一种人蜕膜MDSCs的分离方法

一种人蜕膜mdscs的分离方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人蜕膜mdscs的分离方法。


背景技术：

2.骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，mdscs)是一群能够表达精氨酸酶、诱导型一氧化氮合酶、吲哚胺2，3-二氧化酶、白介素10等免疫调节分子对机体免疫反应发挥负向调节作用的免疫细胞群。bartmann等人报道人蜕膜组织中cd33

hla-dr
neg and cd33

hla-dr
/-具有mdscs所有表征，定义为蜕膜mdscs。蜕膜mdscs作为蜕膜免疫细胞的组成部分之一，对于维持母胎界面免疫耐受微环境和正常妊娠至关重要，其可以通过产生多种免疫调节分子抑制t细胞活化、诱导调节性t细胞分化、抑制nk细胞杀伤活性等发挥其功能。对蜕膜mdscs的研究有利于揭示其在维持母胎免疫耐受、促进胚胎发育中的作用机制，有利于揭示其在流产、先兆子痫、早产和宫内生长迟缓等不良妊娠结局发生发展中调控机制。
3.由于mdscs自身特征，现今没有相应的细胞系用于体外研究。对于其研究，一方面可以通过骨髓细胞体外诱导成mdscs，另一方面可以分选获得原代细胞。因此，获得组织中原代mdscs是研究人源mdscs的基础。目前，蜕膜mdscs的分离提取方法主要采用自动组织单细胞处理器或酶消化法获得单细胞悬液，通过密度梯度离心获得单个核细胞，然后通过流式分选得到蜕膜mdscs，尽管流式分选能够获得高纯度的细胞，但操作复杂，代价高，获得足量的细胞耗时长，污染几率大，且细胞活率较低。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种人蜕膜mdscs的分离方法，该方法通过贴壁方法去除基质细胞和巨噬细胞，使用cd33磁珠分选蜕膜mdscs，整个过程在超净工作台中进行，时间短，大大降低污染几率，得到的细胞数量充足，活性高，能够满足后续实验的要求。
5.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
6.一种人蜕膜mdscs的分离方法，包括如下步骤：
7.(1)蜕膜组织采集：在手术室无菌条件下获取蜕膜组织，经无菌生理盐水清洗组织上的血液后放入1640培养液中，冰上保存，2～3小时内送至实验室；
8.(2)蜕膜组织进一步清洗：在超净工作台中，将蜕膜组织放于含有磷酸盐缓冲液的平皿中，用无菌镊子去掉淤血及混杂的绒毛组织，并用磷酸盐缓冲液冲洗3～4次；
9.(3)剪碎：将蜕膜组织移入新的无菌平皿中，用移液器吸走多余缓冲液，用无菌剪刀剪至0.2-0.5cm3微小颗粒；
10.(4)消化：将剪碎的组织移入离心管中，加入1640培养液，向离心管中加入iv型胶原酶和i型dna酶，放入37℃转速为120～150rpm的摇床中消化1～1.5小时；
11.(5)终止消化、过滤：消化结束后加入等体积的磷酸盐缓冲液，使用细胞筛网过滤
去掉未消化的组织，离心去上清；
12.(6)单个核细胞获得：使用磷酸盐缓冲液重悬细胞，缓慢加入含有等体积ficoll溶液的离心管中，使之形成两层；离心取中间白膜层，加入到新的离心管中，加满磷酸盐缓冲液并混匀，离心去上清；
13.(7)细胞贴壁：使用1640培养液重悬细胞，使用台盼蓝拒染法计数，将细胞以2
×
107/ml的密度加入细胞培养皿中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养1小时；
14.(8)收集未贴壁细胞：收集悬浮细胞，并用磷酸盐缓冲液冲洗培养皿收集贴壁不牢固的细胞，离心去上清；
15.(9)mdscs分离：使用分选液重悬细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，按100ul/ml加入stemcell cd33磁珠，室温孵育10～20min，按100ul/ml加入rapidspheres，混匀室温孵育10～20min；加入分选液至2.5ml，将管置于磁体中，室温10～15min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体；加入分选液至2.5ml，混匀室温孵育15～20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体；加入磷酸盐缓冲液并混匀，离心去上清；
16.(10)流式检测：收集细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，使每管的细胞为1
×
106个，使用7-aad、鼠抗人cd45-apc-cy7抗体和cd33-perp-cy55抗体，室温避光染色20-40min，用pbs洗两次，加入300～500μl pbs混匀细胞，上流式细胞以检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例。
17.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(1)中，1640培养液中含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5～10％胎牛血清。
18.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(3)中，用无菌剪刀剪至0.2-0.5cm3微小颗粒。
19.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(4)中，将剪碎的组织移入50ml离心管中，加入2倍体积的1640培养液，向离心管中加入10mg/ml iv型胶原酶和1mg/ml i型dna酶。
20.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(5)中，磷酸盐缓冲液的温度为0-10℃。
21.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(5)中，使用70μm细胞筛网过滤去掉未消化的组织。
22.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(6)中，ficoll溶液的质量浓度为20％。
23.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(7)中，1640培养液中含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清。
24.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(9)中，使用含1％胎牛血清的分选液重悬细胞。
25.进一步地，如上所述人蜕膜mdscs的分离方法，步骤(10)中，室温避光染色30min。
26.本发明的有益效果是：
27.1、本发明使用较温和的ⅳ型胶原酶进行原代消化分离，与胰酶相比，胶原酶仅对细胞间质有消化作用，避免了胰酶消化时对细胞膜蛋白的破坏作用。消化过程中加入i型dna酶防止dna导致的细胞凝集，且对细胞无损伤。本发明得到的细胞得率高，活性高，细胞
纯度高。
28.2、本发明使用ficoll，通过密度梯度离心进行单个核细胞分离，通过此操作可以有效富集淋巴细胞和单核细胞，也可以有效去掉红细胞，避免使用红细胞裂解液改变渗透压去除红细胞的同时对蜕膜mdscs的损伤。
29.3、本发明分离得到的单个核细胞细胞经过贴壁过程可以去掉大部分上皮细胞、基质细胞和巨噬细胞等贴壁的细胞，降低了后续分选前总细胞数目，减少磁珠的用量，更容易得到高纯度的蜕膜mdscs。
30.4、本发明通过使用cd33磁珠分选获得高纯度的cd33

mdscs，与流式分选相比，磁珠分选可以在短时间内获得大量高纯度的细胞，操作简单，避免长时间操作对细胞活性的影响和污染几率的增加。
31.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为实施例1中上流式细胞仪检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例的结果示意图；
34.图2为实施例2中上流式细胞仪检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例的结果示意图；
35.图3为实施例3中上流式细胞仪检测7-aad-活细胞比例及cd33 细胞比例的结果示意图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例1
38.一种人蜕膜mdscs的分离方法，包括如下步骤：
39.(1)蜕膜组织采集：选取来自烟台市烟台山医院自愿流产早孕期妇女的蜕膜组织，经与流产妇女签署知情同意书，在手术室无菌条件下获取蜕膜组织，经无菌生理盐水清洗组织上的血液后放入含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培养液中，冰上保存，2小时内送至实验室。
40.(2)蜕膜组织清洗：在超净工作台中，将蜕膜组织放于含有磷酸盐缓冲液的平皿中，用无菌镊子去掉淤血及混杂的绒毛组织，并用磷酸盐缓冲液冲洗3次。
41.(3)剪碎：将蜕膜组织移入新的无菌平皿中，用移液器吸走多余缓冲液，用无菌剪刀剪至0.2-0.5cm3微小颗粒，用时30min。
42.(4)消化：将剪碎的组织移入50ml离心管中，加入20ml 1640培养液，向离心管中加入10mg/ml iv型胶原酶和1mg/ml i型dna酶，放入37℃转速为120rpm的摇床中消化1小时。
43.(5)终止消化、过滤：消化结束后加入等体积的冷的磷酸盐缓冲液，使用70μm细胞筛网过滤去掉未消化的组织。1500rpm，10min离心去上清。
44.(6)单个核细胞获得：使用30ml磷酸盐缓冲液重悬细胞，分管缓慢加入含有等体积ficoll溶液的15ml离心管中，使之形成两层。2000rpm，20min离心，取中间白膜层，加入到新的15ml离心管中，加满磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
45.(7)细胞贴壁：使用含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培养液重悬细胞，使用台盼蓝拒染法计数，将细胞以2
×
107/ml的密度加入细胞培养皿中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养1小时。
46.(8)收集未贴壁细胞：收集悬浮细胞，并用磷酸盐缓冲液冲洗培养皿收集贴壁不牢固的细胞，1500rpm，10min离心去上清。
47.(9)mdscs分离：使用含1％胎牛血清的分选液重悬细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，按100ul/ml加入stemcell cd33磁珠，室温孵育15min，按100ul/ml加入rapidspheres，混匀室温孵育20min，加入分选液至2.5ml，将管置于磁体中，室温15min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，加入分选液至2.5ml，混匀室温孵育20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，加入磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
48.(10)流式检测：收集细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，使每管的细胞为1
×
106个，使用7-aad、鼠抗人cd45-apc-cy7抗体和cd33-perp-cy55抗体，室温避光染色30min，用pbs洗两次，加入400μl pbs混匀细胞，上流式细胞以检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例，结果如图1所示。
49.实施例2
50.一种人蜕膜mdscs的分离方法，包括如下步骤：
51.(1)蜕膜组织采集：选取来自烟台市芝罘区妇幼保健院自愿流产早孕期妇女的蜕膜组织，经与流产妇女签署知情同意书，在手术室无菌条件下获取蜕膜组织，经无菌生理盐水清洗组织上的血液后放入含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培养液中，冰上保存，2小时内送至实验室。
52.(2)蜕膜组织清洗：在超净工作台中，将蜕膜组织放于含有磷酸盐缓冲液的平皿中，用无菌镊子去掉淤血及混杂的绒毛组织，并用磷酸盐缓冲液冲洗3次。
53.(3)剪碎：将蜕膜组织移入新的无菌平皿中，用移液器吸走多余缓冲液，用无菌剪刀剪至0.2-0.5cm3微小颗粒，用时30min。
54.(4)消化：将剪碎的组织移入50ml离心管中，加入30ml 1640培养液，向离心管中加入10mg/ml iv型胶原酶和1mg/ml i型dna酶，放入37℃转速为120rpm的摇床中消化1小时。
55.(5)终止消化、过滤：消化结束后加入等体积的冷的磷酸盐缓冲液，使用70μm细胞筛网过滤去掉未消化的组织。1500rpm，10min离心去上清。
56.(6)单个核细胞获得：使用30ml磷酸盐缓冲液重悬细胞，分管缓慢加入含有等体积ficoll溶液的15ml离心管中，使之形成两层。2000rpm，20min离心，取中间白膜层，加入到新的15ml离心管中，加满磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
57.(7)细胞贴壁：使用含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培
养液重悬细胞，使用台盼蓝拒染法计数，将细胞以2
×
107/ml的密度加入细胞培养皿中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养1小时。
58.(8)收集未贴壁细胞：收集悬浮细胞，并用磷酸盐缓冲液冲洗培养皿收集贴壁不牢固的细胞，1500rpm，10min离心去上清。
59.(9)mdscs分离：使用含1％胎牛血清的分选液重悬细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，按100ul/ml加入stemcell cd33磁珠，室温孵育15min，按100ul/ml加入rapidspheres，混匀室温孵育20min，加入分选液至2.5ml，将管置于磁体中，室温15min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，加入分选液至2.5ml，混匀室温孵育20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，加入磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
60.(10)流式检测：收集细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，使每管的细胞为1
×
106个，使用7-aad、鼠抗人cd45-apc-cy7抗体和cd33-perp-cy55抗体，室温避光染色30min，用pbs洗两次，加入450μl pbs混匀细胞，上流式细胞以检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例，结果如图2所示。
61.实施例3
62.一种人蜕膜mdscs的分离方法，包括如下步骤：
63.(1)蜕膜组织采集：选取来自滨州医学院烟台附属医院自愿流产早孕期妇女的蜕膜组织，经与流产妇女签署知情同意书，在手术室无菌条件下获取蜕膜组织，经无菌生理盐水清洗组织上的血液后放入含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培养液中，冰上保存，2小时内送至实验室。
64.(2)蜕膜组织清洗：在超净工作台中，将蜕膜组织放于含有磷酸盐缓冲液的平皿中，用无菌镊子去掉淤血及混杂的绒毛组织，并用冲洗3次。
65.(3)剪碎：将蜕膜组织移入新的无菌平皿中，用移液器吸走多余缓冲液，用无菌剪刀剪至0.2-0.5cm3微小颗粒。
66.(4)消化：将剪碎的组织移入50ml离心管中，加入15ml 1640培养液，向离心管中加入10mg/ml iv型胶原酶和1mg/ml i型dna酶，放入37℃转速为120rpm的摇床中消化1小时。
67.(5)终止消化、过滤：消化结束后加入等体积的冷的磷酸盐缓冲液，使用70μm细胞筛网过滤去掉未消化的组织。1500rpm，10min离心去上清。
68.(6)单个核细胞获得：使用30ml磷酸盐缓冲液重悬细胞，分管缓慢加入含有等体积ficoll溶液的15ml离心管中，使之形成两层。2000rpm，20min离心，取中间白膜层，加入到新的15ml离心管中，加满磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
69.(7)细胞贴壁：使用含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和5％胎牛血清的1640培养液重悬细胞，使用台盼蓝拒染法计数，将细胞以2
×
107/ml的密度加入细胞培养皿中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养1小时。
70.(8)收集未贴壁细胞：收集悬浮细胞，并用磷酸盐缓冲液冲洗培养皿收集贴壁不牢固的细胞，1500rpm，10min离心去上清。
71.(9)mdscs分离：使用含1％胎牛血清的分选液重悬细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，按100ul/ml加入stemcell cd33磁珠，室温孵育20min，按100ul/ml加入rapidspheres，混匀室温孵育20min，加入分选液至2.5ml，将管置于磁体中，室温20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，加入分选液至2.5ml，混匀室温孵育20min，将磁体和管一同倒置，弃掉液体，
加入磷酸盐缓冲液并混匀，1500rpm，10min离心去上清。
72.(10)流式检测：收集细胞，调整细胞浓度至1
×
108/ml，使每管的细胞为1
×
106个，使用7-aad、鼠抗人cd45-apc-cy7抗体和cd33-perp-cy55抗体，室温避光染色30min，用pbs洗两次，加入350μl pbs混匀细胞，上流式细胞以检测7-aad-活细胞比例及cd33

细胞比例，结果如图3所示。
73.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。