一种少层二硫化钼纳米诊疗剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种少层二硫化钼纳米 诊疗剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是临床医学的重大疾病，已经严重威胁人类生命安全，阻碍社会发 展。目前癌症的治疗策略中，化疗和放疗仍然是最常用的治疗手段。可放疗 剧烈的毒副作用与化疗较低的治疗效果已成为癌症病人的主要死亡因素之 一。因而，临床医学迫切地期待着非侵入性或微创治疗方式的发展，以避免 不必要的痛苦体验和传统治疗方案的严重副作用。
[0003][0004]
近年来，声动力治疗(sdt)以其无创、能量衰减小、组织穿透能力强 等优点被广泛应用于临床疾病诊断和治疗；同时光热治疗(ptt)作为一种 有效的癌症治疗方法因其具有疗效明显、毒副作用小等特点，而备受关注。 而单一的治疗手段都有不同程度的副作用和局限性，故多手段综合协同治疗 成为癌症治疗的必然趋势。这两种治疗方法协同治疗可大幅提升治疗癌症的 效果，目前sdt和ptt技术的关键在于开发出高效、稳定和安全的光热剂/ 声敏剂。
[0005]
二硫化钼拥有优异的生物相容性，并且表面积体积比大、易表面修饰等 特点在生物医学领域备受关注，由于二硫化钼具有较好的光热转换性能，近 年来科研工作者对二硫化钼在肿瘤的光热治疗应用已经有所研究，但其并未 在肿瘤的声动力治疗中有所应用。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中的不足之处，本发明目的在于提供一种少层二硫化钼纳 米诊疗剂及其制备方法，以拓展少层二硫化钼的压电潜能(声动力)和光热 性能在肿瘤治疗中的应用。
[0007]
一种少层二硫化钼纳米诊疗剂，以少层二硫化钼纳米片作为基体，在其 表面修饰硫辛酸聚乙二醇而得；所述少层二硫化钼纳米片为1～3层二硫化钼 纳米片。
[0008]
进一步地，少层二硫化钼纳米片与硫辛酸聚乙二醇的质量比为1:5～10。； 更优选为1:8～10；该含量范围既可以实现li离子的插层，同时不会因为正丁 基锂的过多引入而导致加入水时使得反应过于激烈而影响少层二硫化钼纳米 片的产量。
[0009]
进一步地，所述硫辛酸聚乙二醇的分子量为4000～6000g/mol。
[0010]
本发明进一步提供一种制备如上所述的少层二硫化钼纳米诊疗剂的方 法，具体包括如下步骤：
[0011]
步骤1、将二硫化钼粉末和正丁基锂的混合液在惰性气体环境下进行搅 拌，以对二硫化钼进行锂插层，得到锂插层二硫化钼混合液；
[0012]
步骤2、将步骤1中得到的锂插层二硫化钼混合液进行抽滤，抽滤过程 中用正己烷反复清洗，以去除表面多余的锂及其有机残留物，得到锂插层二 硫化钼黑色固体；
[0013]
步骤3、将步骤2得到的锂插层二硫化钼黑色固体加入去离子水中稀释， 抽滤、水洗，部分残留的锂离子与水发生剧烈反应产生氢气，同时氢气不断 溢出破环二硫化钼层间的范德华力，从而制备出二硫化钼纳米片；
[0014]
步骤4、将上述抽滤过后的二硫化钼纳米片取出，加入去离子水中稀释， 然后进行超声处理1～10小时，剥离出1～3层的少层二硫化钼纳米片，得到 少层二硫化钼纳米片溶液；
[0015]
步骤5、在所述少层二硫化钼纳米片溶液中加入硫辛酸聚乙二醇，室温 超声处理，然后搅拌过夜，透析离心以去除多余的硫辛酸聚乙二醇，得到所 述少层二硫化钼纳米诊疗剂。
[0016]
进一步地，所述步骤1中，二硫化钼粉末与正丁基锂质量比为1:5～10。
[0017]
进一步地，所述惰性气体为氩气或氮气。
[0018]
进一步地，所述步骤5中，在超声处理前将体系ph值调至7～9。
[0019]
本发明进一步提供上述少层二硫化钼诊疗剂作为光热剂和声敏剂在肿瘤 或癌症细胞的声动力与光热协同治疗中的应用。
[0020]
目前，许多光热剂都是利用波长范围为750-1000nm的近红外一区 (nir-i)来进行光热转换，相比于近红外一区，波长范围为1000-1350nm 的近红外二区(nir-ii)由于发射波长更长，可以更显著穿透皮肤组织，降 低穿透生物组织时光散射及自荧光效应的影响，使得光照范围更深更广泛。 而二硫化钼在nir-ii区具有优异的吸收。
[0021]
以超声作为外部压力源，使得二硫化钼发生形变导致表面电势不平衡产 生活性氧通过凋亡、坏死等手段杀死肿瘤细胞；同时通过二硫化钼可以吸收 大量1064nm近红外光，能高效地将光能转变为热能，有效地将肿瘤细胞杀 死，又因二硫化钼本身对正常组织和细胞无害，修饰后可被肿瘤细胞吞噬， 对肿瘤细胞进行光热与超声治疗，而不对正常细胞造成损害。
[0022]
本发明的有益效果是：
[0023]
(1)本发明的少层二硫化钼纳米诊疗剂，以少层二硫化钼纳米片为基体， 具有优异的压电性能和光热性能，靶向性强，针对性高，可作为光热剂和声 敏剂而应用于肿瘤或癌症细胞的声动力与光热协同治疗，有望提高肿瘤的治 疗效果；并且通过在少层二硫化钼纳米片外表面修饰硫辛酸聚乙二醇，极大 地提高了生物相容性和安全性，对发展肿瘤光热和压电催化协同治疗的材料 具有重要意义。
[0024]
(2)本发明少层二硫化钼纳米诊疗剂的制备方法，所涉及的实验装置简 易，操作简单，制备周期快，有利于大批量生产。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面 将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而 易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术 人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的 附图。
[0026]
图1是实施例1中mos2@peg纳米诊疗剂的透射电镜(tem)图；
[0027]
图2示出实施例1中mos2@peg纳米诊疗剂的元素分析能谱图；
mpeg的质量比为1:10。然后超声半小时，搅拌反应12h，离心透析 得到mos2@peg，将其分散在pbs中，4℃保存待用。制得的mos2@peg 中，mos2@peg在去离子水中的水动力学半径为180nm，在生理盐水中的水 动力学半径为200nm。
[0041]
从图1可以看出，制得的mos2@peg纳米诊疗剂具有超薄二维片层形 貌。元素分布图(图2)表明mos2@peg纳米诊疗剂的成功合成。
[0042]
图3为是本实施例1制得的mos2@peg纳米诊疗剂在水、生理盐水中 的尺寸分布，可以看出纳米片具有很好的稳定性和分散性，可以长期保存。
[0043]
图4(a)为本实施例中mos2@peg纳米诊疗剂的原子力显微镜(afm) 照片，可以看出mos2@peg厚度为0.7～1.4nm。说明mos2@peg纳米诊疗 剂为1～3层的少层结构。图4(b)为本实施例中mos2@peg纳米诊疗剂的 压电响应相位曲线，说明其拥有压电响应能力。
[0044]
实施例2：mos2@peg光热转换性能测试
[0045]
将不同浓度的mos2@peg的纳米诊疗剂分散于96孔板中，得诊疗剂的 浓度为200、100和50μg/ml的悬浮液，取去离子水作为对照。用功率密度 为1.0w/cm2的1064nm波长的nir ii近红外激光照射，通过红外相机记录 水温随时间的变化。为检测材料的光热稳定性，重复照射材料五次，记录每 次照射后水的温度变化值。
[0046]
图5为功率密度为1.0w/cm2的nir ii近红外激光照射下，浓度分别为 200、100和50μg/ml的mos2@peg的纳米诊疗剂分散液以及去离子水水温 的变化情况。很明显，相同功率密度的激光照射下，mos2@peg的纳米诊疗 剂能更加有效地进行光热转换而升高水温。蒸馏水不具备光热转换的能力， 而经过10分钟照射后，nir ii(1064nm)近红外激光照射的mos2@peg的 纳米诊疗剂可以使蒸馏水温度升高至60℃。此外，重复照射材料五次， mos2@peg的纳米诊疗剂显示出了良好的热稳定性。
[0047]
实施例3：mos2@peg压电催化性能测试
[0048]
将mos2@peg的纳米诊疗剂分散于总体积三毫升的比色皿中， mos2@peg的纳米诊疗剂的浓度为50μg/ml，再加入二苯基异苯并呋喃 (dpbf)，dpbf的浓度为4μg/ml。然后使用功率为1w/cm2、占空比为50％ 的超声波进行超声。再用不加入mos2@peg纳米诊疗剂的单纯的dpbf溶液 在相同条件下进行对比实验。从图6(a)中可以看出，随着超声dpbf本身 会缓慢分解，特征峰略有下降，而图6(b)说明，加入mos2@peg纳米诊 疗剂后再进行超声会产生大量活性氧来降解dpbf，其特征峰快速下降。
[0049]
以下通过电子自旋共振(esr)技术来进一步验证mos2@peg的纳米诊 疗剂在超声振动下产生活性氧，将1ml的一定浓度的mos2@peg纳米诊疗 剂与1μl的四甲基哌啶酮(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidone，temp)混合， 在功率为1w/cm2、占空比为50％的超声振动下超声3分钟，图7说明 mos2@peg纳米诊疗剂能够在超声振动下产生单线态氧，显示出了良好的压 电催化性能，表明在压电催化产生活性氧方面具有良好的应用前景。
[0050]
实施例4：生物相容性测试
[0051]
用cck-8法评估不同浓度mos2@peg纳米诊疗剂(0、10、20、50、100 和200μg/ml)对细胞的毒性。将huvec、4t1细胞接种于96孔板(每孔 104个细胞)中，并培养过夜。然后，用培养基将mos2@peg的纳米诊疗剂 稀释成想要的浓度(0、10、20、50、100和200μg/ml)，再将溶液装载到96 孔板上，再孵育24小时。然后与10μl cck-8溶液共孵育后分析细胞毒性。 最后，用酶标仪在450nm的吸光度下评估细胞活力。
[0052]
从图8可以看出，不同浓度的mos2@peg纳米诊疗剂和huvec、4t1 细胞孵育24小时后，其细胞活性始终维持在高水平，表明本发明的 mos2@peg纳米诊疗剂本身对细胞的毒性是微小的，在实验浓度范围内 mos2@peg纳米诊疗剂显示出了良好的生物相容性。
[0053]
实施例5：cck-8法评估mos2@peg肿瘤治疗效果
[0054]
为了用cck-8法评估mos2@peg在不同处理方式下对4t1肿瘤细胞的 杀伤效果，将4t1肿瘤细胞按照不同的处理方式分为八组(用新鲜培养基处 理的对照组，仅使用近红外ii区1064nm激光照射组，仅用超声处理组，近 红外ii区1064nm激光照射 超声处理组，仅mos2@peg组，mos2@peg 近红外ii区1064nm激光照射组，mos2@peg 超声处理组，mos2@peg 近红外ii区1064nm激光照射 超声处理组，mos2@peg的浓度均为100μg /ml，用量100μl)。将肿瘤细胞接种于96孔板(每孔104个细胞)中附着在 培养皿上，并培养过夜。然后将100μl mos2@peg(100μg/ml)装载到96 孔板上，孵育4小时。之后，按照上述方法进行不同的处理。最后，在与10 μl cck-8溶液共孵育2小时后，通过吸光度为450nm的微孔板读取器评估 细胞活力。对于激光照射使用近红外ii区1064nm激光以1.0w/cm2的强度 辐照5分钟，超声则用功率为1w/cm2、占空比为50％的超声波对肿瘤细胞超 声3分钟。
[0055]
图9显示单纯的mos2@peg、近红外ii区1064nm激光照射、超声处理 以及近红外ii区1064nm激光照射加超声处理，并不会对细胞活性产生明显 影响，应用了mos2@peg后，近红外ii区1064nm激光照射或者超声处理 均可以降低肿瘤细胞活性，同时施加近红外ii区1064nm激光照射和超声处 理，则能显著降低肿瘤细胞活性。
[0056]
实施例6：流式细胞术法评估肿瘤治疗效果
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与实例5相同，4t1肿瘤细胞按照不同的处理方式分为八组(用新鲜培 养基处理的对照组，仅使用近红外ii区1064nm激光照射组，仅用超声处理 组，近红外ii区1064nm激光照射 超声处理组，仅mos2@peg组， mos2@peg 近红外ii区1064nm激光照射组，mos2@peg 超声处理组， mos2@peg 近红外ii区1064nm激光照射 超声处理组，mos2@peg的 浓度均为100μg/ml，用量1ml)。将4t1肿瘤细胞接种于6孔板(每孔2*105个细胞)中附着在培养皿上，并培养过夜。然后将1ml mos2@peg(100μg /ml)替换培养基并孵育8小时。
[0058]
之后，按照上述方法进行不同的处理。通过胰蛋白酶分离、离心和pbs 洗涤3次收集细胞。最后，将含有5μl pi和5μl fitc的混合溶液加入这些 细胞中培养20分钟。用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。图10进一步说明应 用了mos2@peg后，同时施加近红外ii区1064nm激光照射及超声处理， 能显著降低肿瘤细胞活性。
[0059]
本发明将少层二硫化钼纳米片、硫辛酸聚乙二醇有机组合起来，具有磁 靶向性、光热和压电催化联合治疗的多功能性，可用于人体或者其他哺乳动 物肿瘤或癌症的高效治疗。本发明所制备的纳米诊疗剂具有肿瘤靶向性强、 疗效显著等优点，可用于肿瘤或癌症细胞的光热治疗和压电催化治疗的联合 治疗，对发展肿瘤热疗和压电催化协同治疗的材料具有重要意义。
[0060]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方 式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领 域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范 围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图 例。