一种ACE2修饰的磁珠及制备方法和在SARS-CoV-2病毒检测中的应用

一种ace2修饰的磁珠及制备方法和在sars-cov-2病毒检测中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种ace2修饰的磁珠及其制备方法和利用此ace2修饰的磁珠构成的 sers活性基底用于体液中新冠病毒的分离和检测，属于材料制备领域。


背景技术：

2.表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman scattering，sers)是一种通过分子吸附在粗糙贵金属表面从而增强非弹性光散射的一种检测技术，其具有高灵敏度、无损、且能通过基底的设计实现单分子检测水平。如今，sers在生物检测方面，已经发展为一种可用于床旁检测的生物传感器，来检测一些传染性疾病的病原体，例如病毒和细菌。新型冠状病毒(sars-cov-2)主要是通过体液进行传播，其病毒载量为10
2-107copies/ml，可以使用高灵敏度的sers基生物传感器来进行检测。


技术实现要素：

3.为此，本发明旨在制备一种ace2修饰的au纳米颗粒修饰的磁珠作为sers活性基底，并对人体各种样本中新冠病毒进行分离提纯、富集和检测。其中，分离提纯依赖于吸附在fe3o
4-au上的ace2与sars-cov-2病毒表面s蛋白的亲和性；分离和富集依赖于fe3o4的超顺磁性；拉曼信号的的增强依赖于纳米金颗粒以及金箔的局域表面等离子体共振。
4.一方面，本发明提供了一种ace2修饰的磁珠，包括：氨基化fe3o4磁性颗粒，分布在氨基化fe3o4磁性颗粒表面的金纳米颗粒，以及修饰在氨基化fe3o4磁性颗粒表面的 ace2。
5.本发明人发现，在sers基生物传感器中，起主要作用的是sers活性的基底材料，本发明采用具有sers活性的金纳米颗粒负载的fe3o4为基底材料(如图1中(a))。
6.对于患者的体液检测，如唾液来说，在检测sars-cov-2的同时会受到唾液中其他蛋白和细胞的影响，如唾液中的黏蛋白、淀粉酶等物质。因此，需要设计一个能够特异性和 sars-cov-2病毒结合的基底材料。其中，血管紧张素转化酶(ace2)作为一种病毒的受体，和sars-cov-2病毒表面的s蛋白具有好的亲和性，能够做到特异性识别并结合sars
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cov-2。将ace2与fe3o4结合，在唾液样本中特异性结合sars-cov-2后，在外部磁场的作用下，进行分离和富集，然后用缓冲溶液进行清洗，可以从患者唾液中分离提纯出sars
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cov-2病毒(如图1中(b))。
7.以此基础上，本发明设计了一种特异性识别sars-cov-2病毒的ace2修饰的sers 活性的磁性基底材料fe3o
4-au-ace2，能够从患者体液样本中特异性识别sars-cov-2病毒，然后在外部磁场的作用下，进行分离提纯和富集，在金箔上进行拉曼信号的检测，能成功的将病毒从各种体液中检测出来。本发明中是将ace2中的组氨酸标签与fe3o4结合，进一步利用ace2的特异性。具体来说，本发明中ace2的组氨酸标记可以通过fe3o4表面的正电荷与咪唑(咪唑是组氨酸上的官能团，即四氧化三铁的正电荷与咪唑上的负电荷的静电相互作用；四氧化三铁氨基化是为了au纳米颗粒的结合，即氨基和au纳米颗粒具有好的亲和性)上的
电子静电作用结合，无需在修饰多余的官能团，以及和负载的au纳米颗粒无相互作用。
8.较佳的，所述氨基化的fe3o4磁性颗粒的形状为球形，颗粒尺寸为100～500nm。
9.较佳的，所述金纳米颗粒的粒径为20～50nm；所述金纳米颗粒的含量为46～ 70wt％。本专利中，au纳米颗粒的含量对于染料分子r6g来说检测限均在10-7
m左右，也就是说在这个范围内au纳米颗粒对这种基底的检测限没有太大的影响。本发明人在前期实验中尝试提高au纳米颗粒的浓度，但是按照本专利的制备方法，au纳米颗粒浓度的提高会造成肉眼可见的au颗粒的团聚，反而会导致失去sers活性。
10.较佳的，所述ace2的负载状况为饱和吸附，占ace2修饰的磁珠总质量的0.06～ 0.6wt％，优选0.2～0.4wt％。
11.另一方面，本发明还提供了一种ace2修饰的磁珠的制备方法，包括：(1)将90ml浓度为2～5mg/ml的氨基化的fe3o4磁性颗粒(nh
2-fe3o4)分散液加热至沸腾，然后加入5～20ml浓度为0.3～0.4g/ml的haucl4溶液和4～18ml质量分数为1wt％的柠檬酸钠溶液，机械搅拌15～60分钟，得到混合溶液1；(2)将混合溶液冷却至90℃以下，再加入1～3ml浓度为25mm的haucl4溶液和2～6ml 质量分数为1wt％的柠檬酸钠溶液，机械搅拌15～45分钟，得到混合溶液2；(3)重复步骤(1)和步骤(2)至少三次，然后室温下搅拌3～6小时，得到混合溶液3；(4)将混合溶液3用磁铁富集，再用去离子水清洗后分散去离子水中，得到fe3o
4-au磁性颗粒分散液；(5)将ace2溶液和fe3o
4-au磁性颗粒分散液进行超声混合，得到所述ace2修饰的磁珠。
12.较佳的，所述ace2溶液的浓度为0.35～2.62mg/ml，加入量为50～600μl。所述 fe3o
4-au磁性颗粒分散液的浓度为0.14～0.8mg/ml，加入量为100～400μl。针对ace2 负载量的问题，ace2作为一种特异性识别病毒上s蛋白的捕获蛋白，其浓度越高越好，在吸附饱和后多余的ace2会被pbs冲洗掉，实验中使用高浓度ace2，主要确保ace2实现吸附饱和。
13.较佳的，所述ace2由组氨酸标记，记为his-ace2。
14.较佳的，所述超声混合的功率为900～2700w，超声处理的时间为10分钟～2小时。
15.再一方面，本发明还提供了一种ace2修饰的磁珠在sars-cov-2病毒检测中的应用，包括：利用ace2修饰的磁珠中ace2与sars-cov-2病毒表面s刺突蛋白结合，实现 sars-cov-2病毒的吸附；然后利用拉曼信号的检测，与未吸附sars-cov-2病毒的ace2 修饰的磁珠的拉曼信号进行对比，判断是否存在病毒。优选地，将ace2修饰的磁珠中检测体液中sars-cov-2病毒。
16.较佳的，所述吸附的时间为10s～2小时。
17.有益效果：上述制备的磁珠具有较好的sers活性，在金箔上对于染料分子r6g的检测限可以达到10-8 m。通过ace2与病毒表面的s蛋白结合，在20min内快速的将病毒从复杂的体液环境中分离并检测出来，得到灵敏度高，快速且低成本的用于检测新冠病毒的生物传感器。本发明中，ace2修饰的磁珠不仅可以检测sars-cov-2病毒，还可以在复杂的体液中，利用 ace2的特异性结合以及磁珠的分离提纯和富集来特异性检测体液中的病毒。
附图说明
18.图1为ace2修饰的磁珠的制备示意图(a)和测试流程示意图(b)；图2为大粒径磁珠假病毒的拉曼信号；图3为阳性鼻拭子溶液模型和阴性鼻拭子溶液模型拉曼信号的比较。
具体实施方式
19.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
20.在本领域中，急需一种能够快速且准确的检测工具，来辅助现在使用的核酸检测。
21.根据这一需求，本发明设计了一种由血管紧张素转化酶(ace2)修饰的磁珠，该磁珠的结构是au纳米颗粒(尺寸为20～40nm)负载在fe3o4纳米磁性颗粒的表面，利用了 fe3o4的分离和富集作用和au纳米颗粒的表面增强拉曼散射效应(sers)，以及his-ace2 与sars-cov-2病毒表面的s蛋白的亲和性，从而可以在复杂的体液环境中检测出该病毒。
22.以下示例性地说明ace2修饰的磁珠的制备方法。
23.选用fe3o
4-au磁珠作为sers基底材料。具体来说，在氨基化的fe3o4分散液中进行金纳米颗粒的制备，使得金通过氨基官能团连接在fe3o4颗粒上，制备出双功能的磁性 sers活性基底。
24.将90ml左右氨基化的粒径fe3o4分散液(浓度为2～5mg/ml)加热至沸腾，然后加入5～20ml浓度0.3～0.4g/ml的haucl4溶液和4～18ml质量分数为1wt％的柠檬酸钠溶液，机械搅拌15～60min，得到分散液(即混合溶液1)。在上述过程中，溶液由黑色变成红棕色，形成10～20nm大小的au的晶种。其中，氨基化的fe3o4的形状为球形颗粒，尺寸为100～500nm。
25.将混合溶液1缓慢冷却至90℃以下，加入1～3ml浓度为25mm的haucl4和2～ 6ml质量分数为1wt％的柠檬酸钠，机械搅拌15～45min，得到混合溶液2。在上述过程中，金的晶种长大，粒径在28～50nm范围内。
26.重复制备混合溶液1和混合溶液2的步骤至少三次，然后室温下搅拌3～6h，得到混合溶液3。
27.将混合溶液3用磁铁富集，用去离子水去洗三次，得到ace2修饰的磁珠。
28.将ace2修饰的磁珠分散在50～100ml的去离子水中，得到浓度可为0.14～0.8g/ml 的ace2修饰的磁珠分散液。
29.在sers活性基底上连接ace2(结合方式为超声混合，超声功率可为900～ 1800w，结合时间可为10min～2h)，富集收集后加入带有s型假病毒的体液样本，进行分离提纯、富集、清洗，并重新分散在去离子水中，得到混合溶液4。将混合溶液4滴加到金箔上，干燥后测试其拉曼信号。其中，ace2修饰磁珠用于结合sars-cov-2病毒表面s刺突蛋白。ace2修饰的磁珠可在体液中检测sars-cov-2病毒。ace2由组氨酸标记，记为 his-ace2。his-ace2的浓度为0.35～2.62mg/ml，加入量可为50～600微升。
30.所用的体液采集于正常健康人员，阴性阳性体液的差别只在于有无病毒的加入，his
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ace2吸附病毒后，进行拉曼信号的检测，通过两种溶液拉曼信号的对比，即可确定是否存在病毒。吸附时间可为10s～2h。
31.本发明中，ace2修饰的磁珠对染料分子r6g有较好的拉曼信号增强作用，在金箔上
检测限为10-8
m。此外对于各种体液样本中的s型新冠假病毒有很好的分离，富集和检测作用。
32.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
33.实施例1 ace2修饰的磁珠用于分离检测阳性鼻拭子溶液模型中的新冠病毒使用ace2修饰的磁珠分离检测阳性咽拭子溶液模型中新冠病毒的过程包括：步骤1：将2.5ml浓度为5mg/ml、粒径为100-200nm的氨基化的fe3o4加入到装有97.5ml 去离子水的三颈烧瓶中，油浴加热至沸腾后加入5ml浓度为0.315g/ml的haucl4和4.2ml 质量分数为1wt％的柠檬酸钠，搅拌30min，然后将三颈瓶离开油浴，并冷却至90℃以下。然后在90℃的油浴和搅拌的情况下加入1ml浓度为25mm的haucl4和2ml质量分数为 1wt％的柠檬酸钠，机械搅拌15min。然后将上述步骤重复三次，最后用磁铁收集沉淀物，用去离子水清洗三次，分散到30ml的去离子水中；步骤2：取1.5ml的au负载的fe3o4(记作fe3o
4-au，浓度为0.42mg/ml)分散液于 1.5ml的离心管中，然后用磁铁进行富集，移去上层清液。将20微升浓度为1.34mg/ml的ace2用400ml的pbs稀释，一个离心管中加入50微升，超声10min，放置1h。将上述的分散液用磁铁收集，将上清液移去；其中，ace2修饰的磁珠中金纳米颗粒(20～50nm)的含量为70wt％，ace2占ace2修饰的磁珠总质量的0.21wt％；步骤3：取健康人员的咽拭子样本，一半作为阴性咽拭子溶液模型，约600微升，另一半在 500微升的阴性咽拭子溶液中加入假病毒100微升，其浓度可以表示为50微升的rlu值为 105，将其作为阳性咽拭子溶液模型。将阴性和阳性咽拭子溶液模型分别加入上述的离心管中，超声10min混合，后用磁铁收集，移去上清液。加入pbs缓冲液400微升，然后用磁铁富集收集，再次移去350微升的上清液。将剩下的分散液超声混合均匀，然后将7微升的分散液滴到金箔上，干燥8min后进行拉曼信号的检测。
34.上述过程以咽拭子为例，但是新冠病毒的传播途径不仅只通过唾液传播，为此本发明还研究了ace2修饰的磁珠在人体别的体液以及在一些生物溶液环境中的检测能力，具体实施方式如下。
35.将实施例1中“ace2修饰的磁珠分离检测阳性咽拭子溶液模型中新冠病毒的过程”中的“咽拭子溶液模型”改成“鼻拭子溶液模型”。具体鼻拭子溶液模型的制备为：取健康人员的鼻拭子样本，一半作为阴性鼻拭子溶液模型，约600微升，另一半在500微升的阴性鼻拭子溶液中加入假病毒100微升，其浓度可以表示为50微升的rlu值为105，将其作为阳性鼻拭子溶液模型。其他制备过程和检测过程同上，可以从阳性鼻拭子溶液模型中的检测出新冠病毒。
36.实施例2 ace2修饰的磁珠用于分离检测阳性牛血清溶液模型中的新冠病毒将“ace2修饰的磁珠分离检测阳性咽拭子溶液模型中新冠病毒的过程”中的“咽拭子溶液模型”改成“牛血清溶液模型”。具体牛血清溶液模型的制备为：取1100微升的牛血清，其中600微升不做任何处理，作为阴性牛血清溶液模型，另一半在500微升的牛血清溶液中加入假病
毒100微升，其浓度可以表示为50微升的rlu值为105，将其作为阳性牛血清溶液模型。其他制备过程和检测过程同上，可以从阳性牛血清溶液模型中的检测出新冠病毒。
37.实施例3 ace2修饰的磁珠用于分离检测阳性pbs溶液模型中的新冠病毒将“ace2修饰的磁珠分离检测阳性咽拭子溶液模型中新冠病毒的过程”中的“咽拭子溶液模型”改成“pbs溶液模型”。具体pbs溶液模型的制备为：取1100微升的pbs溶液，其中600微升不做任何处理，作为阴性pbs溶液模型，另一半在500微升的pbs溶液中加入假病毒100微升，其浓度可以表示为50微升的rlu值为105，将其作为阳性pbs溶液模型。其他制备过程和检测过程同上，可以从阳性pbs溶液模型中的检测出新冠病毒。
38.实施例4 ace2修饰的大粒径磁珠用于分离检测阳性pbs溶液模型中的新冠病毒磁珠中fe3o4粒径的大小也会影响病毒表面s蛋白的拉曼信号，实施例4中将买的粒径在 100-200nm的氨基化的fe3o4改成制备的400nm左右的fe3o4。具体的制备步骤如下：步骤1：将0.6g的无水fecl3、3g ch3coona加入到30ml乙二醇中，超声溶解，然后在磁力搅拌机上加热到50℃，以1500转/min进行混合和反应。然后将反应后的混合液倒入容量为100ml、内衬材料为对位聚苯(ppl)的反应釜中，在190℃下，反应8小时，待反应釜冷却后，倒出上清液，用磁铁收集黑色的沉淀物，并用去离子水和无水乙醇分别清洗两次，然后在60℃烘箱中干燥12小时，得到fe3o4粉体；步骤2：将12.5mg的fe3o4磁性小球加入到13ml的去离子水和25ml的无水乙醇的混合液中，并超声10min，在360rpm下进行机械搅拌。在搅拌过程中加入0.6ml的氨水(25wt％
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28wt％)并搅拌5min，然后加入0.3ml的3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)，然后在室温下机械搅拌12小时。沉淀物采用磁铁收集，分别用去离子水和无水乙醇清洗两次，然后储存于2.5ml的去离子水中。
39.在制备和检测过程中使用100微升浓度为0.67mg/ml的ace2，使用的假病毒浓度为 1.38
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106tu/ml，其他制备与检测过程与“ace2修饰的磁珠分离检测阳性咽拭子溶液模型中新冠病毒的过程”相同。其中，ace2修饰的磁珠中金纳米颗粒(20～50nm)的含量为 70wt％，ace2占ace2修饰的磁珠总质量的0.54wt％。同样可以从pbs溶液中检测出新冠病毒。由于病毒的吸附方向的改变，呈现在拉曼光谱中，表示为部分峰的出现和消失，以及部分峰峰位的改变。
40.实施例5与实施例1类似，本实施例5中尝试提高au的浓度来提高磁性基底的性能，具体的实施步骤如下：步骤1：将2.5ml浓度为5mg/ml、粒径为100-200nm的氨基化的fe3o4加入到装有50ml 去离子水的三颈烧瓶中，油浴加热至沸腾后加入10ml浓度为0.315g/ml的haucl4和 8.4ml质量分数为1wt％的柠檬酸钠，搅拌30min，然后将三颈瓶离开油浴，并冷却至90℃以下。然后在90℃的油浴和搅拌的情况下加入2ml浓度为25mm的haucl4和4ml质量分数为1wt％的柠檬酸钠，机械搅拌15min。
41.按照实施例1中的方法，金种长大的部分重复三次，但是在重复到第二次时，金纳米颗粒发生严重的团聚现象，在贴着三颈瓶壁的部位形成肉眼可见的金颗粒。sers效应是发生在纳米结构表面的现象，所以上述描述的浓度不适合制备sers基底，没有进一步检测和测试的必要。