一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及临床体外检测技术领域，具体涉及一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。


背景技术：

2.hpv病毒是人类乳头瘤病毒的缩写，主要感染区域有人类表皮和黏膜鳞状上皮，至今已经分离出130多种，至少有85种已经进行完全测序。hpv是乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，是一个7200～8000bp左右的双链环状dna病毒，基因组编码三个功能区，即早期转录区、晚期转录区和上游调控区。
3.临床上一些学者根据hpv致癌危险性的大小将其分为高危型和低危型。低危型hpv主要引起肛门皮肤和外生殖器疣类病变，其亚型主要包括hpv6、11、30、39、42、43和44型；高危型hpv包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型，主要引起宫颈癌、外阴癌、肛门癌等。最近的研究资料表明，引起宫颈癌的原因是多种多样的，但是与hpv的感染关系密切。尤其是高危型hpv感染是宫颈癌和癌前变病发的重要条件，而高危型中以16/18最为常见，其中超过2/3的宫颈癌和其感染有关系。hpv分型还与宫颈癌病理类型有关，hpv16与宫颈癌关系最为密切，hpv18最易导致宫颈腺癌。hpv16/18感染是宫颈癌高危因素，能客观反映宫颈癌的恶化程度，hpv型也可以反映癌组织的病理学类型，可以作为评估患者预后的新指标。
4.现有技术对hpv病毒的体外检测试剂盒领域，大部分属于单一种类的病毒检测，费时费力：或者是添加多种引物的检测，加大了检测成本。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。本发明通过设计hpv31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型总共13种高危型hpv病毒的通用引体，并且针对性的加入了hpv16型和hpv18型的引体，可以有效的判断待检样本是否为高危型人乳头瘤病毒。
6.为实现上述目的，本发明的一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒是通过以下技术方案实现的：
7.本发明包括核酸释放剂、pcr混合液、酶混合液、hpv阳性对照和hpv阴性对照；所述pcr混合液中包括13种高危型hpv的通用引物、内标、fam荧光探针、hpv16的引物与hpv18的引物；
8.所述13种高危型hpv的通用引物分为上游引物hpv-f与下游引物eb-r：
9.所述上游引物hpv-f序列：
10.5'tgcctggggcaatcagttatttgttac3'；
11.所述下游引物eb-r序列：
12.5'cctctgccatgactaacctattccttaa3'；
13.所述hpv16的引物分为上游引物与下游引物：
14.所述hpv16的上游引物序列：
15.5'tcattttataatccagatacacagcg3'；
16.所述hpv16的下游引物序列：
17.5'ataaaggatggccactaatgcc3'；
18.所述hpv18的引物分为上游引物与下游引物：
19.所述hpv18的上游引物序列：
20.5'agcatttataatcctaaaacacaacg3'；
21.所述hpv18的下游引物序列：
22.5'aaaatggatgcccactaaggc3'；
23.所述内标的引物分为上游引物和下游引物：
24.所述内标的上游引物：
25.5'aattgaccgtggtggtgctc3'；
26.所述内标的下游引物：
27.5'ggagcatcgctgtactagg3'；
28.所述fam荧光探针由13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针、hpv16的fam荧光探针、hpv18的fam荧光探针和内标的fam荧光探针组成，
29.所述13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针序列：
30.5'tcagcaacaaccctgccctg3'；
31.所述hpv16的fam荧光探针序列：
32.5'cgcagtacaaatatgtcattatgtgctgcc3'；
33.所述hpv18的fam荧光探针序列：
34.5'ttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacc3'；
35.所述内标的fam荧光探针序列：
36.5'acacctaatggctgacc3'。
37.进一步的，所述核酸释放剂包括：氯化钠、chelex-100和十二烷基硫酸钠；所述氯化钠的浓度为0.1～0.4m；所述chelex-100的浓度为3～6％；所述十二烷基硫酸钠的浓度为2～6％。
38.进一步的，所述pcr混合液由pcr混合液a与pcr混合液b组成，所述pcr混合液a包括所述13种高危型hpv的通用引物、内标、13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针和内标的fam荧光探针，还包括5～15mm的tris-hcl、2～4mm的氯化钾、2.5～5mm的氯化镁和0.1～0.2mm的dntps；
39.所述混合液b包括所述hpv16的引物、hpv18的引物、hpv16的fam荧光探针和hpv18的fam荧光探针，还包括5～15mm的tris-hcl、2～4mm的氯化钾、2.5～5mm的氯化镁和0.1～0.2mm的dntps。
40.进一步的，所述13种高危型hpv的通用引物、内标的引物、hpv16的引物与hpv18的引物的总体积为0.2～0.4μm，所述13种高危型hpv的通用引物、内标的引物、hpv16的引物与hpv18的引物的体积相等。
41.进一步的，所述fam荧光探针的体积为0.5～1μm，所述13种高危型hpv的通用引物
的fam荧光探针、hpv16的fam荧光探针、hpv18的fam荧光探针和内标的fam荧光探针的体积相等。
42.进一步的，所述酶混合液包括4～8u的taq酶和0.3～0.8u的ung酶。
43.进一步的，所述试剂盒的反应体系为95℃，3min；94℃，15s；64℃，31s；一共40个循环。
44.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
45.本发明通过设计hpv31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型总共13种高危型hpv病毒的通用引物，并且针对性的加入了hpv16型和hpv18型的引物，使用了通用引物减少了引物用量和体系的复杂性，降低了成本，提高了检测效率，方便进行下一步的针对性治疗，简单快速，针对性强。
附图说明
46.图1为本发明对比例扩增结果的曲线示意图。
47.图2为本发明实施例1扩增结果的曲线示意图。
48.图3为本发明实施例2扩增结果的曲线示意图。
49.图4为本发明实施例3扩增结果的曲线示意图。
具体实施方式
50.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
51.对比例：
52.市面上购买的含有多种高危型引物的hpv检测试剂盒，使用方式参照说明书。
53.实施例1：
54.结合具体实施例对一种高危型人乳头瘤核酸病毒检测试剂盒进行如下说明：
55.1、确定引物
56.13种高危型hpv的通用引物为：
57.上游引物hpv-f：5'tgcctggggcaatcagttatttgttac3'，
58.下游引物eb-r：5'cctctgccatgactaacctattccttaa3'；
59.13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针为：
60.5'tcagcaacaaccctgccctg3；
61.hpv16的上游引物：5'tcattttataatccagatacacagcg3'
62.hpv16的下游引物：5'ataaaggatggccactaatgcc3'；
63.hpv16的fam荧光探针序列：
64.5'cgcagtacaaatatgtcattatgtgctgcc3'；
65.hpv18的上游引物：5'agcatttataatcctaaaacacaacg3'
66.hpv18的下游引物：5'aaaatggatgcccactaaggc3'；
67.hpv18的fam荧光探针序列：
68.5'ttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacc3'；
69.13种高危型hpv的通用引物、内标的引物、hpv16的引物与hpv18的引物和13种高危
型hpv的通用引物的fam荧光探针、hpv16的fam荧光探针、hpv18的fam荧光探针和内标的fam荧光探针是通过hpv病毒的基因序列中的靶基因序列进行设计的，且靶基因序列位于保守区。
70.2、加入反应试剂
71.(1)核酸释放剂的氯化钠的浓度为0.1m，chelex-100的浓度为3％，十二烷基硫酸钠的浓度为2％；
72.(2)pcr反应液包括浓度为10mm的tris-hcl、4mm的氯化钾、5mm的氯化镁，0.2mm的dntps、0.2μm的引物和0.5μm的fam荧光探针；
73.(3)酶混合液包括4u的taq酶和0.3u的ung酶；
74.3、样本的处理与加样
75.(1)样本试管中加入1ml的无菌生理盐水(冻存的样本使用前在室温下进行溶解并充分混匀)，充分震荡摇匀，吸取液体然后转移至离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清加入50μl的核酸释放剂(用枪头吹打均匀)，混匀后2000rpm离心10s，100℃水浴10min，然后12000rpm离心10min，得到的上清作为扩增样本。
76.(2)将hpv阳性对照、hpv阴性对照取出50μl，加入50μl的核酸释放剂，混匀后100℃水浴10min，12000rpm离心10min，备用。
77.4、pcr扩增
78.(1)试剂准备
79.a、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用。
80.b、根据待测样本、hpv阴性对照、hpv阳性对照的数量，按照一定的体积(反应混合液35.6μl/人份 0.4μl酶混合液 4μl样本处理上清液/阴性对照/阳性对照)充分混匀成pcr混合液，瞬时离心后备用。
81.c、扩增程序
[0082][0083]
5、结果判定
[0084]
(1)对于检测ct值≤38的样本，报告为hpv病毒阳性；
[0085]
(2)对于测定ct值＞38的样本，报告注明hpv样本阴性。
[0086]
实施例2：
[0087]
结合具体实施例对一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒进行如下说明：
[0088]
1、确定引物
[0089]
13种高危型hpv的通用引物为：
[0090]
上游引物hpv-f：5'tgcctggggcaatcagttatttgttac3'，
[0091]
下游引物eb-r：5'cctctgccatgactaacctattccttaa3'；
[0092]
13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针为：
[0093]
5'tcagcaacaaccctgccctg3'；
[0094]
hpv16的上游引物：5'tcattttataatccagatacacagcg3'
[0095]
hpv16的下游引物：5'ataaaggatggccactaatgcc3'；
[0096]
hpv16的fam荧光探针序列：
[0097]
5'cgcagtacaaatatgtcattatgtgctgcc3'；
[0098]
hpv18的上游引物：5'agcatttataatcctaaaacacaacg3'
[0099]
hpv18的下游引物：5'aaaatggatgcccactaaggc3'；
[0100]
hpv18的fam荧光探针序列：
[0101]
5'ttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacc3'；
[0102]
13种高危型hpv的通用引物、内标的引物、hpv16的引物与hpv18的引物和13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针、hpv16的fam荧光探针、hpv18的fam荧光探针和内标的fam荧光探针是通过hpv病毒的基因序列中的靶基因序列进行设计的，且靶基因序列位于保守区。
[0103]
2、反应试剂
[0104]
(1)核酸释放剂的氯化钠的浓度为0.12m，chelex-100的浓度为4％，十二烷基硫酸钠的浓度为4％；
[0105]
(2)pcr反应液包括浓度为20mm的tris-hcl、6mm的氯化钾、8mm的氯化镁，0.3mm的dntps、0.3μm的引物和0.75μm的fam荧光探针；
[0106]
(3)酶混合液包括6u的taq酶和0.5u的ung酶。
[0107]
3、样本的处理与加样
[0108]
(1)样本试管中加入1ml的无菌生理盐水(冻存的样本使用前在室温下进行溶解并充分混匀)，充分震荡摇匀，吸取液体然后转移至离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清加入50μl的核酸释放剂(用枪头吹打均匀)，混匀后2000rpm离心10s，100℃水浴10min，然后12000rpm离心10min，得到的上清作为扩增样本。
[0109]
(2)将hpv阳性对照、hpv阴性对照取出50μl，加入50μl的核酸释放剂，混匀后100℃水浴10min，12000rpm离心10min，备用。
[0110]
4、pcr扩增
[0111]
(1)试剂准备
[0112]
a、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用。
[0113]
b、根据待测样本、hpv阴性对照、hpv阳性对照的数量，按照一定的体积(反应混合液35.6μl/人份 0.4μl酶混合液 4μl样本处理上清液/阴性对照/阳性对照)充分混匀成pcr混合液，瞬时离心后备用。
[0114]
c、扩增程序
[0115]
[0116]
5、结果判定
[0117]
(1)对于检测ct值≤38的样本，报告为hpv病毒阳性；
[0118]
(2)对于测定ct值＞38的样本，报告注明hpv样本阴性。
[0119]
实施例3：
[0120]
结合具体实施例对一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒进行如下说明：
[0121]
1、确定引物
[0122]
13种高危型hpv的通用引物为：
[0123]
上游引物hpv-f：5'tgcctggggcaatcagttatttgttac3'，
[0124]
下游引物eb-r：5'cctctgccatgactaacctattccttaa3'；
[0125]
13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针为：
[0126]
5'tcagcaacaaccctgccctg3'；
[0127]
hpv16的上游引物：5'tcattttataatccagatacacagcg3'
[0128]
hpv16的下游引物：5'ataaaggatggccactaatgcc3'；
[0129]
hpv16的fam荧光探针序列：
[0130]
5'cgcagtacaaatatgtcattatgtgctgcc3'；
[0131]
hpv18的上游引物：5'agcatttataatcctaaaacacaacg3'
[0132]
hpv18的下游引物：5'aaaatggatgcccactaaggc3'；
[0133]
hpv18的fam荧光探针序列：
[0134]
5'ttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacc3'；
[0135]
13种高危型hpv的通用引物、内标的引物、hpv16的引物与hpv18的引物和13种高危型hpv的通用引物的fam荧光探针、hpv16的fam荧光探针、hpv18的fam荧光探针和内标的fam荧光探针是通过hpv病毒的基因序列中的靶基因序列进行设计的，且靶基因序列位于保守区。
[0136]
2、反应试剂
[0137]
(1)核酸释放剂的氯化钠的浓度为0.4m，chelex-100的浓度为6％，十二烷基硫酸钠的浓度为6％；
[0138]
(2)pcr反应液包括浓度为30mm的tris-hcl、8mm的氯化钾、10mm的氯化镁，0.4mm的dntps、0.4μm的引物和1μm的fam荧光探针；
[0139]
(3)酶混合液包括8u的taq酶和0.8u的ung酶。
[0140]
3、样本的处理与加样
[0141]
(1)样本试管中加入1ml的无菌生理盐水(冻存的样本使用前在室温下进行溶解并充分混匀)，充分震荡摇匀，吸取液体然后转移至离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清加入50μl的核酸释放剂(用枪头吹打均匀)，混匀后2000rpm离心10s，100℃水浴10min，然后12000rpm离心10min，得到的上清作为扩增样本。
[0142]
(2)将hpv阳性对照、hpv阴性对照取出50μl，加入50μl的核酸释放剂，混匀后100℃水浴10min，12000rpm离心10min，备用。
[0143]
4、pcr扩增
[0144]
(1)试剂准备
[0145]
a、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用。
[0146]
b、根据待测样本、hpv阴性对照、hpv阳性对照的数量，按照一定的体积(反应混合液35.6μl/人份 0.4μl酶混合液 4μl样本处理上清液/阴性对照/阳性对照)充分混匀成pcr混合液，瞬时离心后备用。
[0147]
c、扩增程序
[0148][0149]
5、结果判定
[0150]
(1)对于检测ct值≤38的样本，报告为hpv病毒阳性；
[0151]
(2)对于测定ct值＞38的样本，报告注明hpv样本阴性。
[0152]
精密度试验
[0153]
取新鲜样本，每个样本均分成4等份，利用核酸释放剂将hpv病毒dna释放出来，然后用实施例1、2、3所得的试剂，并与市场上常用并认可的试剂同时对dna样本进行扩增，重复20次，并检测ct值的变异系数。
[0154]
表1试剂盒重复性检测结果
[0155]
[0156][0157]
结果分析：
[0158]
根据附图1,2,3,4结合分析，对比市面上常见技术，本发明对于检测的结果，相对于现有技术的“s”型曲线高度一致，并且在简化了引体的情况下仍然能达到现有技术的精密度，通过设计hpv31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型总共13种高危型hpv病毒的通用引物，同时针对性的加入了hpv16型和hpv18型的引体，减少了引物用量和体系的复杂性，降低了成本提高了检测效率，方便进行下一步的针对性治疗，简单快速，针对性强。
[0159]
以上的实施案例为本发明最佳的实施方式，但是并不受以上实施案例的限制。对于本技术专业领域的研究人员，可以根据上述案例的技术及构思，可以做出相应的改变，但是这些所有的改变都应该属于本专利要求的保护范围。