一种生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱分析方法与流程

1.本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及一种生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱分析方法。


背景技术：

2.小柴胡胶囊是由柴胡、黄芩、甘草、党参、大枣、生姜、姜半夏七味药材通过煎煮、渗漉、浓缩等工艺制成的复方制剂，可用于外感病，邪犯少阳证，症见寒热往来、胸胁苦满、食欲不振、心烦喜呕、口苦咽干等。小柴胡胶囊的中间体包括生姜和姜半夏等两味药材的渗漉液，柴胡、黄芩、甘草、党参、大枣等五味药材混煎液，以及多种浓缩液。
3.国际公认的药品“质量源于设计”理念，认为药品质量控制重心应该从成品前移至原料、中间体和制药过程。所以对小柴胡胶囊生产中间体的质量控制应该受到重视。但是目前对于小柴胡胶囊质控的研究仅限于制剂成品和药材，对中间体的质控方法研究未见报道。
4.近年来，从药材到饮片到中间体再到制剂的量值传递研究广泛用于中药经典名方和配方颗粒的开发。通过观察指标成分从药材到饮片到中间体再到制剂的数量变化，就可以确定中间体的质量标准，也可以从监管的角度防止非法添加。为了测定指标成分的量值传递规律，就有必要建立中间体中指标成分的分析方法。该分析方法同样也可以用于制药过程控制等。相比制剂，中间体的化学成分有时会简单一些，此时可以考虑采用相对较容易实现的分析条件。
5.生姜和姜半夏的渗漉液是小柴胡胶囊的重要中间体。根据2020版《中国药典》(一部)，该中间体由生姜和姜半夏混合投料，再用70％乙醇浸渍24小时后，缓慢渗漉制得。目前也未见有文献报道该中间体的质量分析方法。
6.本发明拟开发体现生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱检测方法，通过增强生姜和姜半夏渗漉液中间体品质控制，为进一步提高小柴胡胶囊产品质量一致性打好基础。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的是提供一种生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱分析方法，该方法可以本发明方法能弥补小柴胡胶囊生产中间体化学成分检测方法的缺失，从而更加全面地检测并评价生姜姜半夏渗漉液的质量，有利于提高小柴胡胶囊生产中间体的质量控制水平。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.本发明的目的之一：提供一种生姜姜半夏渗漉液成分的定量指纹图谱分析方法，所述的生姜姜半夏渗漉液是生姜和姜半夏用70％乙醇作溶剂，浸渍24小时后，缓缓渗漉，收集得到的渗漉液。所述的指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
10.(1)对照品混合溶液以及供试品溶液的制备：
11.对照品混合溶液的制备：精密称定尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷对照品，置于容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇匀，制成含12.5μg/ml尿苷、23.9μg/ml腺嘌呤、51.5μg/ml 5-羟甲基糠醛、21.5μg/ml鸟苷组成的混合对照品溶液。
12.供试品溶液的制备：量取生姜姜半夏渗漉液1.5ml，35℃下离心浓缩至干，加入1.0ml纯水复溶后，12000rpm离心10min，取上清液，即得。
13.(2)高效液相色谱测定
14.将步骤(1)中的对照品混合溶液和供试品溶液注入液相色谱分析测定，仪器为：agilent 1100高效液相色谱系统(美国安捷伦科技公司)，配制脱气器(g1322a)、四元泵(g1311a)、自动进样器(g1313a)、柱温箱(g1316a)、二极管阵列检测器(dad g1315b)及agilent色谱工作站(chemstation b.04.03版)；色谱条件为：waters atlantis t3色谱柱(100mm
×
2.1mm，3.0μm)；流动相a为纯水，流动相b为乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～7min，流动相b的体积分数为0％；7～15min，流动相b的体积分数变化为0～10％；15～16min，流动相b的体积分数变化为10～12％；16～20min，流动相b的体积分数变化为12～25％；20～21min，流动相b的体积分数变化为25～95％；21～26min，流动相b的体积分数为95％；流量：0.30ml/min；柱温：25℃；检测波长：260nm～262nm，进样体积为3μl～5μl。
15.(3)建立定量指纹图谱并进行质量评价
16.取10个不同批次生姜姜半夏渗漉液按照步骤(1)方法制备得到10个不同批次的供试品溶液，按照步骤(2)进行高效液相色谱分析，记录色谱图；根据10个不同批次的色谱图，以不同批次共有的色谱峰确定共有峰，生成对照指纹图谱。同时通过建立的指纹图谱相似度和测定的4种成分含量对生姜姜半夏渗漉液进行质量评价。
17.优选的，步骤(2)中的检测波长为260nm，在该检测波长下，色谱峰分离较好，基线较为平稳，峰面积较大响应较好。
18.优选的，步骤(2)中的进样体积为3μl，在该进样体积下，峰面积较大响应较好。
19.优选的，步骤(3)中的定量检测指标为：尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷。在本发明的检测条件下，上述四种成分可以充分分离。
20.优选的，步骤(3)中的共有峰数量为14。
21.本发明的目的之二：提供一种生姜和姜半夏渗漉液中化学成分的含量测定方法。
22.色谱条件如下：仪器：agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱：waters atlantis t3色谱柱(100mm
×
2.1mm，3.0μm)；流动相a为纯水，流动相b为乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～7min，流动相b的体积分数为0％；7～15min，流动相b的体积分数变化为0～10％；15～16min，流动相b的体积分数变化为10～12％；16～20min，流动相b的体积分数变化为12～25％；20～21min，流动相b的体积分数变化为25～95％；21～26min，流动相b的体积分数为95％；流量：0.30ml/min；柱温：25℃；检测波长：260nm～262nm，进样体积为3～5μl。
23.精密称定尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷对照品适量，分别加纯水稀释成不同浓度的溶液，注入高效液相色谱进行分析，以各个化合物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，计算不同批次样品中的指标成分含量。
24.本发明的目的之三：提供一种生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱分析方法在生姜姜半夏渗漉液质量控制中的应用。
25.将10个批次的生姜姜半夏渗漉液的供试品溶液的色谱图导入“中药色谱指纹图谱
相似度评价系统”(国家药典委员会2012版)，生成对照指纹图谱，将不同批次的生姜姜半夏渗漉液的图谱导入相似度评价软件，计算相似度。
26.本发明的有益效果为：
27.本发明选择尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷作为对照品进行定量检测，可实现对生姜和姜半夏渗漉液中间体品质控制。本发明首次建立了生姜姜半夏渗漉液中部分强极性成分的定量指纹图谱，所述的定量指纹图谱可以弥补目前小柴胡胶囊生产中间体化学成分检测方法的缺失，从而可以更加全面地检测并评价姜半夏和生姜渗漉液的质量，有利于提高生产中间体的质量控制水平。其中，尿苷能控制能量平衡和体温调节，是小柴胡胶囊解表退热功效的药效成分之一。鸟苷通过增强巨噬细胞的释放调节免疫功能，腺嘌呤能促进白细胞增生，均为小柴胡胶囊治疗外感病的药效成分。且姜半夏中含有较多尿苷、腺嘌呤、鸟苷等成分。因此，检测生姜和姜半夏渗漉液中尿苷、腺嘌呤、鸟苷这三种成分是有必要的，可以进一步用于小柴胡胶囊的量值传递分析。
28.2020版《中国药典》(一部)规定姜半夏的炮制方法是半夏与生姜汤、明矾共煮透，该法是加热炮制的。但市面上也有其他炮制方法是整个过程不受热的。比如，矾腌姜汁拌法是用半夏与白矾粉、姜汁常温下先后拌匀的方法。因为不同炮制方法中受热情况不同，所以按照药典方法炮制所得姜半夏中糖类成分降解产生的5-羟甲基糠醛的量会较多。检测生姜和姜半夏渗漉液中5-羟甲基糠醛含量可以简单判断出姜半夏炮制过程是否受热，进而推断姜半夏的炮制方法。且5-羟甲基糠醛能通过抑制多个通路的相关蛋白发挥抗炎作用，具有药理活性。所以有必要检测渗漉液中5-羟甲基糠醛含量。
附图说明
29.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，不构成对于本发明的不当限定。
30.图1不同批次生姜姜半夏渗漉液hplc指纹图谱。
31.图2生姜和姜半夏渗漉液的hplc对照图谱。
32.图3混合对照品和生姜姜半夏渗漉液的图谱。
具体实施方式
33.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
35.1实验仪器与材料
36.1.1仪器
37.agilent 1100高效液相色谱系统(美国安捷伦科技公司)，配制脱气器(g1322a)、四元泵(g1311a)、自动进样器(g1313a)、柱温箱(g1316a)、二极管阵列检测器(dad g1315b)及agilent色谱工作站(chemstation b.04.03版)。电子天平(ab204-n，mettler toledo公
司)。小型高速离心机(ab204-n，mettler toledo公司)。指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2012版)。
38.1.2试剂
39.乙腈、甲醇(色谱纯，德国merck公司)，无水乙醇(批号：20200710，永华化学股份有限公司)，水为mili-q超纯水。
40.尿苷对照品(尿嘧啶核苷，纯度≥99％，sigma公司，批号：slcb8621)，腺嘌呤对照品(纯度≥99％，sigma公司，批号：wxbd1877v)，5-羟甲基糠醛对照品(纯度＞98％，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：170910)，鸟苷对照品(鸟嘌呤核苷，纯度≥98％，sigma公司，批号：bccb9660)。不同批次的生姜购自菜市场或者超市。3批次姜半夏分别购自江苏承开中药有限公司、保和堂(亳州)制药有限公司和嘉兴东方国药饮片股份有限公司，批号分别为210203、c0131210031和210501。
41.2实验条件
42.2.1色谱条件
43.waters atlantis t3色谱柱(100mm
×
2.1mm，3μm)；使用乙腈(b)-水(a)流动相体系，采用梯度洗脱。洗脱条件为：0～7min，流动相b的体积分数为0％；7～15min，流动相b的体积分数变化为0～10％；15～16min，流动相b的体积分数变化为10～12％；16～20min，流动相b的体积分数变化为12～25％；20～21min，流动相b的体积分数变化为25～95％；21～26min，流动相b的体积分数为95％。走完每一针，用100％纯水运行14min以平衡色谱柱。流量：0.30ml/min；柱温：25℃；检测波长：260nm，进样体积为3μl。
44.2.2对照品混合溶液的制备
45.对照品混合溶液的制备：精密称定尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷对照品，置于容量瓶中，用纯水溶液定容至刻度，摇匀，制成含12.5μg/ml尿苷、23.9μg/ml腺嘌呤、51.5μg/ml 5-羟甲基糠醛、21.5μg/ml鸟苷的混合对照品溶液。吸取对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
46.2.3供试品溶液的制备
47.姜半夏、生姜用70％乙醇作溶剂，浸渍24小时后，缓缓渗漉，收集渗漉液。量取生姜姜半夏渗漉液1.5ml，35℃离心浓缩至干，加入1.0ml纯水复溶，12000rpm离心10min后取上清液进样分析。吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
48.3指纹图谱研究方法学考察
49.指纹图谱的方法学验证主要包括进样精密度、重复性和样品稳定性考察。
50.3.1进样精密度试验
51.取同一份供试品溶液，连续进样6次。以11号峰尿苷为对照峰，分别计算各共有峰与参照峰的保留时间与峰面积的比值，得到各共有峰相对保留时间见表1，相对峰面积见表2。各共有峰的相对保留时间rsd在0.06％～0.17％、相对峰面积rsd在1.00％～4.13％，表明仪器精密度良好。
52.表1精密度试验所得相对保留时间
[0053][0054]
表2精密度试验所得相对峰面积
[0055][0056]
3.2方法重复性试验
[0057]
取六份平行制备的供试品溶液，分别进样分析。以11号峰尿苷为对照峰，分别计算各共有峰与参照峰的保留时间与峰面积的比值，得到各共有峰相对保留时间见表3，相对峰面积见表4。各共有峰的相对保留时间rsd在0.07％～0.30％、相对峰面积rsd在0.13％～3.69％，表明方法重复性良好。
[0058]
表3重复性试验所得相对保留时间
[0059][0060]
表4重复性试验所得相对峰面积
[0061][0062]
3.3样品稳定性试验
[0063]
取同一份供试品溶液，于0，3，6，9，12，18，24h进样分析，以11号峰尿苷为对照峰，分别计算各共有峰与参照峰的保留时间与峰面积的比值，得到各共有峰相对保留时间见表5，相对峰面积见表6。各共有峰的相对保留时间rsd在0.13％～0.93％、相对峰面积rsd在0.91％～4.01％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0064]
表5稳定性试验所得相对保留时间
[0065][0066][0067]
表6稳定性试验所得相对峰面积
[0068][0069]
4生姜姜半夏渗漉液指纹图谱的建立及应用示例
[0070]
将不同批次生姜姜半夏渗漉液样品、同批次渗漉液的不同渗漉时间点样品hplc图，按同一方法积分后，以aia格式分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”软件。进行色谱峰匹配，均以s1为参照图谱，用中位数法，时间窗宽度为0.1。多点校正，进行mark峰匹配。生成不同批次生姜姜半夏渗漉hplc指纹图谱及其对照图谱，分别见图1和图2。
[0071]
4.1共有峰的标定
[0072]
渗漉液样品共标定14个共有峰，经对照品比对指认渗漉样品中7个成分。其中，3、5、6、8、10、11、14号峰分别为鸟嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、尿苷和腺苷。选择保留时间适中且峰面积较稳定、与相邻色谱峰分离良好、基线稳定的11号峰(尿苷)为参照峰。
[0073]
4.2生姜姜半夏渗漉液相似度评价及应用示例
[0074]
应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”分别将10批次渗漉液样品导入并计算指纹图谱相似度。指纹图谱相似度结果见表7，相似度在0.937～0.984之间，说明不同批次生姜和姜半夏渗漉液间的化合物含量差异较小。
[0075]
表7指纹图谱相似度
[0076][0077]
若企业将指纹图谱相似度的内控标准设为不低于0.90。现制备得到一新批次的生姜姜半夏渗漉液，制备样品并检测得到指纹图谱。计算指纹图谱相似度，发现为0.888，低于内控标准。那么认为该批次渗漉液质量与正常批次渗漉液质量相差较大，不建议放行继续后续生产。
[0078]
5含量测定方法学验证
[0079]
渗漉液中核苷类成分含量测定的色谱条件和该指纹图谱的色谱方法相同，含量测定的方法学验证包括各含量测定成分的线性范围、精密度、稳定性和加样回收实验的考察。选取中间体的图谱响应较高的4种成分(尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛和鸟苷)进行含量测定，混合对照品和生姜姜半夏渗漉液的图谱见图3。
[0080]
5.1线性和范围考察
[0081]
取不同浓度的混合对照品溶液，分别进样3μl分析。以各成分测定的峰面积为纵坐
标，浓度为横坐标制作标准曲线，得到线性回归方程与分析范围。根据峰信噪比约为3:1与10:1时各成分的浓度分别确定检测限与定量限。尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛、鸟苷的回归方程、线性范围以及检测限、定量限结果见表8。
[0082]
表8姜半夏成分标准曲线及线性范围
[0083][0084]
5.2进样精密度、重复性和稳定性试验
[0085]
进样精密度实验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，计算得到各成分峰面积的rsd值。重复性实验：取六份平行制备的供试品溶液，分别进样分析，计算得到各成分含量的rsd值。样品稳定性实验：取同一份供试品溶液，于0，3，6，9，12，15，18，21，24h进样分析，计算得到各成分峰面积的rsd值。进样精密度、重复性、稳定性试验结果见表9，其中精密度、重复性、稳定性rsd均小于5％，符合中国药典的要求，说明该方法线性良好，且供试品溶液在24h内稳定。
[0086]
表9姜半夏成分精密度、重复性、样品稳定性
[0087][0088]
5.3加样回收率试验
[0089]
分别取已知含量的样品溶液9份，分为3组，设高中低三个浓度水平，控制对照品加入量与供试品中待测成分量之比分别在1:1.5、1:1.0、1:0.5左右，每种浓度平行制备3份供试品溶液进行测定。精密加入0.8ml供试品溶液与适量对照品溶液，在5ml容量瓶中定容，12000rpm离心10min，取上清液进行进样分析。加样回收实验结果见表10，各成分平均回收率均满足要求，且rsd值均小于5％，证明该优化得到的方法准确可靠，可用于姜半夏、生姜渗漉液中4种强极性成分的含量测定。
[0090]
表10加样回收试验结果
[0091][0092]
5.4含量测定结果及应用示例
[0093]
对姜半夏、生姜渗漉过程中的21个供试品溶液的定量成分含量测定结果见表11。生姜姜半夏渗漉时，其强极性成分(尿苷、腺嘌呤、5-羟甲基糠醛和鸟苷)的浓度随渗漉时间的增加而降低。
[0094]
如果企业以渗漉液中腺嘌呤含量低于1.0μg/ml作为渗漉终点，那么渗漉到509分钟时，检测发现腺嘌呤含量为0.89μg/ml，已经低于1.0μg/ml，可以认为生姜姜半夏的渗漉过程已经达到终点，可以停止渗漉。类似地，对于尿苷、5-羟甲基糠醛和鸟苷也可以设置标准，用于渗漉过程质量控制。
[0095]
表11生姜姜半夏渗漉曲线中21个供试品溶液定量成分含量检测结果
[0096][0097]