高效扩增人流感病毒的方法和试剂与流程

1.本发明属于病毒学领域，更具体地，本发明涉及高效扩增人流感病毒的的方法和试剂。


背景技术：

2.流感病毒属正粘液病毒科，流感病毒属包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。甲型流感病毒根据h和n抗原不同，又分为许多亚型，h可分为15个亚型(h1～h15)，n有9个亚型(n1～n9)。其中仅h1n1、h2n2、h3n2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为h5、h7和h9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。具有高致病性的h5n1、h7n7、h9n2等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。与以前面发现的毒株相比，如果在血凝素分子特异性抗原决定簇(抗原表位)上发生了突变，新的毒株被认为是先前毒株的异种变异类型，具有流行病学意义，可以造成流感的流行。流感的传播途径以空气飞沫传播为主，其次是通过病毒污染的茶具、食具、毛巾等间接传播，密切接触也是传播流感的途径之一。
3.流感病毒给人类造成的损失不仅仅是超额的死亡率，更涉及到各种形式的直接或间接的经济损失。目前公认的预防流感的最佳方法是接种流感疫苗。对大多数国家和地区而言，安全有效的灭活疫苗一直是预防流感的基础。流感疫苗已成为当今受人重视的、销售额最大的疫苗品种之一。这就需要大量地、高效地培养流感病毒，以备于疫苗的制备。
4.与传统的鸡胚生产工艺相比，基于细胞培养技术的生产工艺在流感大流行时可实现快速大规模培养，以应对鸡胚供应不足的问题，因此逐渐成为主流生产方式。近年来，随着各类流行传染病的爆发，流感疫苗的需求也日益增加。
5.但是，本领域现有细胞培养生产工艺产能仍相对低下，提高流感病毒在细胞中的扩增效率迫在眉睫。相对于鸡胚法和其它细胞基质来生产流感病毒，mdck细胞悬浮培养技术应运而生，这一技术中培养液的运用是保证细胞生长和病毒复制的核心之一。然而，目前在流感病毒生产阶段，使用的病毒维持培养液大多和细胞生长阶段所用的细胞生长培养液是同一款，引起病毒复制所需营养物质需求的不足，最终影响病毒在细胞内的扩增效率，导致病毒产量低下。因此有必要针对流感病毒复制的特性，来设计更高效率地扩增流感病毒的维持培养液。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种高效扩增人流感病毒的的方法和试剂。
7.在本发明的第一方面，提供一种用于扩增流感病毒的方法，所述方法包括：(1)提
供流感病毒生产细胞，其培养于基本培养液中；(2)提供含有添加物的无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠；(3)将(2)的培养液加入(1)的病毒生产细胞的基本培养液中；以流感病毒感染所述病毒生产细胞，培养细胞，生产流感病毒。
8.在一种或多种实施方式中，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/l，且所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：5～80mg/l。
9.在一种或多种实施方式中，(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/l。
10.在一种或多种实施方式中，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/l，较佳地为30～120mg/l，更佳地为40～100mg/l；且，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：10～60mg/l，较佳地为20～50mg/l。
11.在一种或多种实施方式中，(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/l，较佳地为30～120mg/l，更佳地为40～100mg/l。
12.在一种或多种实施方式中，(a)或(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量例如为：28mg/l、48mg/l、58mg/l、68mg/l、78mg/l、88mg/l、100mg/l、150mg/l等。
13.在一种或多种实施方式中，(a)中，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量例如为：8、18、28、38、48、58、68mg/l等。
14.在一种或多种实施方式中，所述的无血清维持培养液包括选自：xeno-sfm维持培养液，xeno-cdm维持培养液，ex-cell培养液。
15.在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒生产细胞为非人哺乳动物细胞；较佳地为mdck细胞；较佳地，(1)中所述的细胞培养液为mdck细胞培养液。
16.在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒为人流感病毒；较佳地，所述的流感病毒为甲型流感病毒；较佳地，所述甲型流感病毒根据h抗原和n抗原的不同，h选自h1～h15，n选自n1～n9；更佳地，所述甲型流感病毒包括选自：h1n1病毒、h9n2病毒、h5n1病毒、h7n9病毒。
17.在一种或多种实施方式中，(3)中，将(2)的培养液加入(1)的流感病毒生产细胞的培养液中时，所述(2)的培养液与所述(1)的流感病毒生产细胞的细胞培养液的比例为1:0.5～1:2.5，较佳地为1:0.9～1:2.2，更佳地为1:0.9～1:1.5。
18.在一种或多种实施方式中，(3)中，以流感病毒感染所述病毒生产细胞时，moi＝0.001～0.1，更佳地moi＝0.005～0.05(进一步优选约0.01)。
19.在一种或多种实施方式中，(3)中，所述的培养为悬浮培养。
20.在一种或多种实施方式中，所述(2)的培养液与所述(1)的病毒生产细胞的培养液的比例例如为：1:0.95，1:1，1:1.2，1:1.3等。
21.在一种或多种实施方式中，以流感病毒感染所述病毒生产细胞后，添加tpck-胰酶；较佳地，所述tpck-胰酶为终浓度为5
±
3μg/ml，较佳地5
±
2μg/ml，更佳地5
±
1μg/ml的tpck-胰酶。
22.在本发明的另一方面，提供一种生产流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：以前面任一所述的方法扩增流感病毒；将获得的流感病毒进行灭活、减毒或从所获得的流感病毒中分离抗原，加工获得具有免疫原性的流感病毒疫苗。
23.在一种或多种实施方式中，步骤(3)后获得的病毒，还可进行病毒的传代，也即可
进行新一轮的细胞感染和扩增。
24.在本发明的另一方面，提供一种制备用于扩增流感病毒的无血清维持培养液的方法，包括：将添加物添加于无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠。
25.在一种或多种实施方式中，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/l，且所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：5～80mg/l。
26.在一种或多种实施方式中，(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/l。
27.在本发明的另一方面，提供一种用于扩增流感病毒的试剂盒(kit)，其中包括：前面所述方法制备的无血清维持培养液。
28.在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括：流感病毒生产细胞，流感病毒生产细胞的细胞培养液；其中所述流感病毒生产细胞独立于所述培养液或被培养于所述培养液。
29.在一种或多种实施方式中，所述的无血清维持培养液包括选自：xeno-sfm维持培养液，xeno-cdm维持培养液。
30.在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒生产细胞为mdck细胞；较佳地，(i)中所述的细胞培养液为mdck细胞培养液。
31.在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中，所述含有添加物的无血清维持培养液与所述流感病毒生产细胞的培养液的比例为1:0.5～1:2.5，较佳地为1:0.9～1:2.2，更佳地为1:0.9～1:1.5。
32.在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于扩增流感病毒。
33.在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒为人流感病毒。
34.在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒为甲型流感病毒。
35.在一种或多种实施方式中，所述甲型流感病毒根据h抗原和n抗原的不同，h选自h1～h15，n选自n1～n9。
36.在一种或多种实施方式中，所述甲型流感病毒包括选自：h1n1病毒、h9n2病毒、h5n1病毒、h7n9病毒。
37.在一种或多种实施方式中，所述病毒包括：建系保存的病毒、原代分离的病毒或分离自个体(例如患者)的病毒。
38.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
39.图1、在xeno-sfm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h1n1流感病毒的结果。
40.图2、在xeno-sfm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h9n2流感病毒的结果。
41.图3、在xeno-cdm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h1n1流感病毒的结果。
42.图4、在xeno-cdm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h9n2流感病毒的结果。
43.图5、在xeno-sfm维持培养液中添加50mg/l丁酸钠和不同浓度的半乳糖，培养h1n1流感病毒的结果。
44.图6、在xeno-sfm维持培养液中添加50mg/l丁酸钠和不同浓度的半乳糖，培养h9n2流感病毒的结果。
具体实施方式
45.本发明人致力于提高流感病毒的培养和增殖效率，针对流感病毒复制的特性，经由广泛的筛选工作，提出了可应用于更高效率地扩增流感病毒的改良型维持培养液以及培养方法。所述培养液以及方法所需的操作条件简单，短期内可获得高滴度的病毒，成本低廉且安全稳定。
46.如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“病毒生产细胞”是指适用于进行流感病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养液找中培养，感染流感病毒后，可为流感病毒提供适当的组装环境。所述的细胞较佳地为非人哺乳动物细胞，更佳地为mdck细胞。
47.如本文所用，所述的“基本培养液”是指使病毒生产细胞常规生长的培养液，本发明中将之用于病毒感染前常规培养细胞的用途。本领域中对病毒生产细胞已经开发了商品化的基本培养液，更具体如driving-m培养液或与之类似的培养液。
48.如本文所用，所述的“无血清维持培养液”是指用于病毒感染和扩繁是培养细胞的培养液。
49.如本文所用，“传代”通常包括：使流感病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。
50.如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
51.如本文所用，所述的“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”y的组合物可完全无y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
52.培养方法
53.本发明公开了用于扩增流感病毒的方法，包括：(1)提供流感病毒生产细胞，其培养于细胞培养液中；(2)提供含有添加物的无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠；和，(3)将(2)的培养液加入(1)的病毒生产细胞的培养液中；以流感病毒感染所述病毒生产细胞，培养细胞，生产流感病毒。
54.所述病毒生产细胞的举例例如包括：肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。更具体地例如：犬细胞系，如包括cldk和mdck细胞系；仓鼠细胞系，如包括bhk21或hkcc细胞系；猴细胞系，如包括非洲绿猴细胞(例如肾细胞vero细胞系)。
55.本发明中，所述病毒生产细胞优选不是人细胞系。在一些优选方式中，不运用人细胞或与人近缘的动物的细胞，可避免此类细胞因潜在地存在其它人源病毒而导致的流感病毒的污染。在一些优选方案中，所述的病毒生产细胞不是vero细胞系(猴肾细胞系)。一些细胞系的列举例如：mdck，vero，293t，cho，cldk，hkcc，bhk，mrc5，per.c6，frhl2，wi-38。
56.作为本发明的优选方式，采用的病毒生产细胞为犬细胞系，如mdck细胞系(马-达二氏犬肾细胞系)。mdck细胞可为病毒提供良好的复制环境，但造成污染的可能性相对低。相对于鸡胚法和其他细胞基质来生产流感病毒，mdck细胞无血清悬浮培养因生产工艺操作简单，不添加血清，更易实现流感疫苗的大规模生产。
57.适用于本发明的培养的流感病毒可以是已经建系的病毒，也可以是原代分离的病毒，生物体(例如患者)分离的病毒。流感病毒可分离自呼吸分泌物，包括但不限于：直接抽吸物，漱口水，鼻腔洗涤液，鼻腔拭子，咽管拭子，咽部拭子等。这些样品通常从疑似被流感病毒感染的患者获取，包括患有新型流感病毒株的患者。
58.流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。作为本发明的优选方式，所述的流感病毒为人流感病毒。作为本发明的优选方式，所述的流感病毒为甲型流感病毒。甲型流感病毒根据h抗原和n抗原的不同，h选自h1～h15，n选自n1～n9。
59.本发明人发现，本发明的方法对于甲型流感病毒h1n1病毒、h9n2病毒的促进扩增的作用是尤为显著的，这在本发明的实施例中具有详细的实例说明。
60.病毒可以感染于贴壁培养或悬浮培养的细胞上并实现扩增，也可使用微载体培养细胞。作为本发的优选方式，使用悬浮培养的方式培养流感病毒生产细胞。作为本发的优选方式，使用无血清悬浮培养的方式(没有来自人或动物来源的血清添加剂)培养流感病毒生产细胞。
61.mdck细胞易悬浮培养，对不同型和亚型的流感病毒均有良好的敏感性，从而其适宜用于流感病毒的扩增。
62.本发明的方法中，可运用商品化无血清培养液，在其基础上加入关键性添加物来促进病毒的扩增。所述的商品化无血清培养液包括：无血清培养液xeno-cdm或无血清培养液xeno-sfm。xeno-sfm维持培养液：获自倍谙基生物科技有限公司，商品名为xeno
tm-s001s，货号为fg0100403。xeno-cdm维持培养液：获自倍谙基生物科技有限公司，商品名为xeno
tm-cd001s，货号为fg0104103。
63.本发明人也发现，本发明的方法中，添加物的添加量对于病毒扩增的促进作用是尤为关键的。当丁酸钠和半乳糖组合使用时，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/l，较佳地为30～120mg/l，更佳地为40～100mg/l；且，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：10～60mg/l，更佳地为20～50mg/l。当丁酸钠单独应用时，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/l，较佳地为30～120mg/l，更佳地为40～100mg/l。比较显然的是，所述添加物的应用并非越多越好，适合的量是成功实现病毒高效扩增的关键。
64.从扩增时间而言，例如可以是接种病毒(病毒感染)后的0.5～6天，1～5天，1.5～4天，1.5～3.5天等收获病毒。具体地如1天、2天、3天、4天或5天等。作为本发明的优选方式，扩增的时间为1.5～4天，较佳地1.5～3.5天，更佳地2～3天。
65.可通过多种方法由含病毒的液体收获病毒颗粒。纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
66.此外，本发明的方法所获得的流感病毒可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。
67.培养液及试剂盒(kit)
68.在基于mdck细胞无血清悬浮培养生产流感病毒工艺的各个关键操作因素中，培养
液的开发和优化是保证细胞生长和病毒复制的核心之一。流感病毒利用宿主细胞和培养液中的各个原料物质合成复制扩增所需的病毒遗传物质、蛋白质、脂类以及其他必需物质等，因此培养液也是流感疫苗生产阶段的关键因素之一。目前在流感病毒生产阶段，使用的病毒维持培养液大多和细胞生长阶段所用的细胞生长培养液是同一款，引起病毒复制所需营养物质需求的不足，最终影响病毒在细胞内的扩增效率，导致病毒产量低下，而本发明改变了这一现状，提供了优化的培养方案。
69.本发明提供了可高效扩增人流感病毒的维持培养液。包括在商业化维持培养液中加入丁酸钠或丁酸钠和半乳糖组合，用于病毒扩增。与未加丁酸钠或丁酸钠/半乳糖组合的培养液相比，在不同的流感病毒亚型病毒中，使用添加了丁酸钠的维持培养液可获得最高1.5-2倍的病毒产量提升，使用了添加丁酸钠和半乳糖组合的维持培养液可获得最高2-3倍的病毒产量提升，有效克服了目前基于mdck细胞培养的流感病毒扩增效率低下问题，且对不同型或亚型的流感病毒均有提高病毒产量的效果。
70.在未添加所述添加物前，所述的流感病毒生产细胞被培养于基本培养液(基本培养液)中。应理解，适用于本发明所用的细胞的基本细胞培养液可以是本领域技术人员熟知的培养液。例如，mdck细胞作为一种已知的细胞，适用的培养液也是本领域已知的。因此，基本培养液可不限于本发明中所举例的。
71.本发明的研究显示，适当浓度的丁酸钠的添加，通过提高细胞的代谢，使更多的葡萄糖和谷氨酰胺进入三羧酸循环，以提高相关营养物的代谢速率和利用效率，其本身亦可转变为tca循环和脂质合成的前体乙酰辅酶a，故能加速tca循环和脂质合成。此外，丁酸钠又可以改变细胞的生理状态，一方面调控细胞周期，使更多细胞处于g0/g1期，因处于g0/g1期的细胞表面唾液酸含量更多，更利于细胞的吸附感染；另一方面延缓细胞衰老和凋亡，使细胞有充足时间利用胞内资源进行增殖，从而提高流感病毒产量。
72.本发明的研究也显示，适当浓度的半乳糖的添加也可改变细胞代谢，可刺激谷氨酰胺的吸收，合成流感病毒复制所需能源物质；此外，半乳糖为病毒蛋白糖基化合成的关键原料，病毒蛋白糖基化会影响病毒的毒力，从而影响子代病毒的增殖情况。
73.因此，适当浓度的丁酸钠和半乳糖可改变细胞代谢、细胞生理状态及提供物质原料；而且，更为重要且令人惊讶的是，这些改变恰好能够与流感病毒的复制有效配合，提高流感病毒在胞内的复制效率，从而提高病毒产量。
74.在本发明的优选实施例中，维持培养液包括在两款商业化无血清培养液(xeno-cdm和xeno-sfm)中加入20～200mg/l的丁酸钠，在病毒感染前以1:1～1:2比例(维持培养液：原培养液)加入到细胞培养液中，稀释细胞密度的同时增加培养体积，增加病毒扩增所需营养物质并稀释培养液中代谢副产物，用于扩增不同亚型的h1n1和h9n2流感病毒。后以moi＝0.01加入相应的h1n1或h9n2流感病毒，并添加终浓度为5μg/ml的tpck-胰酶，每隔24h检测培养液中的ha滴度变化。
75.在本发明的优选实施例中，使用添加丁酸钠的xeno-sfm和xeno-cdm维持培养液分别可获得h1n1亚型最高512hau/50μl和192hau/50μl的ha滴度，获得h9n2亚型最高1024hau/50μl和512hau/50μl的ha滴度。与未加丁酸钠的维持培养液相比，针对不同亚型流感病毒，使用添加了丁酸钠的维持培养液可获得1.5-2倍的病毒产量提升。其中，hau为凝集单位(hemagglutinating unit)。
76.在本发明的优选实施例中，使用添加了适当量丁酸钠和适当量半乳糖组合的xeno-sfm维持培养液可获得h1n1亚型最高1024hau/50μl的ha滴度，获得h9n2亚型最高1536hau/50μl的ha滴度。与未加丁酸钠/半乳糖组合的维持培养液相比，针对不同亚型流感病毒，使用添加丁酸钠和半乳糖组合的维持培养液可获得2-3倍的病毒产量提升。
77.本发明还提供了一种试剂盒(kit)，其中含有本发明所述的含有添加物的无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠。较佳地，所述试剂盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在生产中的应用。
78.应用
79.本发明制备的病毒可被应用于制备流感病毒疫苗。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、“分裂”病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。流感抗原也可以病毒体形式出现。制造任意这些类型的疫苗时都可应用本发明的方法制备的病毒。
80.采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、分裂病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。用于灭活病毒的化学方式包括使用有效量的一种或多种以下试剂进行处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(c60)、二乙胺(binaryethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或它们的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如uv射线或γ射线辐射。
81.另一种形式的灭活流感抗原是病毒体。病毒体可通过用去污剂增溶流感病毒，然后去除核壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括：加入病毒膜糖蛋白至磷脂过量，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
82.流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。
83.ha是灭活流感疫苗中的主要免疫原，一般通过srid检测参考ha水平使疫苗剂量标准化。
84.活病毒例如通过以下方法制备疫苗：培养病毒，然后从含病毒颗粒的流体纯化病毒颗粒。例如，所述流体可通过离心分离并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。
85.作为一种形式，用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通x-100、曲通n101、溴化十六烷基三甲铵、tergitolnp9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。
86.纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。
87.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
88.为了促进流感病毒的培养效率，本发明人进行了深入研究筛选。基于多种多样的化学物质以及生物生长因子等，本发明人进行了大量的实验分析，结果显示丁酸钠以及半
乳糖对于促进流感病毒的培养效率具有显著的效果。以下实施例对所述优选的化合物的功能用进行阐述。
89.实施例1、丁酸钠对于流感病毒扩增的促进作用
90.本实施例中，以含有不同浓度的丁酸钠的维持培养液进行流感病毒的扩增实验，观测丁酸钠的作用。
91.1、实验设置
92.病毒生产细胞：mdck细胞，感染病毒前其被培养于driving-m培养液。
93.driving-m培养液配制方法如下：
94.(1)称取最终培养基配制体积100％的注射用水至培养基配制容器中水温应控制在28-32℃。
95.(2)准确称取22.21g/l的干粉(driving-m干粉)，加入至配制容器中，充分搅拌20-30分钟。
96.(3)使用5mol/l的氢氧化钠溶液缓慢滴加至步骤(2)所配制溶液中，将其ph值调整至6.2-6.7，充分搅拌10-20分钟。
97.(4)准确称取2.00g/l的碳酸氢钠粉末加入至配制容器中，充分搅拌10-20分钟。
98.(5)经0.22μm孔径的无菌滤膜对培养基溶液进行无菌过滤。
99.xeno-sfm维持培养液：获自倍谙基生物科技有限公司，商品名为xeno
tm-s001s，货号为fg0100403。
100.xeno-cdm维持培养液：获自倍谙基生物科技有限公司，商品名为xeno
tm-cd001s，货号为fg0104103。
101.按照配制方法配制含有不同浓度0～400mg/l丁酸钠的xeno-sfm和xeno-cdm维持培养液，在病毒感染时刻在培养液中加入等体积维持培养液，使mdck细胞密度稀释至一半。
102.以moi为0.01加入h9n2或h1n1流感病毒和终浓度为5μg/ml的tpck胰酶，在33℃进行病毒培养。
103.2、实验数据与结果
104.(1)xeno-sfm维持培养液培养h1n1
105.在xeno-sfm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h1n1流感病毒的结果如表1和图1所示，hpi为接种后小时数(hours post-inoculation)。
106.表1
[0107][0108]
根据表1以及图1，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，添加48mg/l至200mg/l的丁酸钠可以显著地促进病毒的扩增，其中当添加48mg/l至100mg/l的丁酸钠时相对理想，维持较长时间高病毒滴度；当运用78-100mg/l左右用量的丁酸钠时，需扩增较短的时间(如48h左右)即收获病毒、而无需更长时间(如72h左右)。同时，过高浓度的丁酸钠的添加则反
而抑制病毒的扩增。
[0109]
(2)xeno-sfm维持培养液培养h9n2
[0110]
在xeno-sfm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h9n2流感病毒的结果如表2和图2所示。
[0111]
表2
[0112][0113]
根据表2以及图2，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，添加48mg/l至100mg/l的丁酸钠可以显著地促进病毒的扩增，其中当添加约48-100mg/l丁酸钠时的促进作用相对理想，维持较长时间高病毒滴度；当运用48-100mg/l左右用量的丁酸钠时，需扩增较短的时间(如48h左右)即收获病毒、扩增更长时间(如72h左右)时尽管能基本维持较高的病毒滴度但可能导致滴度的降低。同时，过高浓度的丁酸钠的添加则反而抑制病毒的扩增。
[0114]
(3)xeno-cdm维持培养液培养h1n1
[0115]
在xeno-cdm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h1n1流感病毒的结果如表3和图3所示。
[0116]
表3
[0117][0118]
根据表3以及图3，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，添加48mg/l至88mg/l的丁酸钠可以促进病毒的扩增，以48-58mg/l时相对理想。同时，过高浓度的丁酸钠的添加则反而抑制病毒的扩增。
[0119]
(4)xeno-cdm维持培养液培养h9n2
[0120]
在xeno-cdm维持培养液中添加不同浓度的丁酸钠，培养h9n2流感病毒的结果如表4和图4所示。
[0121]
表4
[0122][0123]
根据表4以及图4，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，添加48mg/l至100mg/l的
丁酸钠可以促进病毒的扩增。同时，过高浓度的丁酸钠的添加则反而抑制病毒的扩增。
[0124]
3、总结
[0125]
根据本实施例的上述结果，使用添加了0～400mg/l丁酸钠的xeno-sfm维持培养液，在约48～100mg/l丁酸钠浓度范围内的流感病毒滴度有所提升。在培养至72小时的时候，不添加丁酸钠组的h1n1和h9n2的对照ha滴度为256hau/50μl和512hau/50μl，添加了48～100mg/l丁酸钠的xeno-sfm最高则可获得512hau/50μl和1024hau/50μl的ha滴度，可得到约2倍的产量提升。
[0126]
使用添加了0～400mg/l丁酸钠的xeno-cdm维持培养液，发现也在48～100mg/l丁酸钠浓度范围内的流感病毒滴度可以有所提升。在培养至72小时的时候，不添加丁酸钠组的h1n1和h9n2的对照ha滴度为128hau/50μl和256hau/50μl，添加了48～100mg/l丁酸钠的xeno-cdm最高则可获得192hau/50μl和512hau/50μl的ha滴度，分别可得到1.5倍和2倍的产量提升。
[0127]
本实施例的结果也表明，丁酸钠的适当浓度的应用时较为关键的，过高浓度反而不利于病毒的扩增。
[0128]
实施例2、半乳糖联合丁酸钠对于流感病毒扩增的促进作用
[0129]
发明人的研究结果也表明，对于不同类型的商业培养液或病毒，丁酸钠对病毒扩增的促进作用仍呈现一定程度的不稳定性或局限性，进一步寻找有用的促进其效应的物质的探寻也是必要的。
[0130]
本实施例中，以含有丁酸钠和不同浓度半乳糖组合的维持培养液进行流感病毒的扩增实验，观测半乳糖联合丁酸钠对于流感病毒扩增的促进作用。
[0131]
1、实验设置
[0132]
按照配制方法配制含有50mg/l丁酸钠和不同浓度0～80mg/l半乳糖的xeno-sfm维持培养液，在病毒感染时刻在培养液中加入等体积维持培养液，使细胞密度稀释至一半。
[0133]
以moi为0.01加入h9n2或h1n1流感病毒和终浓度为5μg/ml的tpck胰酶，在33℃进行病毒培养。
[0134]
2、实验数据与结果
[0135]
(1)xeno-sfm维持培养液培养h1n1
[0136]
在xeno-sfm维持培养液中添加50mg/l丁酸钠和不同浓度和不同浓度的半乳糖，培养h1n1流感病毒的结果如表5和图5所示。
[0137]
表5
[0138][0139]
根据表5以及图5，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，半乳糖配合丁酸钠的联合添加(尤其在28-48mg/l)，使得h1n1流感病毒在不同时间段的扩增结果均有显著的增加，
适当浓度的半乳糖的增效作用非常明显。
[0140]
(2)xeno-sfm维持培养液培养h9n2
[0141]
在xeno-sfm维持培养液中添加50mg/l丁酸钠和不同浓度和不同浓度的半乳糖，培养h9n2流感病毒的结果如表6和图6所示。
[0142]
表6
[0143][0144]
根据表6以及图6，与仅仅利用商品化的维持培养液相比，半乳糖配合丁酸钠的联合添加(尤其在28-48mg/l)，使得h9n2流感病毒在不同时间段的扩增结果均有显著的增加，适当浓度的半乳糖的增效作用非常明显。
[0145]
3、总结
[0146]
本实施例的结果显示，适当浓度的丁酸钠和适当浓度的半乳糖组合添加可以在单独添加丁酸钠的基础上进一步提升流感病毒产量。其中，72小时的时候，无添加物组的h1n1和h9n2的对照ha滴度为256hau/50μl和512hau/50μl，添加了50mg/l丁酸钠和28～48mg/l半乳糖的xeno-sfm最高则可获得1024hau/50μl和1536hau/50μl的ha滴度，分别得到了2倍和3倍的产量提升。本实施例的结果充分支持适当浓度的半乳糖的增效作用非常明显。
[0147]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。