皮革改性剂的制作方法

1.本发明涉及一种制造天然皮革时所使用的皮革改性剂。


背景技术：

2.动物的天然皮革除了用于鞋等鞋类、皮包、手提包、衣服、手袋、皮带等服饰类、椅子、内饰、汽车座椅等家具类、体育用品以外，还广泛使用于马具、鼓、手工艺用等日常生活中，已成为生活用品的重要原材料。
3.如果进行大致划分，则天然皮革的制造可以分为1)准备作业、2)鞣制工序、3)再鞣制-染色-加脂工序、4)加工工序这四道工序。在准备作业中，除去附着于原皮的血液、污渍、盐分、肉片、脂肪等，利用石灰和硫化物使皮膨润，解开胶原蛋白纤维，并降解除去毛，通过软化来降解除去不需要的蛋白质，使银面变得光滑。
4.软化也称为酶解，是为了下述目的：i)除去残留于皮的毛根、蛋白质降解物、脂肪等；ii)除去皮的纤维间物质；iii)除去使皮收缩的弹性蛋白纤维等；iv)使皮的银面变得平滑；v)使胶原蛋白纤维轻微地解束等，而对经过了石灰浸渍、脱灰后的皮进行的酶解处理工序。
5.因此，作为用于软化的酶，要求产生上述的效果。例如，已知通过利用具有弹性蛋白降解能力的酶降解皮革中的弹性蛋白，能够抑制皮革的收缩而扩大面积的技术(专利文献1)，同时，如果作为皮的主要成分的胶原蛋白被降解，则会产生强度下降的问题。目前，作为用于抑制胶原蛋白降解并且抑制皮收缩而实现面积扩大的技术，提出了在铬鞣制后利用蛋白酶和弹性蛋白酶的混合物进行处理的方法(专利文献2)。然而，在该方法中，鞣制工序的种类被限定，还会产生改变制造工序自身的必要性。
6.另一方面，蛋白酶的m23家族是在merops数据库中作为能够降解gly-gly键的蛋白酶而被定义的蛋白酶家族，对弹性蛋白和细菌细胞壁的蛋白多糖具有降解活性，已知也被称作溶菌酶。其中，已经报道有：m23a亚族所属的β-裂解蛋白酶(blp)对枯草杆菌等革兰氏阳性菌具有强的溶菌活性(专利文献3)。另外，最近发现通过将m23a家族蛋白酶基因导入芽孢杆菌属菌宿主并培养，能够从培养物中高效地生产m23a亚族蛋白酶(专利文献4)。
7.然而，迄今为止还没有利用m23a家族蛋白酶作为皮革制造的酶的报道。
8.〔专利文献1〕国际公开第2001/035901号
9.〔专利文献2〕国际公开第2002/088397号
10.〔专利文献3〕日本特开平4－108387号公报
11.〔专利文献4〕国际公开第2019/142773号


技术实现要素：

12.本发明涉及以下的1)～4)。
13.1)一种皮革处理方法，其中，包括：使m23a亚族蛋白酶或含有其的酶组合物与皮进行接触的工序。
14.2)一种皮革改性剂，其中，将m23a亚族蛋白酶作为有效成分。
15.3)m23a亚族蛋白酶在制造皮革改性剂中的用途。
16.4)m23a亚族蛋白酶在对皮革进行改性中的用途。
附图说明
17.图1是blp的弹性蛋白和胶原蛋白降解活性(相对于塞威(savinase)的相对值)。
18.图2是牛皮的弹性蛋白降解效果(未进行酶处理)。
19.图3是牛皮的弹性蛋白降解效果(塞威(savinase)处理)。红线：弹性蛋白降解部分与残留部分的边界。
20.图4是牛皮的弹性蛋白降解效果(ppe处理)。红线：弹性蛋白降解部分与残留部分的边界。
21.图5是牛皮的弹性蛋白降解效果(blp处理)。
22.图6是牛皮的弹性蛋白降解效果(未进行酶处理)。
23.图7是牛皮的弹性蛋白降解效果(塞威(savinase)处理)。红线：弹性蛋白降解部分与残留部分的边界。
24.图8是牛皮的弹性蛋白降解效果(ppe处理)。红线：弹性蛋白降解部分与残留部分的边界。
25.图9是牛皮的弹性蛋白降解效果(lgblp处理)。
具体实施方式
26.本发明提供涉及一种抑制皮收缩并实现面积扩大效果的皮革改性剂和使用其的皮革处理方法。
27.本发明的发明人发现，以blp为代表的m23a亚族蛋白酶能够高效地降解皮革深部的弹性蛋白，而几乎不降解胶原蛋白，作为发挥抑制皮革收缩效果的酶是有用的。
28.本发明所提供的酶m23a亚族蛋白酶几乎不具有胶原蛋白降解活性，而高效地降解皮深部的弹性蛋白的能力优异。通过将该酶用于皮革处理工序，能够抑制皮收缩并扩大面积。
29.在本说明书中，“皮”是指牛、猪、鹿、羊、马、山羊、袋鼠、鳄鱼等动物的皮。
30.在本说明书中，关于核苷酸序列或氨基酸序列的“至少80％的同一性(identity)”是指80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、更进一步优选97％以上、还优选98％以上、进一步还优选99％以上的同一性。
31.在本说明书中，核苷酸序列或氨基酸序列间的同一性可以利用lipman-pearson法(science，1985，227：1435－41)进行计算。具体而言，可以利用遗传信息处理软件genetyx－win(ver.5.1.1；软件开发)的同源性分析(search homology)程序，将要比较的单元大小(unit size to compare)(ktup)设为2进行分析而算出。
32.在本说明书中，关于氨基酸序列和核苷酸序列上的“相当的位置”，可以通过以对存在于各氨基酸序列或核苷酸序列中的保存氨基酸残基或核苷酸以赋予最大的相同性的方式，使目标序列和参照序列(例如序列号2所示的氨基酸序列)进行匹配(比对)而确定。比对(alignment)可以利用公知的算法实施，其方法对本领域技术人员来说是公知的。例如，
比对可以通过以默认设置使用clustal w多序列比对程序(thompson，j.d.et al，1994，nucleic acids res.22：4673-4680)而进行。或者，也可以使用作为clustal w的修订版的clustal w2或clustal omega。例如，可以在欧洲生物信息研究所(european bioinformatics institute：ebi[www.ebi.ac.uk/index.html])、国立遗传学研究所经营的日本dna数据库(ddbj[www.ddbj.nig.ac.jp/welcome-j.html])的网站上利用clustal w、clustal w2和clustal omega。通过上述比对，与对应于参照序列的任意的位置的位置匹配的目标序列的氨基酸残基或核苷酸的位置视为与该任意的位置“相当的位置”。
[0033]
在本说明书中，调控区与基因的“可操作连接(operable linkage)”是指将基因和调控区以该基因能够在该调控区的控制下表达的方式连接。基因和调控区的“可操作连接”的方法对本领域技术人员是众所周知的。
[0034]
m23a亚族蛋白酶是指，对肽序列中的甘氨酸－甘氨酸键具有降解活性，在按照merops数据库的分类方法(rawlings,neil d.,et al."merops:蛋白质水解酶及其底物和抑制剂的数据库(the database of proteolytic enzymes,their substrates and inhibitors.)"，核酸研究(nucleic acids research)42.d1(2013):d503-d509)进行分类时，归类为m23家族所属的金属蛋白酶的亚族即m23a亚族的蛋白酶。
[0035]
目前，m23a亚族所属的蛋白酶已知有β-裂解金属蛋白酶(beta-lytic metallopeptidase；blp)、lasa蛋白质(las a protein；也称为lasa、葡萄球菌溶血素(staphylolysin))、嗜水气单胞菌蛋白酶(aeromonas hydrophila proteinase；也称为ahp、mername-aa291peptidase)、以及来自胶状溶杆菌(lysobacter gummosus)的blp同源物(wp＿057941690.1、以下称为lgblp)和来自抗生素溶杆菌(lysob acter antibioticus)的blp同源物(wp＿057970430.1、以下称为lablp)等。
[0036]
因此，作为本发明的m23a亚族所属的蛋白酶，包含blp、lasa、ahp、lgblp和lablp、以及与它们具有同等功能的多肽，优选适当地选择并使用它们中的1种以上，更优选使用blp或与blp具有同等功能的多肽。
[0037]
blp(merops id：m23.001)是由序列号2的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽。lasa(merops id：m23.002)是由序列号4的第1～182位的氨基酸序列构成的多肽。ahp(merop s id：m23.003)是由序列号6的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽。另外，lgblp是由序列号8的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽。lablp是由序列号10的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽。
[0038]
另外，作为与该blp、lasa和ahp具有同等功能的多肽，可以列举：由与序列号2的第1～179位、序列号4的第1～182位和序列号6的第1～179位中的任意一个氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0039]
作为与blp具有同等功能的多肽的优选的例子，可以列举：由与序列号2的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列(优选在相当于序列号2的第1～179位的氨基酸序列的22位、121位和123位的位置具有his，且在相当于36位的位置具有asp的氨基酸序列)构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0040]
作为与lasa具有同等功能的多肽的优选的例子，可以列举：由与序列号4的第1～182位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列(优选在相当于序列号4的第1～
182位的氨基酸序列的23位、120位和122位的位置具有his，且在相当于36位的位置具有asp的氨基酸序列)构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0041]
作为与ahp具有同等功能的多肽的优选的例子，可以列举：由与序列号6的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列(优选在相当于序列号6的第1～179位的氨基酸序列的21位、118位和120位的位置具有his，且在相当于34位的位置具有asp的氨基酸序列)构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0042]
另外，作为与lgblp具有同等功能的多肽，可以列举：由与序列号8的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。作为与lablp具有同等功能的多肽，可以列举：由与序列号10的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。其中，关于有无甘氨酸-甘氨酸键降解活性，例如，可以通过对甘氨酸寡肽、实施例中所记载的fret－ggggg底物等的降解性进行试验而进行判定。但是，并不限定于该方法。
[0043]
上述所列举的m23a亚族蛋白酶可以从生产其的微生物或其培养物中提取或制备。例如，blp可以从溶杆菌(lysobacter sp.)(nbrc12725或nbrc 12726)、水解无色杆菌(achromobacter lyticus)m497-1、溶杆菌(lysobacter sp.)ib-9374、胶状溶杆菌(lysobacter gummosus)dsmz 6980等或其培养物中提取或制备；las可以从铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)pa01、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)atcc 10145、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)frd1等或其培养物中提取或制备；ahp可以从嗜水气单胞菌嗜水亚种(aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)atcc 7966、嗜水气单胞菌(切斯特)斯塔尼尔(aeromonas hydrophila(chester)stanier)(atcc51307)等或其培养物中提取或制备。上述微生物可以从公共的微生物保存机构购入。
[0044]
生产该m23a亚族蛋白酶的微生物只要使用含有能够资源化的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下进行培养即可。可以从如此得到的微生物或培养液中，利用一般的方法进行酶的提取、制备，再通过冻结干燥、喷雾干燥、结晶化等得到需要的酶形态。例如，，可以利用如下所述的通常方法从培养物中回收和制备酶：例如，通过离心分离或过滤而分离微生物，通过向上清液或滤液中添加硫酸铵等的盐而使酶沉淀、或者通过向上清液或滤液中添加乙醇等的有机溶剂而使酶沉淀，使用超滤膜等进行浓缩或脱盐，使用离子交换或凝胶过滤等各种色谱进行精制等。
[0045]
或者，利用上述的氨基酸序列(序列号2、4、6)，通过化学合成或生物学方法，能够制造该m23a亚族蛋白酶。例如，根据上述专利文献3中所记载的方法，利用通常的方法从本来生产目标m23a亚族蛋白酶的微生物中提取基因组dna，或者提取rna并通过逆转录合成cdna，以表达如此制备的编码蛋白质的多核苷酸的方式进行转化，对所得到的芽孢杆菌属菌进行培养后，从培养物中制备目标酶，从而能够得到m23a亚族蛋白酶。
[0046]
其中，作为所制备的转化芽孢杆菌属菌，例如，可以列举：将与调控区可操作地连接的m23a亚族蛋白酶基因(序列号1、3、5)导入宿主细胞的基因组中或质粒中而得到的芽孢杆菌属菌，以及，将导入了目标基因的表达载体导入到合适的位置而得到的芽孢杆菌属菌等。
[0047]
其中，基因的“调控区”是指，具有控制该区域的下游基因在细胞内的表达的功能、
优选具有结构上表达或高表达下游基因的功能的区域。具体而言，可以定义为：存在于该基因的编码区的上游，并且具有rna聚合酶相互作用而控制该基因的转录的功能的区域。优选为，基因的调控区是指该基因的编码区的上游200～600核苷酸左右的区域。调控区包含：基因的转录开始调控区和/或翻译开始调控区、或者转录开始调控区至翻译开始调控区的区域。转录开始调控区是包含启动子和转录开始点的区域，翻译开始调控区是相当于与起始密码子一起形成核糖体结合部位的shine－dalgarno(sd)序列的部位(shine,j.,dalgarno,l.,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa.)》,1974,71:1342-1346)。
[0048]
含有m23a亚族蛋白酶基因的表达载体能够稳定保持该基因，能够在宿主微生物内维持复制，并且，可以通过将m23a亚族蛋白酶基因导入能够稳定表达该m23a亚族蛋白酶的载体内而制作。作为这样的载体，例如，可以列举：pha3040sp64、phsp64r或pasp64(日本专利第3492935号)、phy300plk(能够转化大肠杆菌和枯草杆菌双方的表达载体；jpn j genet，1985，60：235－243)、pac3(nucleic acids res，1988，16：8732)等穿梭载体；pub110(j bacteriol，1978，134：318－329)、pta10607(plasmid，1987，18：8－15)等芽孢杆菌属细菌的转化中能够利用的质粒等。另外，还可以使用来自大肠杆菌的质粒(例如pet22b( )、pbr322、pbr325、puc57、puc118、puc119、puc18、puc19、pbluescript等)。
[0049]
宿主芽孢杆菌属菌的转化可以利用原生质体法、感受态细胞法、电穿孔法等进行。作为宿主芽孢杆菌属菌，优选为枯草杆菌或其突变株。例如，可以列举：在m23a成熟化能力充分的范围内减少了细胞外蛋白酶生产的枯草杆菌株等。
[0050]
对于所得到的转化体，只要使用含有能够资源化的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下进行培养即可。可以从如此得到的培养物中，利用一般的方法进行酶的提取、制备，再通过冻结干燥、喷雾干燥、结晶化等而能够得到需要的酶形态。例如，可以利用如下所述的通常方法从培养物中回收和制备酶：通过离心分离或过滤而分离重组微生物，通过向上清或滤液中添加硫酸铵等的盐而使酶沉淀、或者通过向上清或滤液中添加乙醇等的有机溶剂使酶沉淀，使用超滤膜等进行浓缩或脱盐，使用离子交换或凝胶过滤等各种色谱进行精制等。
[0051]
或者，该m23a亚族蛋白酶可以从含有其的酶组合物等中制备。例如，blp可以从消化肽酶(achromopeptidase)中制备。消化肽酶(achromopeptidase)是来自产酶溶杆菌(lysobacter enzymogenes)的溶菌酶，含有blp。消化肽酶(achromopeptidase)已由和光纯药工业株式会社等市售。
[0052]
如后述的实施例中所示，m23a亚族蛋白酶、例如blp是市售的一般的软化酶，与具有弹性蛋白降解性的塞威(savinase，s8家族蛋白酶)具有同等程度的弹性蛋白降解活性，但与塞威(savinase)相比，blp显示能够降解皮深部的弹性蛋白，并且几乎不降解胶原蛋白。
[0053]
在上述专利文献2中，作为抑制胶原蛋白降解并且降解弹性蛋白的方法，提及了有可能对弹性蛋白酶单独处理是有效的。然而，如实施例中所示，确认到：即使使用作为最一般的弹性蛋白酶之一的来自猪胰腺的弹性蛋白酶的精制品(ppe(s1家族蛋白酶))，也无法获得与blp相同的弹性蛋白选择性或对皮革深部弹性蛋白的降解活性。
[0054]
因此，m23a亚族蛋白酶作为用于抑制皮收缩或者用于赋予面积扩大效果的皮革改性用酶、优选为软化用酶是有用的，可以制成皮革改性剂、优选软化剂。
[0055]
在本发明中，“皮革改性”是指降解皮深部的弹性蛋白，并且对皮发挥收缩抑制效果或面积扩大效果。另外，对于“皮革改性剂”而言，只要能够对皮赋予收缩抑制效果或面积扩大效果，则对其使用方式就没有限定，可以在皮革制造的各工序之前、之后或过程中的任意时刻使用，优选在软化工序中使用。
[0056]
其中，软化工序是指在皮革制造中进行的酶处理工序。
[0057]
本发明的皮革改性剂可以为单独的m23a亚族蛋白酶，还可以为含有其的酶组合物。
[0058]
这样的酶组合物可以为粉末等固体组合物，也可以为液体组合物。
[0059]
在含有m23a亚族蛋白酶的酶组合物中，除了包含m23a亚族蛋白酶以外，还可以适当地调配表面活性剂、螯合剂、水溶性聚合物、水混合性有机溶剂、碱剂、有机酸或其盐、m23a亚族蛋白酶以外的其他的酶、酶稳定剂、抗氧化剂、增溶剂、ph调节剂、缓冲剂、防腐剂、香料、盐、醇、糖类、锯末、粘土等。
[0060]
作为表面活性剂，可以使用1种或组合使用2种以上的阴离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂和双性表面活性剂等任意的表面活性剂。该酶组合物中的该表面活性剂的含量优选为0.05～20质量％，更优选为0.1～10质量％％。
[0061]
作为非离子性表面活性剂，例如，可以列举：聚氧亚乙基(聚氧亚烷基)烷基醚，其具有碳原子数8以上且22以下的烃基、优选碳原子数8以上且18以下的直链烷基，并且具有聚氧亚乙基链(该聚氧亚乙基链是将亚乙基氧基以平均1摩尔以上20摩尔以下的数量键合而成的)，并且，根据需要而具有聚亚烷基氧基链(polyalkyleneoxy chain)，该聚亚烷基氧基链是选自亚丙基氧基和亚丁基氧基中的亚烷基氧基以平均0摩尔以上且5摩尔以下的数量与亚乙基氧基以无规或嵌段方式键合而成的；聚氧亚乙基甲基(或乙基)醚脂肪酸酯，其是使1摩尔以上且20摩尔以下的环氧乙烷与碳原子数8以上且22以下的脂肪酸的甲酯或乙酯进行反应而得到的；脂肪酸烷醇酰胺，其是碳原子数8以上且18以下的脂肪酸与伯烷醇胺或仲烷醇胺以1个酰胺键键合而成的，该伯烷醇胺或仲烷醇胺具有1个或2个与氮原子键合的碳原子数为2或3的烷醇基(在该烷醇基上可以具有平均加成摩尔数为1以上且6以下的聚氧亚乙基链)，并且可以具有碳原子数1以上且3以下的烷基；烷基(聚)葡糖苷，其具有碳原子数8以上且22以下的直链或支链的烃基、优选直链烷基，并且葡萄糖的平均缩合度为1以上且3以下；以及，甘油脂肪酸酯、季戊四醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯(其主要以单酯体为主体，其是作为多元醇的甘油、季戊四醇或山梨糖醇酐与脂肪酸通过酯键而成)以及它们的环氧乙烷加成物等。
[0062]
作为阴离子性表面活性剂，例如为具有碳原子数8以上且22以下的烷基或烯基和阴离子性基团的化合物，可以列举：直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸酯盐或烯基硫酸酯盐、聚氧亚乙基(聚氧亚丙基)烷基酸酯盐或聚氧亚乙基(聚氧亚丙基)烯基硫酸酯盐、聚氧亚乙基(聚氧亚丙基)烷基醚羧酸盐或聚氧亚乙基(聚氧亚丙基)烯基醚羧酸盐、α-烯烃磺酸盐、将在2位以上(优选8位以下)具有不饱和键的内部烯烃进行磺酸化而成的物质的盐即内部烯烃磺酸盐(包含has体)、α-磺基脂肪酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯盐、脂肪酸盐、磷酸酯盐类表面活性剂、酰基丙氨酸酯、酰基牛磺酸盐等。
[0063]
其中，作为盐，可以列举与碱金属形成的盐、与碱土金属形成的盐，除了与钾、钠、
钙和镁等形成的盐以外，还可以为与氨或具有碳原子数为2以上且4以下的烷醇基的单烷醇胺、二烷醇胺或三烷醇胺形成的盐，优选为与单乙醇胺等形成的盐。也可以是，在用酸调配后，在体系内调配碱剂或碳酸钠等的强碱弱酸盐进行中和。
[0064]
作为阳离子性表面活性剂，例如，可以列举：季铵盐，其具有1个以上且3个以下的碳原子数为8以上且25以下的长链烷基或长链烯基(该长链烷基或长链烯基的碳键之间可以被酯键、醚键、酰胺键分割)，并且具有选自甲基、乙基、羟基乙基中的短链基团作为剩余基团，并且以氯离子、溴离子、甲基硫酸根离子、乙基硫酸根离子作为平衡离子；叔胺及其酸盐，其具有与上述相同的1个以上且3个以下的长链烷基或长链烯基(该长链烷基或长链烯基的碳键之间可以被酯键、醚键、酰胺键分割)，并且具有选自甲基、乙基、羟基乙基中的短链基团作为剩余基团；单长链烷基三甲基铵盐或单长链烯基三甲基铵盐，其具有碳原子数为8以上且25以下的烷基或烯基；双长链烷基二甲基铵盐或双长链烯基二甲基铵盐；单长链烷基吡啶鎓盐或单长链烯基吡啶鎓盐；单长链烷基酰胺丙基二甲胺或单长链烯基酰胺丙基二甲胺、或其酸盐等。优选为可以列举：具有1个或2个碳原子数8～22的长链烷基的烷基(二或三)甲基季铵的氯盐或乙基磺酸盐；或者，具有1个以上且3个以下的碳原子数为11～25的烷酰基氧基亚乙基并且具有碳原子数1或2的烷基或羟基乙基的季铵的氯盐或乙基硫酸盐；具有1个碳原子数8～22的长链烷基的脂肪酰胺丙基二甲基胺或其酸盐。
[0065]
作为两性表面活性剂，例如，可以列举：具有碳原子数8以上且22以下的烷基或烯基、阴离子性基团和阳离子性基团的化合物，例如，烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、咪唑啉型、烷基氨基砜型、烷基氨基羧酸型、烷基酰胺羧酸型、酰胺氨基酸型或磷酸型的两性表面活性剂等，如烷基乙酸甜菜碱、烷醇酰胺丙基乙酸甜菜碱、烷基咪唑啉、烷基丙氨酸等。优选可以列举具有碳原子数10～18的烷基的磺基甜菜碱或羰基甜菜碱。
[0066]
双性表面活性剂有时也归类为非离子性表面活性剂，作为双性表面活性剂，可以列举因ph而具有极性的具有碳原子数8以上且22以下的烷基或烯基和氧化胺基的化合物。优选可以列举：烷基胺氧化物，其具有1个或2个碳原子数为8以上且22以下的烷基或烯基(该烷基或烯基可以通过酰胺亚丙基与构成氧化胺的氮原子结合)，并且具有2个碳原子数为1以上且3以下的烷基；更优选可以列举：具有碳原子数8以上18以下的烷基的烷基二甲胺氧化物、或具有碳原子数8以上18以下的脂肪酸残基的脂肪族酰胺丙基二甲胺氧化物。
[0067]
作为螯合剂，例如，可以列举出：氮三乙酸、亚氨基二乙酸、乙二胺乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸、羟基乙基亚氨基二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸、黎豆氨酸、甲基甘氨酸二乙酸等的氨基多乙酸或它们的盐；二甘醇酸、氧基二琥珀酸、羧基甲基氧基琥珀酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、苹果酸、氧基二琥珀酸、葡糖酸、羧基甲基琥珀酸、羧基甲基酒石酸等的有机酸或它们的盐；以及，氨基三(亚甲基膦酸)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)和它们的盐。当为盐时，如对阴离子表面活性剂所说明的那样，也可以作为酸性的ph调节剂使用。
[0068]
本发明的酶组合物中的该螯合剂的含量为，以换算成酸型计，优选为0.001～5质量％，更优选为0.005～4质量％。
[0069]
作为水溶性聚合物，例如，可以列举：具有(i)含有来自碳原子数2～5的环氧化物的聚合单元而构成的聚醚链部分和(ii)含有来自选自丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸中的一种以上的不饱和羧酸单体的聚合单元而构成的聚合物链部分，并且，具有(i)或(ii)中的任
一个为主链、且另一个为支链的接枝结构的高分子化合物(日本特开2010－275468号公报、日本特开平10－060496号公报)；具有对苯二甲酸亚烷基酯单元和/或间苯二甲酸亚烷基酯单元以及氧亚烷基单元和/或聚氧亚烷基单元的水溶性聚合物(日本特开2009－155606号公报)等。
[0070]
本发明的酶组合物中的该水溶性聚合物的含量优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5质量％。
[0071]
作为水混合性有机溶剂，例如，可以列举烷醇类、亚烷基二醇类和甘油、聚亚烷基二醇类、(聚)亚烷基二醇(单或二)烷基醚类、烷基甘油醚类、(聚)亚烷基二醇的芳香族醚类。作为烷醇类，优选甲醇、乙醇或丙醇等；作为亚烷基二醇类，优选乙二醇、丙二醇、丁二醇或己二醇等，更进一步优选乙二醇或丙二醇，更优选甘油；作为聚亚烷基二醇类，优选二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、或者可以无规或嵌段聚合的聚乙二醇聚丙二醇，更优选二乙二醇、二丙二醇、聚乙二醇或聚丙二醇。作为(聚)亚烷基二醇(单或二)烷基醚类，优选平均加成摩尔数为1以上且3以下的聚氧亚乙基单丁醚、或平均加成摩尔数为1以上且3以下的聚氧亚丙基单丙醚等，更进一步优选为二乙二醇单丁醚；作为烷基甘油醚类，优选具有碳原子数为1以上且8以下的烷基的烷基(聚)甘油醚，更优选2-乙基己基甘油醚或异戊基甘油醚。作为(聚)亚烷基二醇的芳香族醚类，优选平均加成摩尔数为1以上且3以下的(聚)氧亚乙基单苯醚、或平均加成摩尔数为1以上且3以下的(聚)氧亚乙基苄基醚等，更进一步优选单乙二醇单苯醚、二乙二醇单苯醚、三乙二醇醚单苯醚、乙二醇单苄基醚、二乙二醇单苄基醚。
[0072]
本发明的酶组合物中的该水混合性有机溶剂的含量优选为0.1～40质量％，更优选为0.5～35质量％。
[0073]
作为碱剂，例如作为无机性碱剂，可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等；作为具有1～3个c2－c4的烷醇的烷醇胺，可以列举单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧亚烷基胺、二甲基氨基丙胺等。优选单乙醇胺、三乙醇胺。
[0074]
本发明的酶组合物中的该碱剂的含量优选为0～20质量％、更优选为0～10质量％。
[0075]
作为有机酸或其盐，可以列举上述的螯合剂，也可以为其他的有机酸或其盐。例如，可以列举：饱和脂肪酸、琥珀酸、马来酸、富马酸或它们的盐等的多元羧酸类；柠檬酸、苹果酸、乙醇酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸或它们的盐等的羟基羧酸类等。
[0076]
本发明的酶组合物中的该有机酸或其盐的含量优选为0～5质量％，更优选为0～3质量％。
[0077]
作为m23a亚族蛋白酶以外的其他的酶，例如，可以列举可以作为一般的软化酶使用的如木瓜酶、枯草杆菌蛋白酶、胰酶(即，从牛或猪等的胰腺提取的粗酶)等的蛋白降解酶。
[0078]
作为酶稳定剂，例如，可以列举硼化合物、钙离子源(供钙离子化合物)、羟基化合物、甲酸等；作为抗氧化剂，可以列举丁基羟基甲苯、联苯乙烯化甲酚、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠等；作为增溶剂，可以列举对甲苯磺酸、异丙基苯磺酸、间二甲苯磺酸、苯甲酸盐(也具有作为防腐剂的效果)等。另外，本发明的酶组合物中也可以含有：非水混合性有机溶剂，例如，辛烷、癸烷、十二烷、十三烷等的烷烃类，癸烯、十二碳烯等烯烃类，二氯甲烷、1,1,1-三
氯乙烷等卤代烷基类，d-柠檬烯等萜烯类等；色素；香料；抗菌防腐剂；硅酮等消泡剂；等。
[0079]
对于本发明的酶组合物中的m23a亚族蛋白酶的含量而言，只要是该蛋白酶表现活性的量，就没有特别限制，相对于每1kg酶组合物，优选0.01～500g，更优选0.1～200g，进一步优选1～100g。
[0080]
在另一个方式中，本发明提供一种使用m23a亚族蛋白酶的皮革处理方法。该方法包括：在皮革制造的各工序之前、之后或过程中的任意阶段使m23a亚族蛋白酶或含有其的酶组合物与皮进行接触的工序。例如，作为一个方式，可以列举：使m23a亚族蛋白酶或含有其的酶组合物与经过石灰浸渍、脱灰后的皮进行接触。
[0081]
关于m23a亚族蛋白酶与皮的接触方式，根据皮革的种类和部位适当地选择即可；关于处理温度、处理时间、酶的使用量，也可以根据处理方式而任意地设定。例如，可以列举：将含有m23a亚族蛋白酶或含有其的酶组合物的溶液涂布或散布于皮的表面后，在15～40℃的温度下放置规定时间(1小时～5小时)；或者，在该溶液中浸渍皮后，在15～40℃的温度下放置规定时间(1小时～5小时)。
[0082]
关于上述的实施方式，本发明进一步公开下述方式。
[0083]
＜1＞一种皮革处理方法，其中，包括：使m23a亚族蛋白酶或含有其的酶组合物与皮进行接触的工序。
[0084]
＜2＞如＜1＞所述的方法，其中，m23a亚族蛋白酶为选自下述的a)～e)中的1种以上：
[0085]
a)由序列号2的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、或者由与序列号2的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0086]
b)由序列号4的第1～182位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号4的第1～182位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0087]
c)由序列号6的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号6的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0088]
d)由序列号8的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号8的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0089]
e)由序列号10的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号10的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0090]
＜3＞如＜2＞所述的方法，其中，m23a亚族蛋白酶为选自上述a)、c)、d)和e)中的1种以上。
[0091]
＜4＞一种皮革改性剂，其中，将m23a亚族蛋白酶作为有效成分。
[0092]
＜5＞如＜4＞所述的皮革改性剂，其中，该皮革改性剂为软化剂。
[0093]
＜6＞如＜4＞或＜5＞所述的皮革改性剂，其中，m23a亚族蛋白酶为选自下述的a)～e)中的1种以上：
[0094]
a)由序列号2的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、或者由与序列号2的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0095]
b)由序列号4的第1～182位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号4的第1～182位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0096]
c)由序列号6的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号6的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0097]
d)由序列号8的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号8的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0098]
e)由序列号10的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号10的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0099]
＜7＞如＜6＞所述的皮革改性剂，其中，m23a亚族蛋白酶为选自上述a)、c)、d)和e)中的1种以上。
[0100]
＜8＞m23a亚族蛋白酶在制造皮革改性剂中的用途。
[0101]
＜9＞如＜8＞所述的用途，其中，皮革改性剂为软化剂。
[0102]
＜10＞m23a亚族蛋白酶在对皮革进行改性中的用途。
[0103]
＜11＞如＜8＞～＜9＞中任一项所述的用途，其中，m23a亚族蛋白酶为选自下述的a)～e)中的1种以上：
[0104]
a)由序列号2的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、或者由与序列号2的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0105]
b)由序列号4的第1～182位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号4的第1～182位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0106]
c)由序列号6的第1～179位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号6的第1～179位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0107]
d)由序列号8的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号8的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽；
[0108]
e)由序列号10的第1～178位的氨基酸序列构成的多肽、由与序列号10的第1～178位的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成并且对肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键具有降解活性的多肽。
[0109]
＜12＞如＜11＞所述的用途，其中，m23a亚族蛋白酶为选自上述a)、c)、d)和e)中的1种以上。
[0110]
实施例
[0111]
实施例1：blp和lgblp的制备
[0112]
(1－1)转化株的制作
[0113]
宿主使用枯草杆菌168株(bacillus subtilis marburg no.168株：nature，390，1997，p.249)。分别按照以下的方法导入上述专利文献4的实施例1中所记载的质粒phy－blp2和phy－lgblp。在1ml的lb培养基中接种枯草杆菌168株，以30℃、200rpm振荡培养一晩。在1ml新的lb培养基中接种该培养液10μl，以37℃、200rpm培养3小时。将该培养液离心分离，回收粒料。向粒料中添加含有4mg/ml的溶酶菌(sigma)的smmp(0.5m蔗糖、20mm马来酸二钠、20mm六水合氯化镁、35％(w/v)抗生素培养基3号(antibiotic medium 3)(difco))500μl，以37℃培养1小时。接着，通过离心分离回收粒料，悬浮在400μl的smmp中。将悬浮液33μl和各质粒20ng混合，再添加100μl的40％peg并搅拌，再添加350μl的smmp后，以30℃振荡1小时。将该液200μl涂抹于含有四环素(15μg/ml、sigma)的dm3再生琼脂培养基(0.8％琼脂(和光纯药)、0.5％六水合琥珀酸二钠、0.5％酪蛋白氨基酸工业级(difco)、0.5％酵母提取物、0.35％磷酸二氢钾、0.15％磷酸氢二钾、0.5％葡萄糖、0.4％六水合氯化镁、0.01％牛血清白蛋白(sigma)、0.5％羧甲基纤维素、0.005％锥虫蓝(merck)和氨基酸混液(色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸各10μg/ml)；％为(w/v)％)，以30℃培养3日后，取得所形成的菌落。
[0114]
(1－2)酶生产培养
[0115]
在以终浓度成为15ppm的方式添加有四环素的lb培养基1ml中接种(1－1)中所得到的重组枯草杆菌菌落后，以30℃、150spm培养一晩。第二天，将培养液400μl接种于2
×
l－麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％nacl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、21μm的znso4、15ppm四环素；％为(w/v)％)5ml中，在30℃、150spm培养2日后，通过离心分离回收含有菌体所产生的酶的培养上清液。
[0116]
(1－3)由培养上清液精制酶
[0117]
由(1－2)所得到的培养上清分别精制blp、lgblp。使用amicon ultra(截留分子量10k，merck millipore)，利用10mm柠檬酸钠ph6对培养上清液进行缓冲液交换。使用akta explorer 10s(ge healthcare)，由缓冲液交换后的液体精制酶。首先，将通过该缓冲液交换而得到的液体通入toyopearl gigacap cm－650m柱(东曹)，接着，使用洗脱缓冲液(10mm柠檬酸钠ph6、200mm nacl)使吸附成分洗脱。回收洗脱组分中的确认有fret－ggggg的降解活性(实施例1－4)的组分液。使用amicon ultra(截留分子量10k)，利用20mm的tris－hcl(ph7.5)溶液对所回收的组分液进行缓冲液交换，得到含有blp、lgblp的各酶溶液。
[0118]
(1－4)酶活性的测定
[0119]
作为底物，使用荧光基团nma与淬灭基团lys(dpn)之间为五甘氨酸的fret底物[以下，称作fret－ggggg](向ph japan订购生产)。其中，nma是指2-(n-甲基氨基)苯甲酰基(nma)。另外，lys(dpn)是指在赖氨酸(lys)的侧链具有2,4-硝基苯基(dnp)的物质。在96孔的黑色板中添加酶溶液(适当稀释)2μl、20mm的tris－hcl(ph7.5)200μl，再添加fret－ggggg溶液(1mm的fret－ggggg、100mm的tris－hcl(ph7.5))10μl，从而制备反应液。使用infinite m200(tecan)，以温度30℃、激发波长340nm、测定波长440nm，对反应液的荧光强度进行经时测定。在相同的反应条件下，使用20mm的tris－hcl(ph7.5)代替酶溶液，使用frets－25－std1和frets－25－std2(peptide研究所)的等摩尔溶液代替fret－ggggg，测
定所得到的反应液的荧光强度，从而制作了校正曲线。1单位(u)的活性是指：在将含有1μmol的frets－25－std1和1μmol的frets－25－std2的溶液的荧光强度设为x时，显示x/min的荧光强度的变化所需的酶量。求出酶溶液的fret－ggggg降解活性(u/ml)。
[0120]
(1－5)酶溶液的浓度测定
[0121]
酶溶液的浓度测定中使用dc蛋白质检测试剂盒(dc protein assay kit，bio－rad)。用于算出蛋白质量的标准液使用bsa标准溶液(bsa standard solution，wako)。
[0122]
实施例2：弹性蛋白和胶原蛋白的降解活性的测定
[0123]
作为蛋白酶，使用blp、lgblp、塞威(savinase，sigma、p3111)和来自猪胰腺的精制弹性蛋白酶(以下ppe)(worthington biochemical、esff)。包含塞威(savinase)的来自芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶为一般的软化酶(tanning chemistry：the science of leather)。
[0124]
作为底物，使用来自牛头韧带的弹性蛋白(sigma、e1625)、来自牛跟腱的胶原蛋白(sigma、c9879)。向含有20mg底物的1ml的50mm的tris－hcl(ph7.5)中以终浓度成为1mg/l的方式添加各酶。在30℃进行1小时反应后，以4℃、15000rpm进行5分钟离心，回收上清液。使用takara bca蛋白检测试剂盒(takara bca protein assay kit，takara)对上清液中的肽进行定量。将未添加的样品作为空白，通过减去空白的值，算出因蛋白酶活性而游离的肽量。将该值作为降解活性，以相对于塞威(savinase)的相对值示于图1。
[0125]
blp显示了与塞威(savinase)同等的弹性蛋白降解活性，但blpd胶原蛋白降解活性与塞威(savinase)相比显著低。lgblp显示了比塞威(savinase)低的弹性蛋白降解活性，但lgblp对弹性蛋白的选择性与blp一样高。ppe显示了比塞威(savinase)低的弹性蛋白降解活性和胶原蛋白降解活性。另外，ppe的对弹性蛋白和胶原蛋白的选择性与塞威(savinase)同等。
[0126]
实施例3：blp的牛皮降解试验
[0127]
(3－1)软化用牛皮的制备
[0128]
将经过刮肉、脱毛、石灰浸渍结束后的牛皮切成1.5cm见方后使用。将12个皮片放入1个离心沉降管中，浸在含有皮重量的3％(w/w)的氯化铵的氯化铵水溶液40ml中，室温下培养60分钟，从而进行脱灰。利用50mm的tris－hcl(ph7.5)对脱灰后的皮片进行一次冲洗后，将其用于以下的试验。
[0129]
(3－2)牛皮的蛋白酶处理
[0130]
向5ml的加入了50mm的tris－hcl(ph7.5)的螺旋管瓶(27mm
×
55mm)内放入(3－1)中所制作的皮片各2个。以终浓度成为50mg/l的方式向该螺旋管瓶内添加蛋白酶(塞威(savinase)、ppe、blp)，开始反应。以30℃、150spm培养4小时后，将各皮片移入10ml的0.1m硫酸中，从而停止反应。
[0131]
(3－3)组织染色
[0132]
使用(3－2)的蛋白酶处理后的皮片制作蜡块。将蜡块薄切后，制作地衣红染色标本，进行显微镜观察。通过地衣红染色，弹性蛋白被染成黑褐色。在只用缓冲液进行了处理的样品(图2)中，在银面观察到弹性蛋白的分布。在塞威(savinase)处理后的样品(图3)和ppe处理后的样品(图4)中，观察到只有银面的表面部分的弹性蛋白被降解(在弹性蛋白降解部分与残留部分的边界画了红线)。在blp处理后的样品(图5)中，深部的弹性蛋白也被降
解，在比图5的视野更靠向下侧的位置，也没有观察到弹性蛋白残留。在图2～5中，将分别独立地进行了蛋白酶处理的2个皮片的组织染色图像，各显示1个(分别是右图和左图)。
[0133]
实施例4：lgblp的牛皮降解试验
[0134]
按照与(3－1)相同的方法制备了皮片。向分注了2ml的50mm的tris－hcl(ph7.5)的12孔微型板中各放入所制备的皮片1个。向各孔中添加蛋白酶(塞威(savinase)、ppe、lgblp)，开始反应。添加浓度分别为显示与塞威(savinase)50mg/l同等的弹性蛋白降解活性的浓度(根据实施例2的结果进行计算)。以30℃、150spm培养4小时后，将各皮片移入10ml的0.1m硫酸中，从而停止反应。按照与(3－3)相同的方法制作地衣红染色标本，进行显微镜观察。在只用缓冲液进行了处理的样品(图6)中，在银面观察到弹性蛋白的分布。在塞威(savinase)处理后的样品(图7)和ppe处理后的样品(图8)中，观察到只有银面的表面部分的弹性蛋白被降解(在弹性蛋白降解部分与残留部分的边界画了红线)。在lgblp处理后的样品(图9)中，深部的弹性蛋白也被降解，在比图9的视野更靠向下侧的位置，也没有观察到弹性蛋白的残留。