抗体-白介素融合蛋白以及使用方法与流程

抗体-白介素融合蛋白以及使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年06月10日提交的pct/cn2019/090494的优先权，其公开的内容通过引用并入本文。
发明领域
3.本公开内容一般涉及生物学、治疗学和诊断学领域。特别地，本公开内容涉及抗体-白介素融合蛋白及其用途。


背景技术：

4.近年来，随着对潜在生物学过程的了解增加，癌症治疗取得了重大进展。例如，诱导患者自身免疫系统对抗肿瘤的免疫疗法的发展突显了促进对癌症相关基因改变表达的肿瘤抗原的免疫耐受的机制的重要性。这些以针对pd-1、pd-l1或ctla4的单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂已经对一些癌症类型越来越广泛的患者产生了显著且持久的应答。然而，目前的免疫疗法(如pd-1或pd-l1阻断剂)仅在癌症患者中表现出有限的应答(参见，例如，p sharma and jp allison,cell(2015)161:205-214)，并且化疗耐药性仍然是癌症治疗中最紧迫的主要困境之一。因而，持续需要开发新的组合物和方法来调节免疫系统和消除肿瘤免疫抑制作用，以解决肿瘤免疫耐受性和化疗耐药性。


技术实现要素：

5.在一个方面中，本公开内容提供了一种融合蛋白。在一个实施方式中，所述蛋白包含：抗体或抗原结合片段，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域；和可操作地连接至所述抗体或抗原结合片段的白介素分子。
6.在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合至免疫检查点蛋白。在某些实施方式中，所述免疫检查点蛋白选自下组：a2ar、b7.1、b7.2、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、btla、cd48、cd120b、cd160、cd244、ctla-4、icos、lag-3、lilrb1、lilrb2、lilrb4、ox40、pd-1、pd-l1、pd-l2、sirpα(cd47)、tigit、tim-3、tim-1、tim-4和vista。在某些实施方式中，所述免疫检查点是pd-1或pd-l1。
7.在某些实施方式中，抗体包含fc区。在某些实施方式中，抗原结合片段是f(ab’)2片段。在某些实施方式中，抗原结合片段是单链可变片段(scfv)。
8.在某些实施方式中，所述白介素分子选自下组：il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-35和il-36。在某些实施方式中，白介素分子是il-10。
9.在某些实施方式中，白介素分子连接至重链可变结构域。在某些实施方式中，白介素分子连接至重链可变结构域的n末端。在某些实施方式中，白介素分子连接至重链可变结构域的c末端。在某些实施方式中，白介素分子连接至轻链可变结构域。在某些实施方式中，
白介素分子连接至轻链可变结构域的n末端。在某些实施方式中，白介素分子连接至轻链可变结构域的c末端。
10.在某个实施方式中，所述蛋白还包含接头，其连接抗体或其抗原结合片段和白介素分子。在某些实施方式中，接头包含氨基酸序列(ggggs)n(n＝2-5)。
11.在另一个方面中，本公开内容提供了一种分离的多核苷酸，其编码本文所述的蛋白。
12.在另一个方面中，本公开内容提供了一种能够表达蛋白的载体，其包含本文所述的分离的多核苷酸。
13.在另一个方面中，本公开内容提供了一种适于生产蛋白的重组宿主细胞，其包含本文所述的载体。在某些实施方式中，重组宿主细胞是哺乳动物细胞系。在某些实施方式中，哺乳动物细胞系是cho细胞系。
14.在另一个方面中，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含本文所述的蛋白和药学上可接受的载体。
15.在另一个方面中，本公开内容提供了一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病是肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组：肺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液系统癌症、白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
16.在某些实施方式中，所述疾病是免疫相关病证。在某些实施方式中，所述免疫相关病证选自下组：炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、i型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥病、白塞氏病、结节病、移植物抗宿主病(gvhd)、系统性红斑狼疮、白癜风、慢性预防性急性移植物抗宿主病(pgvhd)、hiv诱发的血管炎、斑秃、系统性硬化症和原发性抗磷脂综合征。
17.单词“一个(a)”或“一种(an)”当与术语“包含(comprising)”在权利要求书和/或说明书中一起使用时，可能表示“一个”，但也可能与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
18.预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施。本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下具体描述中变得显而易见。然而，应当理解的是，具体描述和特定实施例虽然指示了本发明的具体实施方式，但仅作为说明给出，因为从该具体实施方式中，本公开内容的精神和范围的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
19.以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在此呈现的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
20.图1显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
21.图2显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
22.图3显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
23.图4显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
24.图5显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
25.图6显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
26.图7显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
27.图8显示了本发明融合蛋白的示例性实施方式。
28.图9a和图9b显示了在由抗pd-1(7a4d)、抗pd-l1(5g11)单克隆抗体和衍生的抗体-il-10融合蛋白引发的混合淋巴细胞反应(mlr)中细胞因子产生的诱导。lc，il-10连接在ig轻链c末端；hc，il-10连接在ig重链c末端。
29.图10显示了由基于抗pd-1(7a4d)和抗pd-l1(5g11)单克隆抗体的抗体-il-10融合蛋白激发的mc/9细胞增殖。
30.图11显示了抗pd-l1(10f.9g2)抗体和抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白与表达pd-l1的小鼠肿瘤细胞的结合特征。小鼠肿瘤细胞系a20和ct26分别以非常高的水平和低水平在表面上表达pd-l1。抗pd-l1(10f.9g2)抗体和抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白分别使用r-藻红蛋白缀合试剂盒(abcam)用pe标记。在染色之前，使用1μg/ml小鼠bd fc封闭(bd biosciences)在4℃下处理a20和ct26细胞5min。使用指定的各种量的pe标记蛋白对总体积为100μl的处理过的细胞进行染色。在lsrfortessa x-20流式细胞仪上对染色细胞进行分析。左图和右图分别显示了来自ct26和a20细胞的数据。
31.图12显示了抗pd-l1抗体-hc-mil-10融合蛋白对同源ct26小鼠肿瘤模型的影响。
具体实施方式
32.在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求限制。
33.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本公开内容的实施或测试中也可以使用与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
34.在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利都被明确地和单独地指示为通过引用并入本文并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本公开内容无权因在先公开内容而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
35.本领域技术人员在阅读本公开内容后将意识到，本文描述和说明的各个实施方式中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本公开内容的范围或精神的情况下，其可以容易地与其他几个实施方式中的任一个的特征分离或组合。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
36.i.定义
37.应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。在本技术中，除非另有说明，否则单数的使用包括复数。在本公开内容中，术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的。如本文所用，“另一个”可以指至少第二个或更多。此外，术语“包括(including)”以及诸
如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。此外，诸如“元件”或“组分”之类的术语包括包含一个单元的元件和组分以及包含多于一个子单元的元件和组分，除非另有明确说明。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
38.如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用。
39.如本文所用，术语“施用”指向对象提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
40.如本文所用，术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体、双特异性抗体及其抗原结合片段。天然完整抗体包含两条重(h)链和两条轻(l)链。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变结构域(vh)和恒定区组成，所述恒定区包含第一、第二和第三恒定结构域(分别为ch1、ch2、ch3)；哺乳动物轻链分为λ或κ，轻链由可变结构域(v
l
)和恒定结构域(c
l
)组成。抗体呈“y”形，y的主干由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定结构域组成。y的每个臂包含与单个轻链的可变和恒定结构域结合的单个重链的可变结构域和第一恒定结构域。轻链和重链的可变结构域负责抗原结合。重链和轻链两者的每个可变结构域均通常包含三个高变环，称为互补性决定区(cdr)(轻链cdr包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3)。本文公开的抗体的cdr边界可由kabat、imgt、chothia或al-lazikani的约定定义或鉴定(al-lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,j.mol.biol.,273(4),927(1997)；chothia,c.等，j mol biol.dec 5；186(3):651-63(1985)；chothia,c.和lesk,a.m.,j.mol.biol.,196,901(1987)；chothia,c.等，nature.dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；kabat e.a.等，national institutes of health,bethesda,md.(1991)；marie-paule lefranc等，developmental and comparative immunology,27:55-77(2003)；marie-paule lefranc等，immunome research,1(3),(2005)；marie-paule lefranc,molecular biology of b cells(第二版)，第26章，481-514,(2015))。重链或轻链可变结构域的三个cdr插入称为框架区(fr)的侧翼片段之间，其比cdr更高度保守并形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定结构域不参与抗原结合，但显示出各种效应功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列进行分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别分成诸如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)的几个亚类。
41.术语“抗原”指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体而言，抗原是与抗体或t淋巴细胞抗原受体特异性结合的物质。抗原通常是蛋白和多糖，不太常见是脂质。适宜的抗原包括但不限于细菌的部分(外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其他微生物。抗原还包括肿瘤抗原，例如，由肿瘤突变产生的抗原。如本文所用，抗原还包括免疫原和半抗原。
42.如本文所用，术语“抗原结合片段”指蛋白能够特异性结合抗原的部分。在某个实施方式中，抗原结合片段衍生自包含一个或多个cdr的抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双体fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定化的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫键稳定化的双体(ds双体)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双体)、多特异性抗体、
natl acad sci u s a.jul 15；90(14):6444-8(1993)；ep404097；wo93/11161)。通过使用过短而无法在同一链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向相同或不同抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双体”是靶向两个不同抗原(或表位)的双体。
54.在某些实施方式中，“scfv二聚体”是包含与另一个v
h-v
l
部分二聚化的v
h-v
l
(通过肽接头连接)的二价双体或二价scfv(bsfv)，以使得一部分的vh与另一部分的v
l
配位并形成两个可以靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的结合位点。在其他实施方式中，“scfv二聚体”是包含v
h1-v
l2
(通过肽接头连接)与v
l1-v
h2
(也通过肽接头连接)结合的双特异性双抗体，以使得v
h1
和v
l1
配位以及v
h2
和v
l2
配位，并且每个配位对具有不同抗原特异性。
[0055]“域抗体”是仅包含重链可变结构域或轻链可变结构域的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个vh结构域与肽接头共价连接以产生二价域抗体。二价域抗体的两个vh结构域可以靶向相同或不同抗原。
[0056]
如本文所用，术语“嵌合的”指抗体或抗原结合片段，其重链和/或轻链的一部分来源于一个物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同物种。在说明性实例中，嵌合抗体可以包含源自人的恒定区和源自非人动物如小鼠的可变区。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
[0057]
如本文所用，术语“人源化”指抗体或抗原结合片段包含来源于非人动物的cdr，来源于人的fr区，并且当适用时，恒定区来源于人。
[0058]“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其伴侣y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示。亲合力可以通过本领域公知的常用方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常与抗原结合较慢且易于解离，而高亲和力抗体通常与抗原结合较快且结合时间较长。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是公知的，其中任何一种都可以用于本发明的目的。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方式。
[0059]“特异结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽上的表位的蛋白或抗体是与该特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的蛋白或抗体。例如，本文所述的抗体可以与免疫检查点蛋白特异性结合。在一些实施方式中，与免疫检查点蛋白结合的抗体的解离常数(kd)≦100nm、≦10nm、≦1nm、≦0.1nm、≦0.01nm或≦0.001nm(例如，10-8
m或更低，例如，从10-8
m至10-13
m，例如，从10-9
m至10-13
m)。
[0060]
如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”可互换使用，指任何涉及异常细胞生长的疾病，包括影响身体任何组织、器官或细胞的所有阶段和所有形式的疾病。该术语包括所有已知的肿瘤和赘生物病况，无论其特征为恶性、良性、软组织还是实体，以及所有阶段和分级的癌症，包括转移前和转移后的癌症。一般来说，可以根据肿瘤所在或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态对肿瘤进行分类。如本文所用，肿瘤类型包括急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、粒细胞性白血病、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、
室管膜瘤、食道癌、尤文家族肿瘤、尤文氏肉瘤、胃(胃)癌、神经胶质瘤、头颈癌、心脏病、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤。
[0061]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以预防、治疗、减轻和/或改善任何病症或疾病的症状和/或根本病因的药剂的量，或者足以对细胞产生所需效果的药剂的量。在一个实施方式中，“治疗有效量”是足以减轻或消除疾病的症状的量。在另一个实施方式中，治疗有效量是足以克服疾病本身的量。
[0062]
如本文所用，术语“表位”指抗原上与抗原结合多肽结合的特定原子或氨基酸基团。表位可以是线形表位或构象表位。线形表位由来自抗原的连续氨基酸序列形成，并根据其一级结构与抗体相互作用。另一方面，构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成，并根据抗原的3d结构与抗体相互作用。在通常情况下，表位的长度约为五个或六个氨基酸。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则其可以结合抗原内的相同表位。
[0063]
术语“宿主细胞”是指已经用核酸序列转化或能够转化并由此表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代在形态或遗传组成上是否与原始亲本细胞相同，只要存在目标基因即可。
[0064]
如本文所用，“分离的”生物组分(如核酸、肽或细胞)已与该组分天然存在的生物体的其他生物组分或细胞(即，其他染色体和染色体外dna和rna、细胞和蛋白)基本上分离，分离生产或从其中纯化。因此，已“分离”的核酸、肽和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸。
[0065]
如本文所用，术语“连接”是指通过分子内相互作用(例如，共价键、金属键和/或离子键)或分子间相互作用(例如，氢键或非共价键)的缔合。
[0066]
术语“可操作地连接”指元件的排布，其中这样描述的组件被配置为执行其的通常功能。这样，与多肽有效连接的给定信号肽指导多肽从细胞中分泌。在启动子的情况下，与编码序列有效连接的启动子将指导编码序列的表达。启动子或其他控制元件不必与编码序列连续，只要其起指导其表达的作用即可。例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在插入的未翻译但转录的序列，并且仍然可以认为启动子序列与编码序列“可操作地连接”。
[0067]
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰如2’,3
’‑
二脱氧核糖，以及核苷酸间连接修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒酸磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。
[0068]
术语“多肽”或“蛋白”是指具有天然蛋白氨基酸序列的大分子，即由天然存在的非重组细胞产生的蛋白；或者其由基因工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物和聚合物。术语“多肽”和“蛋白”具体包括lair1抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一
个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白相比，此类片段还可以含有修饰的氨基酸。在某些实施方式中，片段约5至500个氨基酸长。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在抗体的情况下，有用的片段包括但不限于cdr区、重链和/或轻链可变区、抗体链的一部分或仅包含两个cdr的其可变区等。
[0069]
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分运送或运输到另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和其他用于药物制剂的无毒相容性物质。
[0070]
如本文所用，术语“对象”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在很多实施方式中，对象是人类。对象可以是患者，其指向医疗提供者提供以诊断或治疗疾病的人。术语“对象”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。对象可能患有或易患疾病或病症，但可能会或可能不会表现出疾病或病症的症状。
[0071]
如本文所用，病况的“治疗”(“treating/treatment”)包括预防或减轻病况、减缓病况的发作或发展速度、降低发展成病况的风险、预防或延迟与病况相关的症状的发展、减少或结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况，或者其的某种组合。
[0072]
如本文所用，“载体”指引入宿主细胞中的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制原点。载体还可以包含一种或多种治疗基因和/或选择标记基因和本领域公知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达不同于细胞天然的核酸和/或蛋白。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的材料，如病毒颗粒、脂质体、蛋白涂层等。
[0073]
ii.融合蛋白及其生产
[0074]
a.融合蛋白
[0075]
本公开内容的一个方面提供了一种融合蛋白，其包含：包含重链可变结构域和轻链可变结构域的抗体或其抗原结合片段；和可操作地连接至抗原或抗原结合片段的白介素分子。应当意识到的是，本公开内容的融合蛋白可以具有多种形式和结构。本公开内容的融合蛋白可以通过图1-8中所示的示例性实施方式来理解。
[0076]
参见图1，在本发明的一个示例性实施方式中，融合蛋白包含常规y形抗体，该抗体包含两对重链和轻链。每条重链由可变结构域(vh)和恒定区组成，恒定区包含第一、第二和第三恒定结构域(分别为ch1、ch2、ch3)。每条轻链由可变结构域(v
l
)和恒定结构域(c
l
)组成。y形抗体的茎由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定结构域组成。y形抗体
的每个臂包含与单个轻链的可变结构域和恒定结构域结合的单个重链的可变结构域和第一恒定结构域。在每条重链的c末端，白介素(il)分子通过接头与重链的第三个恒定结构域连接。
[0077]
参见图2，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含具有与图1中所示相同结构的常规y形抗体。与图1不同的是，在图2中所示的融合蛋白中，不是与重链连接，il分子通过接头与轻链恒定结构域连接。
[0078]
参见图3，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含具有与图1中所示相同结构的常规y形抗体。在图3中所示的融合蛋白中，il分子通过接头连接至重链可变结构域。
[0079]
参见图4，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含具有与图1中所示相同结构的常规y形抗体。在图4中所示的融合蛋白中，il分子通过接头连接至轻链可变结构域。
[0080]
在某些实施方式中，如图5-8中所示，融合蛋白包含抗原结合片段。参见图5，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含由两对轻链和重链片段组成的抗原结合片段f(ab’)2。每个重链片段在ch1和ch2结构域之间包含一部分恒定区，从而在两个重链片段之间形成链间二硫键。在每条重链的c末端，il分子通过接头与重链片段连接。
[0081]
参见图6，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含具有与图5中所示相同结构的f(ab’)2片段。与图5不同的是，在图6中所示的融合蛋白中，不是与重链片段连接，il分子通过接头与轻链恒定结构域连接。
[0082]
参见图7，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含一对单链可变片段(scfv)。scfv是一种分子，其中重链和轻链可变结构域已通过柔性接头连接以形成单个多肽链，该多肽链形成抗原结合区。在国际专利申请号wo 88/01649以及美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链可变片段，其公开内容通过引用并入本文。参见图7，重链可变结构域与ch1和ch2结构域之间的部分重链恒定区连接，从而在两个单链可变片段之间形成链间二硫键。在每个scfv的c末端，il分子通过接头连接至scfv。
[0083]
参见图8，在本发明的另一个示例性实施方式中，融合蛋白包含一对scfv，每个scfv从多肽的n端到c端包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。轻链可变结构域与ch1和ch2结构域之间的部分重链恒定区连接，从而在两个单链可变片段之间形成链间二硫键。在每个scfv的c末端，il分子通过接头连接至scfv。
[0084]
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性结合至免疫检查点蛋白。在某些实施方式中，免疫检查点蛋白选自下组：a2ar、b7.1、b7.2、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、btla、cd48、cd120b、cd160、cd244、ctla-4、icos、lag-3、lilrb1、lilrb2、lilrb4、ox40、pd-1、pd-l1、pd-l2、sirpα(cd47)、tigit、tim-3、tim-1、tim-4和vista。
[0085]
在某些实施方式中，融合蛋白包含选自在qui等的us10,428,146中公开的那些抗pd-1抗体，其公开内容整体通过引用并入本文。在某些实施方式中，抗pd-1抗体是在us10,428,146中公开的7a4d。在某些实施方式中，融合蛋白包含来源于在us10,428,146中公开的抗pd-1抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，抗pd-1抗体或抗原结合片段包含(i)具有hcdr1、hcdr2和hcdr3的重链可变区，所述hcdr1具有seq id no:1的氨基酸序列，hcdr2具有seq id no:2的氨基酸序列，hcdr3具有seq id no:3的氨基酸序列；以及(ii)具有lcdr1、
lcdr2和lcdr3的轻链可变区，所述lcdr1具有seq id no:4的氨基酸序列，lcdr2具有seq id no:5的氨基酸序列，lcdr3具有seq id no:6的氨基酸序列。
[0086]
在某些实施方式中，融合蛋白包含选自在zha等的us 10,435,470中公开的那些抗pd-l1抗体，其公开内容整体通过引用并入本文。在某些实施方式中，抗pd-l1抗体是在us 10,435,470中公开的5g11。在某些实施方式中，融合蛋白包含来源于在us 10,435,470中公开的抗pd-l1抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，抗pd-l1抗体或抗原结合片段包含(i)具有hcdr1、hcdr2和hcdr3的重链可变区，所述hcdr1具有seq id no:7的氨基酸序列，hcdr2具有seq id no:8的氨基酸序列，hcdr3具有seq id no:9的氨基酸序列；以及(ii)具有lcdr1、lcdr2和lcdr3的轻链可变区，所述lcdr1具有seq id no:10的氨基酸序列，lcdr2具有seq id no:511的氨基酸序列，lcdr3具有seq id no:12的氨基酸序列。
[0087]
在某些实施方式中，白介素分子选自下组：il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、、il-7、il-8、il-il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17,il-18、il-19、il20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-35和il-36。在某些实施方式中，白介素分子是il-7、il10或il-23。在某些实施方式中，白介素分子是人白介素。
[0088]
白介素7(il-7)是一种由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌的造血生长因子。其也由角质形成细胞、树突细胞、肝细胞、神经元和上皮细胞产生，但不是由正常淋巴细胞产生。人il-7mrna具有genbank登录号nm_000880、nm_001199886、nm_001199887和nm_001199888的序列。人il-7蛋白具有genbank登录号np_000871、np_001186815、np_001186816和np_001186817的序列。il-7刺激多能(专能)造血干细胞分化为淋巴祖细胞。其还刺激淋巴谱系中所有细胞的增殖，包括b细胞、t细胞和nk细胞。
[0089]
白细胞介素10(il-10)，也称为人细胞因子合成抑制因子(csif)，通常被认为是一种抗炎细胞因子。人il-10蛋白是同型二聚体，每个亚基长178个氨基酸。人il-10mrna具有genbank登录号nm_000572的序列。人il-10蛋白具有genbank登录号np_000563的序列。在某些实施方式中，在融合蛋白中包含的il-10分子具有seq id no:13的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在某些实施方式中，在融合蛋白中包含的il-10分子具有seq id no:14的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
[0090]
在多肽或多核苷酸的上下文中，“同一性百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)用于两条序列的最佳比对。百分比通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
[0091]
il-10通过由两个il-10受体1和两个il-10受体2蛋白组成的受体复合物发出信号。il-10结合通过jak1和tyk2磷酸化il-10受体1和il-10受体2的胞质尾部来诱导stat3信号转导。il-10是一种细胞因子，在免疫调节和炎症中具有多种多效性。其下调巨噬细胞上th1细胞因子、mhc ii类抗原和共刺激分子的表达。其还增强了b细胞的存活、增殖和抗体产
生。
[0092]
白介素23(il-23)是一种异二聚体细胞因子，由il12b亚基和il23a亚基组成。il-23维持产生il-17的细胞，增加血管生成并减少cd8 t细胞浸润。
[0093]
在某些实施方式中，融合蛋白含有将白介素分子与抗体或抗原结合片段连接的接头。在某个实施方式中，接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基组成，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。然而，其他残基也可能是功能性的。在某些实施方式中，接头包含氨基酸序列(ggggs)n(n＝2-5)。
[0094]
b.生产方法
[0095]
根据本公开内容的融合蛋白可以重组制备，通过例如从编码融合蛋白的核酸构建体表达，例如，如在antibody engineering:methods and protocols，第2版(humana press,2012),第40章：production of bispecific antibodies:diabodies and tandem scfv(hornig and farber-schwarz)中所描述的。
[0096]
在某些实施方式中，融合蛋白可以基于针对靶抗原的单克隆抗体制备，例如，免疫检查点蛋白，其可以使用标准方法制备，然后进行筛选、表征和功能评估。可以对单克隆抗体的可变区进行测序，然后将其亚克隆到表达载体中以产生编码融合蛋白的基因，然后对其进行表达和纯化。
[0097]
融合蛋白可以进一步通过亲和力成熟过程进行工程改造，其中产生修饰的抗体或抗原结合片段，与未修饰的亲本抗体或抗原结合片段相比，修饰的抗体或抗原结合片段与抗原结合的亲和力有所提高。亲和力成熟的抗体或抗原结合片段可通过本领域公知的程序产生，例如，marks等，rio/technology 10:779-783(1992)；barbas等，proc nat.acad.sci.usa 91:3809-3813(1994)；schier等，gene 169:147-155(1995)；yelton等，j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等，j.immunol.154(7):331 0-15 9(1995)；和hawkins等，j.mol.biol.226:889-896(1992)。
[0098]
包含如本文所公开的常规y形抗体的融合蛋白也可被工程化以包含在fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、fc受体结合和/或效应功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文公开的抗原结合多肽可以被化学修饰(例如，一种或多种化学部分可以连接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，再次改变抗原结合多肽的一种或多种功能特性。本文公开的抗体还包括具有修饰的(或封闭的)fc区以提供改变的效应功能的抗原结合多肽。参见，例如，美国专利号5,624,821；wo2003/086310；wo2005/120571；wo2006/0057702。这种修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，可能对诊断和治疗产生有益的影响。
[0099]
在某些实施方式中，融合蛋白中包含的scfv可以通过噬菌体展示产生，其中非常方便地将抗原结合结构域表达为单个肽。通常，可以构建随机接头文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组成的18个氨基酸多肽的区段连接。scfv库(约5
×
106个不同成员)展示在丝状噬菌体上，并与靶抗原(例如，il-10)进行亲和选择。
[0100]
或者，可以从单克隆抗体衍生的亚克隆重链和轻链直接产生scfv。
[0101]
在某些实施方式中，可以对本公开内容的融合蛋白进行纯化。如本文所用，术语“纯化的”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白相对于其天然可获得状态被纯化至任何程度。因此，纯化的蛋白也指一种蛋白，其不受其可能天然存在的环境的影响。当使用
术语“基本上纯化的”时，该名称将指一种组合物，其中蛋白或肽形成该组合物的主要成分，如构成组合物中蛋白的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多(例如，以重量计)。
[0102]
iii.组合物和缀合物
[0103]
a.制剂
[0104]
本公开内容提供了一种药物组合物，其包含本文所述的融合蛋白。此类组合物包含预防或治疗有效量的抗原结合多肽和药学上可接受的载体。在一个具体实施方式中，术语“药学上可接受的”指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更具体地用于人类。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物是静脉内施用时，水是一种特殊的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。其他适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
[0105]
如有需要，该组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释剂型等形式。口服制剂可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适宜药剂的实例参见“remington's pharmaceutical sciences”。这样的组合物将含有预防或治疗有效量的抗原结合多肽，优选纯化形式，连同合适量的载体，以便为患者提供适合施用的形式。制剂应适合施用模式，可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或机械通气递送。
[0106]
如本文所述，本公开内容的融合蛋白可以配制用于胃肠外施用，例如，配制用于通过皮内、静脉内、肌内、皮下、瘤内或甚至腹腔途径注射。或者，抗原结合多肽可以通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通过喷雾器。药学上可接受的盐包括酸式盐和与无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及如有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
[0107]
通常，本公开内容的组合物的成分单独提供或以单位剂型混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，在密封容器中，如安瓿或小袋，指示活性剂的量。当组合物通过输注施用时，其可以用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，从而可以在施用前混合成分。
[0108]
可以将本公开内容的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
[0109]
b.缀合物
[0110]
本公开内容的融合蛋白可以与至少一种药剂连接以形成缀合物。为了增加融合蛋白作为治疗剂的有效性，通常连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。此类分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报告分子。效应分子包括具有所需活性的分子，例如，细胞毒活性。已连接至抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤、治疗性
酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。
[0111]
在某些实施方式中，本公开内容的缀合物包括药物缀合物，其包含与药物共价连接的融合蛋白。在某些实施方式中，将缀合物用于治疗疾病，例如，通过向患有疾病的对象施用缀合物。适宜药物的实例包括抗肿瘤药物、抗生素和免疫抑制药物。
[0112]
本领域公知几种用于将抗体附着或缀合至其缀合部分的方法。一些附接方法包括使用金属螯合络合物，例如，附接至抗体的有机螯合剂如二亚乙基三胺五乙酸酐(dtpa)；乙三胺四乙酸；n-氯对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体也可以在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标记的缀合物。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的成像是使用单克隆抗体实现的，并且可检测的成像部分使用接头如对羟基苯甲酸甲酯或n-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯与抗体结合。
[0113]
在其他实施方式中，考虑使用不改变抗体结合位点的反应条件，通过在免疫球蛋白的fc区选择性地引入巯基来衍生免疫球蛋白。公开了根据该方法产生的抗体缀合物显示出改进的寿命、特异性和敏感性(美国专利5,196,066，通过引用并入本文)。效应分子或报告分子的位点特异性连接，其中效应分子与fc区中的碳水化合物残基缀合，也已在文献中公开(o’shannessy等，1987)。
[0114]
iv.由融合蛋白治疗的疾病
[0115]
在一个方面中，本公开内容提供了使用本文公开的融合蛋白治疗疾病的方法，所述疾病包括但不限于肿瘤和免疫病症。
[0116]
a.肿瘤
[0117]
虽然过度增殖性疾病可能与导致细胞开始不受控制地繁殖的任何疾病有关，但典型的实例是肿瘤。肿瘤的关键要素之一是细胞的正常凋亡周期被中断，因此中断细胞生长的药物作为治疗这些疾病的治疗剂很重要。在此，可以针对肿瘤细胞表面上的抗原产生感兴趣的融合蛋白，特别是在癌症干细胞的表面上，或在被这种抗原的存在抑制的免疫细胞的存在下。
[0118]
根据本公开内容可以治疗的肿瘤细胞包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、胰腺、睾丸、舌、宫颈或子宫的细胞。此外，肿瘤可能特别具有以下组织学类型，但不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌、未分化的；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母细胞癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤；无色素
性黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性的；布伦纳肿瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。在某些方案中，肿瘤可以包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。
[0119]
b.免疫病症
[0120]
免疫病症是由免疫系统功能障碍引起的。针对调控免疫细胞(如b细胞、t细胞、nk细胞等)的抗原的融合蛋白可用于调节免疫细胞，从而治疗免疫病症，如炎症、自身免疫性疾病和移植排斥。
[0121]
如本文所用，自身免疫性疾病是指由对正常身体部位的异常免疫应答引起的病况。由自身免疫性疾病引起的疾病有80多种。几乎可以涉及任何身体部位。自身免疫性疾病具有多种不同影响，包括组织损伤或破坏、器官生长改变和器官功能改变。美国约有2400万人(7％)受到自身免疫性疾病的影响。
[0122]
一些认为是自身免疫性疾病的常见疾病包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生综合征(alps)、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、乳糜泻口炎、慢性疲劳免疫缺陷综合征(cfids)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、克雷斯特综合征、克罗恩病、德戈病、皮肌炎、皮肌炎-青少年、盘状狼疮、原发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫病、格林巴利病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、炎症性肠病、胰岛素依赖型糖尿病(i型)、幼年关节炎、梅尼埃氏病、混合结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多毛综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷蒙德氏现象、赖特氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿。
[0123]
1型糖尿病是一种糖尿病，其没有足够的胰岛素产生，导致体内血糖水平升高。1型糖尿病的症状包括尿频、口渴增加、饥饿感增加、体重减轻、视力模糊、感觉疲倦和愈合不良。虽然1型糖尿病的病因尚不清楚，但其潜在机制涉及胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏。
[0124]
系统性红斑狼疮，也称为狼疮，是一种身体免疫系统错误地攻击身体很多部位的健康组织的疾病。常见症状包括关节疼痛和肿胀、发烧、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、感觉疲倦和最常见在面部的红疹。虽然狼疮的病因尚不清楚，但其可能涉及遗传和环境因素。狼疮的机制涉及自身抗体对人自身组织的免疫应答，最常见的是导致炎症的抗核抗体。
[0125]
类风湿性关节炎是一种长期的自身免疫性疾病，主要影响关节，通常会导致关节发热、肿胀和疼痛。其他症状包括低红细胞计数、肺部和心脏周围的炎症、发烧和低能量。虽然类风湿性关节炎的病因尚不清楚，但据信其涉及遗传和环境因素的组合。潜在机制涉及身体的免疫系统错误地攻击关节，导致关节囊发炎和增厚，并影响下面的骨骼和软骨。
[0126]
多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，其中大脑和脊髓中神经细胞的绝缘覆盖物被人自身的免疫系统破坏。这种损伤会破坏神经系统的交流能力，导致一系列症状，包括复视、单眼失明、肌肉无力、感觉障碍或协调障碍。虽然原因尚不清楚，但认为多发性硬化症的潜在机制是免疫系统的破坏。提出的原因包括遗传和环境因素。
[0127]
尽管自身免疫性疾病普遍存在，但其原因通常尚不清楚。包括t细胞和b细胞在内的人类适应性免疫系统能够与自身抗原发生反应。但是这些自我反应的t细胞和b系统通常要么在免疫系统内变得活跃之前被杀死，要么进入无反应状态，要么被调控细胞从免疫系统内的角色中除去。当这些机制中的任何一种失败时，一些自我反应细胞可能会在免疫系统中发挥作用并导致自身免疫性疾病。
[0128]
当移植组织被受体的免疫系统排斥时，就会发生移植排斥，这会破坏移植组织。排斥的潜在机制涉及通过由杀伤性t细胞介导的细胞免疫和由活化的b细胞介导的体液免疫的适应性免疫应答的组合。某些先天免疫应答的组分(如吞噬细胞和可溶性免疫蛋白)也可能参与其中。
[0129]
急性移植排斥反应可用免疫抑制疗法治疗。免疫抑制药物包括皮质类固醇，如泼尼松龙和氢化可的松、钙调神经磷酸酶抑制剂和mtor抑制剂。
[0130]
c.融合蛋白的施用
[0131]
在一些实施方式中，本公开内容提供了一种在对象中治疗疾病的方法，包括向所述对象施用治疗有效量的本文提供的融合蛋白或药物组合物。
[0132]
本文提供的融合蛋白的治疗有效量(当单独使用或与其他药剂如化疗剂组合使用时)将取决于本领域公知的各种因素，例如待治疗的疾病类型、体重、年龄、过去的病史、目前的药物治疗、对象的健康状况、免疫状况和潜在的交叉反应、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病的类型、严重程度和发展以及主治医师或兽医师的判断。在某些实施方式中，可以以约0.001mg/kg至约100mg/kg每天一次或多次(例如，约0.001mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg每天一次或多次)的治疗有效量施用本文提供的融合蛋白。在某些实施方式中，以
约50mg/kg或更低的剂量施用融合蛋白，以及在某些实施方式中，剂量是20mg/kg或更低、10mg/kg或更低、3mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.3mg/kg或更低、0.1mg/kg或更低、或0.01mg/kg或更低、或0.001mg/kg更低。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，根据对象的反应，可以在治疗过程中改变施用剂量。
[0133]
可以调整剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗应答)。在某些实施方式中，将本文提供的融合蛋白一次性或在一系列治疗中施用于对象。在某些实施方式中，根据疾病的类型和严重程度，通过一次或多次单独施用或通过连续输注将本文提供的融合蛋白施用于对象。
[0134]
本文提供的融合蛋白可以通过本领域公知的任何途径施用，例如胃肠外(例如，皮下、覆膜内、静脉内，包括静脉内输注、肌内或皮内注射)或非胃肠外(例如，口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
[0135]
在某些实施方式中，本文提供的其融合蛋白可以以控释方式施用。可以将控释胃肠外制剂制成植入剂，油性注射剂或微粒系统(例如，微球、微粒、微囊、纳米胶囊、纳米球和纳米粒子)(参见banga,a.j.,therapeutic peptides and proteins:formulation,processing,and delivery systems,technomic publishing company,inc.,lancaster,pa.,(1995)；kreuter,j.,colloidal drug delivery systems,j.kreuter编著，marcel dekker,inc.,new york,n.y.,pp.219-342(1994)；tice&tabibi,treatise on controlled drug delivery,a.kydonieus编著，marcel dekker,inc.new york,n.y.,pp.315-339,(1992))。在某些实施方式中，本文公开的融合蛋白可以在可降解或不可降解的聚合物基质中施用(参见langer,accounts chem.res.26:537-542,1993)。
[0136]
在一些实施方式中，本文提供的融合蛋白可以单独施用或与一种或多种其他治疗剂或手段组合施用。例如，本文提供的融合蛋白可以与第二疗法组合施用，如放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗、用于治疗肿瘤的手术(例如，肿瘤切除术)、一种或多种止吐剂或用于化疗引起的并发症的其他治疗或者用于治疗肿瘤或任何医学病症的第二治疗剂，例如，另一种抗体、治疗性多核苷酸、一种或多种化疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、一种或多种其他细胞毒剂、一种或多种生长抑制剂。在这些实施方式的某些中，本文提供的融合蛋白可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用，并且在这些实施方式的某些中，融合蛋白和一种或多种另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的融合蛋白不必与该药剂同时施用或在与该药剂的组合物中施用。如本文所用的短语，在另一种药剂之前或之后施用的融合蛋白被视为与该药剂“组合”施用，即使融合蛋白和第二药剂通过不同途径施用。在可能的情况下，与本文提供的融合蛋白组合施用的另外的治疗剂根据在另外的治疗剂中提供的产品信息表，或根据physicians'desk reference 2003(physicians'desk reference，第57版；medical economics company；isbn:1563634457；第57版(2002年11月))或本领域众所周知的方案施用。
[0137]
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应被解释为限制本发明的范围。下面描述的所有具体化合物、材料和方法，全部或部分地落入本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而仅仅是为了说明落入本发明范围内
的特定实施方式。本领域技术人员可以在不行使创造性能力和不脱离本发明范围的情况下开发等效的组合物、材料和方法。应当理解的是，可以在本文描述的程序中进行多种变化，同时仍保持在本发明的范围内。本发明的意图是这些变化包括在本发明的范围内。
[0138]
实施例1
[0139]
本实施例显示了抗体-il-10融合蛋白的产生及其体外功能测试。
[0140]
分别根据抗人pd-1 7a4d(参见qui等的us10,428,146)和抗人pd-l1抗体5g11(参见zha等的us 10,435,470)设计抗体-il-10融合蛋白列表。抗体-il-10融合蛋白通过瞬时转染在cho细胞中表达，并进行亲和纯化。il-10部分通过(ggggsggggs(seq id no：15))的接头连接到相应抗体的重链或轻链的c末端。如表1中所示，每种抗il-10融合蛋白的表达产量与相应抗体相似。
[0141]
此外，通过biacore分析测量每种抗体-il-10融合蛋白与相应靶点的结合动力学和结合亲和力。无论融合形式如何，抗体和抗体-il-10融合蛋白之间的ka、kd和kd值相似。
[0142]
表1：基于抗人pd-1抗体7a4d和抗人pd-l1抗体5g11的抗体-il-10融合蛋白的结合动力学的表征
[0143][0144]
对于biacore分析，抗人igg fc二抗用ph 5.0的醋酸钠缓冲液稀释至25μg/ml，并使用胺偶联试剂盒固定在cm5芯片上的参考通道和测试通道上。每种抗体或抗体-il-10融合蛋白用运行缓冲液稀释至1-3μg/ml，并以10μl/min的流速在预固定cm5芯片的不同通道上捕获60秒。通过将重组人pd-1或pd-l1抗原以3.125和100nm之间的浓度在hbs ep缓冲液中以30μl/min的流速进行2倍连续稀释来测量结合。结合时间和解离时间分别设置为90s和400s。使用biacore t200评价软件3.1将测得的亲和力数据拟合到1:1langmuir结合模型。
[0145]
如图9a和图9b所示，7a4d和5g11抗体均阻断pd-l1-pd-1通路并诱导cd4 效应t细胞分泌ifn-γ和il-2。基于任一抗体的抗体-il-10融合蛋白引发了相同的效果，其中il-10部分连接到ig重链或轻链c末端。每种抗体和相应的抗体-il-10融合蛋白都以类似的方式显示细胞因子产生的剂量依赖性诱导，表明il-10与抗体的连接对7a4d和5g11抗体的功能影响最小。
[0146]
发明人进一步测试了抗体-il-10融合蛋白是否保留了诱导免疫细胞增殖的il-10活性。向mc/9细胞施用il-10导致以剂量依赖性方式的细胞增殖。在96孔微量滴定板上，将
100μl培养基中的2.5x104个mc/9细胞置于每个孔中，所述培养基添加有到指定终浓度的重组人il-10(ril-10)或每种抗体-il-10融合蛋白。ril-10或融合蛋白的最大浓度是5,260pmol/l。在37℃、5％co2下48小时，将celltiteraqueous one solution(promega)添加到每个测定孔中，并在490nm吸光度处测量细胞数。ec50由补充剂浓度与od 490nm的拟合曲线计算得出。
[0147]
如图10中所示，il-10与抗pd-1抗体7a4d的ig重链c末端连接，而不是轻链，强烈诱导mc/9细胞增殖，表现出与人il-10相似的ec50。类似地，与抗pd-l1抗体5g11的重链或轻链c末端连接的il-10强烈诱导mc/9细胞增殖，表现出与人il-10相似的ec50。
[0148]
实施例2
[0149]
本实施例在同基因小鼠肿瘤模型中评价了抗体-il-10融合蛋白的体内治疗有效性。设计了一种基于大鼠抗小鼠pd-l1单克隆抗体10f.9g2的融合蛋白，其通过瞬时转染在cho细胞中表达并进行亲和纯化。抗体10f.9g2是igg2a，κ-同种型，融合蛋白含有融合在ig重链c末端的小鼠il-10部分。与10f.9g2抗体相比，抗体-il-10融合蛋白的表达产量列于表2。
[0150]
表2：抗小鼠pd-l1抗体-il-10融合蛋白的表达产量
[0151][0152]
小鼠肿瘤细胞系a20和ct26在表面分别以非常高和低水平表达pd-l1。使用r-藻红蛋白缀合试剂盒(abcam)分别用pe标记抗pd-l1(10f.9g2)抗体和抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白。染色前，在4℃下将a20和ct26细胞用1μg/ml小鼠bd fc block(bd biosciences)处理5min。使用规定的各种量的pe标记的蛋白对总体积为100μl的处理过的细胞进行染色。在lsrfortessa x-20流式细胞仪上分析染色的细胞。
[0153]
如图11中所示，与抗pd-l1(10f.9g2)类似，抗pd-l1(10f.9g2)抗体hc-mil-10融合蛋白显示出剂量依赖性的a20细胞染色，该细胞具有高表达的pd-l1。对于pd-l1表达较弱的ct26细胞，当使用大量标记蛋白(2.5μg)时，抗pd-l1(10f.9g2)抗体和抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白均显示出适度的细胞染色。这些数据表明il-10的融合对抗小鼠pd-l1抗体与其靶点的结合几乎没有影响。
[0154]
很多同基因小鼠肿瘤模型可用于评价与未缀合的抗pd-l1(10f.9g2)抗体和载剂对照相比抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白的治疗有效性。此类模型包括使用ct26、a20、hepa1-6、mbt-2、b16-f10肿瘤细胞系建立的那些。
[0155]
对于ct26同基因肿瘤模型，在雌性balb/c小鼠的右后腹区域皮下注射5x 105个ct26肿瘤细胞。在开始治疗之前，允许肿瘤达到100
–
250mm3的尺寸。对于每个治疗组，使用了8只小鼠，不同组中个体小鼠的肿瘤体积变化保持非常相似。对于治疗，以每周两次的频率在远离肿瘤的部位腹腔内施用抗pd-l1(10f.9g2)抗体(6mg/kg，10ul/g)、抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白(7mg/kg，10ul/g)或仅载剂(pbs缓冲剂，10ul/g)对照，持续两周。每次施用后，使用电子卡尺每周监测肿瘤生长2-3次。此外，在指定的实验终点收
集肿瘤组织，用于对包括cd45、cd4、cd8和f4/80在内的几种炎症细胞标志物进行免疫组织化学。
[0156]
如图12中所示，全身性治疗后，抗pd-l1(10f.9g2)抗体-hc-mil-10融合蛋白比抗pd-l1(10f.9g2)抗体具有更明显的肿瘤生长抑制作用，后者仅显示出适度的抗肿瘤作用，而在载剂对照组中观察到持续肿瘤生长。此外，在治疗组的所有小鼠中没有观察到明显的体重减轻，表明单独使用抗体或抗体-il-10融合蛋白引起的全身毒性很小。