵染后的烟草叶片，花生茎圆片以及阴性对照材料的rna，primescript
tm
rt master mix(takara，rr036)反转录为cdna。使用primer3(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计外源gus基因特异性引物为：gus-qf：ctgatagcgcgtgacaaaaa(seq id no：8)；gus-qr：ggcacagcacatcaaagaga(seq id no：9)。烟草内参基因引物为：ntl25-qf：cccctcaccacagagtctgc(seq id no：10)；ntl25-qr：aagggtgttgttgtcctcaatctt(seq id no：11)。花生内参基因引物为：ahelf1b-qf：aagcttccctggcaaagctcaa(seq id no：12)；ahelf1b-qr：ttcctcagctgccttcttatcc(seq id no：13)。用tbfast qpcr mix(takara，rr430)在abi 7500实时pcr系统中进行反应。反应体系为20μl，反应条件为：初始变性设定为95℃ 5min，热循环设定为95℃ 30s，60℃ 10s，共40个循环。输出的原始结果，通过excel 2010采用2^-delta delta ct法计算外源gus基因相对表达量，spss 2019对数据进行分析，参见图4和5。
70.对比例1
71.构建pcambia1381-2
×
35s-gus重组载体，利用农杆菌瞬时转化入本氏烟草和花生茎圆片，进行gus组织化学染色和qrt-pcr计算外源基因表达量，参见图4和5，实验方法同实施例2。
72.图4中，nt为不含有质粒的烟草叶片(阴性对照)，nt-48h 2
×
35s为转化入pcambia1381-2
×
35s-gus的烟草叶片，nt-48h pahubq4为转化入pcambia1381-pahubq4-gus的烟草叶片。
73.图5中，ah为不含有质粒的花生茎圆片(阴性对照)，ah-48h 2
×
35s为转化入pcambia1381-2
×
35s-gus的花生茎圆片，ah48h pahubq4为转化入pcambia1381-pahubq4-gus的花生茎圆片。
74.35s是强启动子，2
×
35s是更强的启动子。因此在花生中pahubq4启动子的表达量略低于不如2
×
35s是正常的。而且统计分析显示pahubq4启动子和2
×
35s启动子的介导gus基因的表达量，在花生和烟草中均是没有显著差异的(p《0.05)，因此可以认为pahubq4启动
子的启动效率是和2
×
35s相当的。pahubq4启动子作为首次发现的花生内源广谱性表达的启动子，在后续植物遗传转化、育种等领域中具有重要的应用价值。
75.从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明从花生中发现了花生内源的强启动子，解决了现有技术中花生转基因应用中缺少具有广谱性表达的内源启动子的问题。利用该花生内源启动子pahubq4或其同源基因，或含有该启动子的重组载体、宿主细胞，能够在花生中大量表达外源基因。
76.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。