瓜氨酸肽及其应用、类风湿关节炎的检测试剂与试剂盒的制作方法

1.本发明涉及类风湿关节炎检测技术领域，具体而言，涉及瓜氨酸肽及其应用、类风湿关节炎的检测试剂与试剂盒。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种最常见的自身免疫性疾病，也是最多发的慢性炎症性关节疾病，全球发病率1％左右，中国发病率为0.32％-0.36％。ra多发于女性，男女比例约为1:2-1:4。它是一种全身性疾病，其特征为关节滑膜出现炎症，炎症对称性的从小关节发展到大关节，最终在疾病后期导致关节损坏，并伴有软组织损伤。
3.环瓜氨酸肽(ccp)抗原起源于1998年，发展到现在共有三代，第一代抗原是由人工合成19个氨基酸残基的含有瓜氨酸的直链型多肽，即瓜氨酸肽，第一代ccp抗原的检测敏感性49％，特异性96％。后来将19肽中的两个丝氨酸替换为半胱氨酸，半胱氨酸之间会形成二硫键，从而形成环瓜氨酸肽，得到第二代ccp抗原(ccp2)。第二代ccp抗原不仅保持了较高的检测特异性(98％)，敏感性也有较大提高(69％)。第三代ccp抗原依然是环瓜氨酸肽，但是在其中增加了不能被anti-ccp2(抗ccp2的抗体)识别的抗原决定簇，检测敏感性略微提高(73％)。
4.目前，抗ccp抗体对ra的检测已普遍用于临床，国内自2001年以来也逐步应用于临床。国内外市场上的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒主要应用酶联免疫吸附法(elisa法)、免疫比浊法和化学发光法。
5.elisa法虽然成本低，但是一般采用手工操作，操作繁琐效率低，且人为影响因素大，结果只能定性或不精确地定量。因此，在这高效率的自动化时代，特异性高、操作简便的全自动化检测方法必将有良好的市场前景。
6.目前国内已有体外诊断试剂公司开发出采用“胶乳增强免疫比浊法”检测的抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒，并已投入临床应用。bizzaro n等检测了ra患者抗ccp抗体的水平，结果显示ra患者清血清中抗ccp抗体的平均水平为1100au/ml(范围为：57～3419au/ml)，而对照组抗ccp抗体的平均水平仅为6.8au/ml(范围为：1～39au/ml)。现有的乳胶增强免疫比浊法，如专利cn 102507918b和cn 104198725b公开的试剂盒检测灵敏度均大于等于1.25au/ml，线性测量范围均在200au/ml以下，均难以满足临床的检测需求。
7.化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏度(检测限度可达10-15
～10-18
mol/l)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。
8.但总体而言，使用现有的环瓜氨酸肽试剂盒检测抗ccp抗体，敏感性和特异性都还需要提高。
9.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种新的瓜氨酸肽及其应用、类风湿关节炎的检测试剂与试剂盒。本发明提供的瓜氨酸肽，其可以作为抗ccp抗体的抗原，检测类风湿关节炎患者的抗ccp抗体，具有敏感性高和特异性强的特点。
11.本发明是这样实现的：
12.第一方面，本发明实施例提供一种瓜氨酸肽，其氨基酸序列如seq id no.1-9中的任意一种所示。
13.本发明提供的如seq id no.1-9所示的瓜氨酸肽通过对序列的合理优化和修饰，在其n端使用2个含氨基侧链的氨基酸修饰如赖氨酸(lys、k)以加大结合位点，同时增加转角氨基酸修饰如甘氨酸(gly、g)增大其作为抗原时的灵活性，通过合理的优化和修饰，可以明显提高瓜氨酸肽在作为抗原检测抗ccp抗体时的敏感性和特异性，为检测类风湿关节炎的检测提供更为可靠的检测结果，也为检测类风湿关节炎的检测提供一种新的选择和检测策略。
14.在可选的实施方式中，上述瓜氨酸肽第4位半胱氨酸残基与第17位的半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
15.相对于直链型结构而言，环状结构的瓜氨酸肽其结合抗ccp抗体时的敏感性和特异性更高，更有利于提高检测结果的可靠性。
16.但需要说明的是，本发明提供的瓜氨酸肽其可以是直链型结构也可以是环状结构，另种结构可以是实现对抗ccp抗体时的检测，均属于本发明的保护范围。
17.第二方面，本发明实施例提供瓜氨酸肽作为类风湿关节炎的抗原在制备类风湿关节炎检测试剂中的应用，上述瓜氨酸肽选自seq id no.1-9中的至少一种。
18.本发明实施例的实验结果显示，seq id no.1-9中的任意一种瓜氨酸肽或者其中的任意组合均可以作为抗ccp抗体的抗原，对抗ccp抗体进行检测，都具有较高的敏感性和特异性。
19.在可选的实施方式中，上述瓜氨酸肽选自如下组合中的任意一种组合：seq id no.1和8的组合、seq id no.2和8的组合、seq id no.1、2和8的组合以及seq id no.1、2、4和8的组合。
20.相较于以单一瓜氨酸肽检测抗ccp抗体，以组合的方式检测抗ccp抗体具有更高的敏感性和特异性，例如以seq id no.1和8的组合、seq id no.2和8的组合、seq id no.1、2和8的组合或seq id no.1、2、4和8的组合作为抗原检测抗ccp抗体，其敏感性和特异性更高。
21.在可选的实施方式中，seq id no.1-9中任意一者所示的瓜氨酸肽的第4位半胱氨酸残基与第17位的半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
22.第三方面，本发明实施例提供一种用于检测类风湿关节炎的抗原，其包括如seq id no.1-9中的任意一种或几种所示的瓜氨酸肽。
23.本发明提供的抗原可以实现对抗ccp抗体进行检测，具有较高的敏感性和特异性。
24.在可选的实施方式中，上述抗原选自如下组合中的任意一种组合：seq id no.1和
8的组合、seq id no.2和8的组合、seq id no.1、2和8的组合以及seq id no.1、2、4和8的组合。
25.在可选的实施方式中，seq id no.1-9中任意一者所示的瓜氨酸肽的第4位半胱氨酸残基与第17位的半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
26.第四方面，本发明实施例提供一种类风湿关节炎的检测试剂，其包括氨基酸序列如seq id no.1-9中的任意一种或几种所示的瓜氨酸肽。
27.本发明提供的检测试剂可以检测样品中的抗ccp抗体，进而检测类风湿关节炎，具有敏感性高，特异性强的特点。
28.在可选的实施方式中，上述瓜氨酸肽以偶联于固相颗粒上的形式存在。
29.在可选的实施方式中，上述固相颗粒为磁珠或乳胶微粒。
30.在可选的实施方式中，上述固相颗粒表面带有修饰基团，上述修饰基团选自如下至少一种：氨基、羧基、甲苯磺酰基和环氧基。
31.在可选的实施方式中，所述磁珠表面修饰有氨基或羧基，所述瓜氨酸肽通过偶联剂偶联于所述磁珠表面。
32.在可选的实施方式中，当所述磁珠表面修饰有羧基时，所述偶联剂选自edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)中的至少一种；当所述磁珠表面修饰有氨基时，所述偶联剂选自smcc(succinimidyl 4-(n-maleimidomethyl)cyclohexane-1-caxboxylate)、sulfo-smcc(sulfosuccinimidyl4-(n-maleimidomethyl)cyclohexane-1-caxboxylate)、smpeg2、smpeg4、smpeg 6、smpeg8、smpeg12、smpeg 24、lc-smcc(琥珀酰亚胺基-[4-(n-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯))、2-it2-iminothiolane hcl)、stat(n-琥珀酰亚胺(乙酰硫基)乙酸盐)和stap(n-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯)中的至少一种。
[0033]
其中，smpeg2/4/6/8/12/24是指带有不同数量聚乙二醇的smcc衍生双功能交联剂。
[0034]
使用smpeg2/4/6/8/12/24、lc-smcc等偶联剂，这些偶联剂具有更长的偶联臂，能够更好地保留瓜氨酸肽的活性，有利于其与抗ccp抗体的结合。
[0035]
第五方面，本发明实施例提供如前述实施方式上述的检测试剂的制备方法，其包括：获得seq id no.1-9中的任意一种或几种所示的瓜氨酸肽。
[0036]
在可选的实施方式中，上述制备方法包括：将获得的上述瓜氨酸肽与固相颗粒混合以使上述瓜氨酸肽偶联至上述固相颗粒上。
[0037]
目前的市场上所采用的环瓜氨酸多肽本身较短，含有-cooh、-nh2、以及-oh等侧链基团的氨基酸不多，因此常规的使用方法是用于elisa，例如欧蒙诊断等。虽然有些产品在多肽一端添加了hqc等序列，但本身的偶联效率并不高。
[0038]
此外环瓜氨酸多肽本身很小，在生化或化学发光平台上偶联胶乳微球或磁珠，虽然经过环化处理来优化抗原抗体的结合能力，但由于空间位阻的影响，与抗体的结合仍受到较大的影响，不少产品会通过间接包被的方式偶联bsa或其他疏水性蛋白来提高结合效率，但工艺复杂，批间差异难以控制，另外引入bsa等动物源性的蛋白，在特异性方面会带来不利影响。
[0039]
而本发明提供的瓜氨酸肽其自身的氨基酸序列具有较多的利于偶联的侧链基团
例如氨基、羟基和羧基，这些侧链基因有利于瓜氨酸肽与固相颗粒的偶联，提高偶联效率，可适用于多种检测方法进行检测。
[0040]
在可选的实施方式中，上述固相颗粒为磁珠或乳胶微粒。
[0041]
在可选的实施方式中，上述固相颗粒表面带有修饰基团，上述修饰基团选自如下至少一种：氨基、羧基、羟基和环氧基。
[0042]
在可选的实施方式中，上述固相颗粒为磁珠，上述磁珠修饰有羧基或氨基。
[0043]
在可选的实施方式中，每mg上述磁珠对应加入5-100μg上述瓜氨酸肽进行混合，更优选为加入20-50μg瓜氨酸肽进行混合。
[0044]
在可选的实施方式中，加入上述瓜氨酸肽后，将得到的混合体系置于15-45℃条件下反应15-300min，更优选为反应30-120min。
[0045]
合适的反应条件有利于提高瓜氨酸肽与磁珠的偶联效率，本发明实施方式中采用上述反应条件可以提高瓜氨酸肽与磁珠的偶联效率，所得偶联磁珠的瓜氨酸肽可以保持较高的抗原活性。
[0046]
在可选的实施方式中，在将上述瓜氨酸肽与上述磁珠混合之前，上述制备方法还包括：活化步骤；
[0047]
上述活化步骤包括：用缓冲液重悬上述磁珠，往重悬液中加入偶联剂进行活化。
[0048]
优选地，当所述磁珠表面修饰有羧基时，所述偶联剂选自edc和nhs中的至少一种；当所述磁珠表面修饰有氨基时，所述偶联剂选自smcc、sulfo-smcc、smpeg2、smpeg4、smpeg 6、smpeg8、smpeg12、smpeg24、lc-smcc、2-it、stat和stap中的至少一种。
[0049]
在可选的实施方式中，所述缓冲液为mes或pbs。
[0050]
mes缓冲液常用于羧基修饰的磁珠活化，pbs用于氨基修饰的磁珠活化。
[0051]
第六方面，本发明实施例提供一种类风湿关节炎的检测试剂盒，其包括前述实施方式所述的瓜氨酸肽、前述实施方式所述的抗原或者前述实施方式所述的检测试剂。
附图说明
[0052]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0053]
图1为本发明实施例15中的羧基磁珠偶联ccp的反应过程示意图。
[0054]
图2为本发明实施例16中的氨基磁珠偶联ccp的反应过程示意图。
具体实施方式
[0055]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0056]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例提供了一种环瓜氨酸肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示，具体序列见表1，第4位半胱氨酸残基与第17位的半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
[0059]
实施例2-9
[0060]
实施例2-9提供的环瓜氨酸肽，其氨基酸序列见表1，第4位半胱氨酸残基与第17位的半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
[0061]
表1实施例1-9提供的环瓜氨酸肽的序列
[0062][0063][0064]
表中：表中序列中cit代表瓜氨酸，序列表中xaa代表瓜氨酸。
[0065]
实施例10
[0066]
本实施例提供的用于检测类风湿关节炎的抗原，其为如seq id no.1-9中的任意一种所示的环瓜氨酸肽。
[0067]
实施例11
[0068]
本实施例提供的用于检测类风湿关节炎的抗原，其为seq id no.1和seq id no.8所示的环瓜氨酸肽的组合。
[0069]
实施例12
[0070]
本实施例提供的用于检测类风湿关节炎的抗原，其为seq id no.2和seq id no.8所示的环瓜氨酸肽的组合。
[0071]
实施例13
[0072]
本实施例提供的用于检测类风湿关节炎的抗原，其为seq id no.1、2和8所示的环瓜氨酸肽的组合。
[0073]
实施例14
[0074]
本实施例提供的用于检测类风湿关节炎的抗原，其为seq id no.1、2、4和8所示的环瓜氨酸肽的组合。
[0075]
实施例15
[0076]
本实施例提供了检测类风湿关节炎的检测试剂，其包括如seq id no.1-9所示的环瓜氨酸肽，其中，每种环瓜氨酸肽通过偶联剂edc偶联在经羧基修饰的磁珠上。
[0077]
本实施例还提供该检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0078]
(1)将seq id no.1-9中的任意一种环瓜氨酸肽用1
×
pbs进行透析；
[0079]
(2)用0.1m mes ph5.5重悬羧基修饰的磁珠，加入edc(10mg/mg固相颗粒)和nhs(10mg/mg固相颗粒)活化，25℃反应1h，得到活化的羧基磁珠；
[0080]
(3)将活化后的羧基磁珠进行磁分离器分离，将透析后环瓜氨酸肽，以20ug/mg比例(每mg羧基磁珠对应20ug环瓜氨酸肽)与活化后的羧基磁珠进行混合，置于25℃反应2h。偶联反应的过程可参考图1。
[0081]
(4)将反应物用磁分离器分离，即得到本实施例的检测类风湿关节炎的检测试剂。使用时，用磁珠试剂缓冲液将磁珠稀释，作为工作液。
[0082]
实施例16
[0083]
本实施例提供了检测类风湿关节炎的检测试剂，其包括如seq id no.1-9所示的环瓜氨酸肽，其中，每种环瓜氨酸肽通过偶联剂smpeg8和2-it偶联在经氨基修饰的磁珠上。
[0084]
本实施例还提供该检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0085]
(1)将seq id no.1-9中的任意一种环瓜氨酸肽用1
×
pbs进行透析；
[0086]
(2)用1
×
pbs进行重悬氨基修饰的磁珠，加带有交联臂的偶联剂smpeg2活化磁珠后，再加入和2-it进行活化，25℃反应30min，得到活化的氨基磁珠；
[0087]
(3)将活化后的磁珠进行磁分离器分离，然后加入步骤(1)选取的一种环瓜氨酸肽，以20ug/mg的比例和活化后的氨基磁珠进行混合，25℃反应2h；偶联反应的过程可参考图2。
[0088]
(4)将反应物用磁分离器分离，即得到本实施例的检测类风湿关节炎的检测试剂；使用时，用磁珠试剂缓冲液将磁珠稀释，作为工作液。
[0089]
实验例1
[0090]
检测实施例15和实施例16提供的检测试剂中的环瓜氨酸肽的活性，并设置对照环瓜氨酸肽，对照环瓜氨酸肽的序列相较于seq id no.1-9而言，不具有n端的kkg序列；对照环瓜氨酸肽采用与实施例15类似的制备方法将其偶联在羧基磁珠上。
[0091]
检测方法：
[0092]
将上述实施例的免疫固相磁珠颗粒采用间接法进行检测，具体原理及过程：包被有ccp抗原的固相磁珠捕获样本中的对应抗体，磁分离后重复清洗4次，再加入标记有碱性磷酸酶的抗人igg二抗，最终形成磁珠-标记抗原-抗体抗人igg二抗-alp的复合物，磁分离后重复清洗4次，加入底物amppd后催化反应5-6min，仪器光电倍增管收集rlu并转化为数字信号rlu。结果见下表2。表中数值是指相对发光值，该值越高，其活性越高。
[0093]
表2实施例15和16中的采用不同偶联剂偶联的不同环瓜氨酸肽的活性
[0094][0095]
从表2可以看出，相较于未有kkg修饰的瓜氨酸肽序列，本发明实施例提供的环瓜氨酸肽经kkg修饰后，其具有较高的活性，此外，通过不同的偶联剂偶联至磁珠上，其依然具有较高的活性，尤其是采用smpeg24偶联剂偶联，得到的偶联磁珠的环瓜氨酸肽，其活性相较于使用edc偶联的环瓜氨酸肽更高。
[0096]
实验例2
[0097]
检测不同环瓜氨酸肽或其组合的敏感性和特异性
[0098]
样本：医院收集的104份ra样本及342例健康人标本；
[0099]
检测方法：
[0100]
选择实施例16的检测试剂，采用间接法方式检测上述样本，以阴性样本(342健康人标本)的平均相对光强度的2.1倍作为cutoff值，≥cutoff值判定为阳性，低于cutoff值判定为阴性，统计敏感性和特异性结果，结果见下表3。
[0101]
表3
[0102]
环瓜氨酸肽敏感性特异性seq id no：183.7％98.8％seq id no：284.6％99.4％
seq id no：376.0％99.7％seq id no：482.7％99.4％seq id no：570.2％98.2％seq id no：678.8％99.4％seq id no：772.1％99.1％seq id no：884.6％99.7％seq id no：969.2％99.4％seq id no：1 886.5％98.8％seq id no：2 885.6％99.1％seq id no：1 2 892.1％98.8％seq id no：1 2 4 894.6％99.8％
[0103]
敏感性：104份ra样本中检测信号高于cutoff值的样本比例。特异性：342例健康人标本中检测信号低于cutoff值的样本比例。
[0104]
从表3结果看出，采用本发明实施例提供的环瓜氨酸肽无论是单独或以组合方式作为抗ccp抗体的抗原，其相较于未有kkg修改的环瓜氨酸肽而言，检测抗ccp抗体都具有较高的敏感性和特异性，尤其是以seq id no：1 2 4 8的组合来检测时，其敏感性达到了94.6％，特异性达到了99.8％。而采用现有技术检测，其敏感性67％，特异性为95％。可见，相较于现有技术，本发明提供的环瓜氨酸肽显著提高了抗ccp抗体检测的敏感性和特异性。
[0105]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。