用作杀菌剂的植物检疫组合物的制作方法

用作杀菌剂的植物检疫组合物


背景技术：

1.世界各地的许多科学研究都指出，21世纪的农业问题对气候变化特别敏感，这导致了植物病原菌的传播。因此，在农业生产中明确而迫切的需要遏制此类风险。
2.桉树油已被描述为可用作昆虫和其它动物驱避剂(us20110171278a1)。
3.e.r.hendry等描述了氯己定二葡糖酸盐和桉树油的协同抗菌作用(journal of antimicrobial chemotherapy(2009)64,1219-1225和int j mol sci.2012；13(11):14016-14025)。
4.至今，尽管已经以一般方式或与其它活性成组合描述了桉树油的抗菌活性，但尚未描述在植物保护中可有效抵抗多种细菌感染的基于桉树油的稳定、环保且易于使用的组合物。
5.因此，需要新的组合物，它们对环境更友好，同时在防止植物作物中的细菌感染方面非常有效。同样，这些组合物必须在高浓度和室温下稳定，并且一旦稀释用于植物，它们设法防止细菌生长而不对处理过的植物有毒。


技术实现要素：

6.本发明提出了针对上述问题的解决方案，因为本发明描述了高效且环境友好的杀菌植物检疫组合物。发明人已经发现，以一定的浓度使用源自蓝桉树(eucalyptus globulus)的桉树油对抵抗严重影响果树和一些园艺树的多种细菌感染非常有效。
7.本发明涉及一种液体组合物，其包含足够量的桉树油以使得组合物包含5至80％w/v的1,8-桉树脑以在植物保护中作为杀菌剂，其中所述组合物在水中稀释至0.01至12重量％后应用于植物。在一个实施方式中，所述组合物在水中稀释至0.02至12、0.05至12、0.10至10、0.20至10、0.50至10、1至10、2至8、3至7重量％后应用于植物。在优选的实施方式中，所述组合物在水中稀释至3-5重量％或至4重量％后应用于植物。在本领域中，通常以体积％制备稀释液。在这个意义上，本发明是指将本发明的组合物稀释至0.01至12体积％之后应用。在一个实施方式中，所述组合物在水中稀释至0.02至12、0.05至12、0.10至10、0.20至10、0.50至10、至10、2至8、3至7体积％后应用于植物。在优选实施方式中，所述组合物在水中稀释至3-5体积％或至4体积％后应用于植物。例如，本技术描述了通过灌溉施用0.4体积％的稀释液并且有效对抗扁桃树中的叶缘焦枯病菌(x.fastidiosa)。在本领域中，这相当于稀释4升/公顷，考虑到每公顷(10,000m2)使用1,000升。
8.本发明的组合物可以制备成或多或少浓缩的，随后稀释后使用，优选通过喷雾施用于植物。这种稀释在水中进行，通常在本领域中进行。因此，为了便于其处理，在施用前将浓缩组合物原位稀释是有利的。如实施例中所述，已经优选地以提供20％w/v 1,8-桉树脑的桉树油浓度测试了本发明的组合物，其使用后按不同比例稀释。
9.在优选实施方式中，该组合物在水中稀释至0.1至5重量％后施用于植物。在更优选的实施方式中，该组合物在水中稀释至0.2至1.0重量％后施用于植物。在优选的实施方式中，该组合物在水中稀释至0.1至5体积％后施用于植物。在更优选的实施方式中，该组合
物在水中稀释至0.2至1.0体积％后施用于植物。
10.在优选的实施方式中，所述组合物不包含氯己定(洗必泰，chlorhexidine)。优选地，其不包含氯己定二葡糖酸盐。在本发明的优选实施方式中，所述组合物不包含印度苦楝树油(nim tree oil)或印楝树油(neem tree oil)。在优选的实施方式中，该组合物不包含百里香油。
11.如本文所用，术语“1,8-桉树脑”是指桉油精或1,3,3-三甲基-2-氧杂双环[2,2,2]辛烷，这是桉树油中的主要化合物。如本文所用，术语“桉树油”是指通过蒸馏蓝桉树的树枝和叶子而获得的油。
[0012]
在第一方面的优选实施方式中，用于在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物被用于抵抗叶缘焦枯病菌(xylella fastidiosa)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、草莓角斑病菌(xanthomonas fragariae)、地毯草黄单胞菌(xanthomonas axonopodis)、树生黄单胞菌(xanthomonas arbor
í
cola)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)或它们的任意组合的感染。优选地，其用于抵抗叶缘焦枯病菌或丁香假单胞菌的感染。
[0013]
已证明本发明的组合物对由上述细菌引起的感染非常有效，尤其是突出了抵抗叶缘焦枯病菌感染获得的出色结果。
[0014]
在另一优选实施方式中，第一方面的组合物应用于果树和园艺树，优选应用于葡萄树(grapevine)、橄榄树、扁桃树、榛树、胡桃树、猕猴桃树、番茄(西红柿，tomato)、草莓、马铃薯(土豆，potato)、桃树、杏树、李树、橙树、柠檬树、橘树、苹果树、梨树、榲桲树(木梨，quince)、咖啡树。优选地，保护应用于梨树、扁桃树或橄榄树。
[0015]
在第一方面的优选实施方式中，用于在植物保护中作为杀菌剂的组合物包含足够量的桉树油以使该组合物包含15至25％w/v的1,8-桉树脑。优选地，其包含足够量的桉树油以使所述组合物包含16至24或17至23或18至22或19至21％w/v的1,8-桉树脑。
[0016]
在第一方面的优选实施方式中，在植物保护中作为杀菌剂的组合物以足以使得该组合物包含20％w/v 1,8-桉树脑的量包含桉树油。
[0017]
在第一方面的优选实施方式中，在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物包含40至70％w/v的一种或多种稀释剂。稀释剂可以选自水、植物油或动物油、或脂肪酸及其酯的混合物、至少一种石蜡矿物油、至少一种c
16-c
18
甲酯、至少一种c
1-c5醇、环己酮、苯乙酮、二甲苯、芳香族石脑油或它们的混合物。优选地，至少一种稀释剂是水。在优选的实施方式中，该组合物包含40至70％w/v的水。优选地，其包含45至65或40至65或45至60或45至55％w/v的水。
[0018]
在第一方面的优选实施方式中，在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物包含1.00至8.00％w/v的一种或多种表面活性剂。在一个实施方式中，所述组合物包含1至7或2至7或3至6或3至5％w/v的一种或多种表面活性剂。
[0019]
在第一方面的优选实施方式中，在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物0.10至1.00％w/v的一种或多种抗氧化剂。在一个实施方式中，所述组合物包含0.20至0.90或0.30至0.80或0.40至0.80或0.20至0.80％w/v的一种或多种抗氧化剂。
[0020]
在主要稀释剂是水的情况下，组合物可包含至多15％w/v的共稀释剂(codiluent)，该共稀释剂选自植物油或动物油或者脂肪酸与其酯的混合物、至少一种石蜡型矿物油、至少一种c
16-c
18
甲酯、至少一种c
1-c5醇、环己酮、苯乙酮或它们的混合物，但优选
地，共稀释剂是植物油。
[0021]
在第一方面的优选实施方式中，在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物进一步包含至少一种稀释剂、至少一种表面活性剂、至少一种抗氧化剂和至少一种增粘剂(粘化剂，viscosizer)，所述增粘剂的量足以使得所述组合物的粘度为500至5000cp，根据cipac mt 192法、使用旋转粘度计、以针2、在20rpm下且在25℃下计算。
[0022]
在第一方面的优选实施方式中，用于在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物包含0.10至5.00％w/v的一种或多种增粘剂。在一个实施方式中，所述组合物包含0.20至5.00或0.50至5.00或0.50至4.00或1.00至3.00％w/v的一种或多种增粘剂。
[0023]
在第一方面的优选实施方式中，根据cipac mt 187方法通过激光衍射测量，用于在植物保护中作为杀菌剂的所述组合物具有0.1至5微米的d10和0.8至50微米的d90的粒径的体积分布。
[0024]
本发明的第二方面涉及一种包含桉树油、至少一种稀释剂、至少一种表面活性剂和至少一种抗氧化剂的液体组合物，所述桉树油的量足以使得所述组合物包含10至30或15至25或18至22或20％w/v的1,8-桉树脑。
[0025]
在第二方面的优选实施方式中，桉树油是该组合物中唯一具有杀菌作用的成分。
[0026]
本发明的组合物在室温下稳定至少24个月。这意味着它可以保持其粘度特性、粒度、ph值等且此外，最重要的是，当在室温下保持至少24个月时仍能保持其有效性。
[0027]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物不包含印度苦楝树油或印楝树油。在优选的实施方式中，该组合物不包含百里香油。
[0028]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含足够量的桉树油以使得所述组合物包含16至25％w/v的1,8-桉树脑。优选地，所述组合物包含足够量的桉树油以使便所述组合物包含18.00至22.00％w/v的1.8-桉树脑。在更优选的实施方式中，所述组合物包含足够量的桉树油以使所述组合物包含20％w/v的1,8-桉树脑。
[0029]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含40至70％w/v的一种或多种稀释剂。优选地，至少一种稀释剂是水。优选地，其包含45至65或40至65或45至60或45至55％w/v的水。在第二方面的优选实施方式中，该组合物包含40至70％w/v的水。优选地，水是渗透水。
[0030]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含1.00至8.00％w/v的一种或多种表面活性剂。在一个实施方式中，该组合物包含1至7或2至7或3至6或3至5％w/v的一种或多种表面活性剂。
[0031]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含0.10至1.00％w/v的一种或多种抗氧化剂。在一个实施方式中，该组合物包含0.20至0.90或0.30至0.80或0.40至0.80或0.20至0.80％w/v的一种或多种抗氧化剂。
[0032]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物还包含足够量的至少一种增粘剂以使得所述组合物的粘度为根据cipac mt 192方法、用旋转粘度计、以针2、在20rpm下且在25℃下计算的500至5000cp。在第二方面的优选实施方式中，该组合物包含0.10至5.00％w/v的一种或多种增粘剂。在一个实施方式中，该组合物包含0.20至5.00或0.50至5.00或0.50至4.00或1.00至3.00％w/v的一种或多种增粘剂。在第二方面的优选实施方式中，该组合物包含足够量的增粘剂以使得组合物的粘度为根据cipac mt 192方法、用旋转针式粘度计2、在
20rpm下且在25℃下计算的500至1500cp。
[0033]
在第二方面的优选实施方式中，根据cipac mt 187方法通过激光衍射测量，所述组合物具有0.1至5微米的d10且0.5至50微米的d90，优选0.1至2微米的d10且0.5至8微米的d90的体积粒度分布。
[0034]
在第二方面的优选实施方式中，除了水之外，所述组合物还包含选自以下项的另一种共稀释剂：至少一种植物油或动物油或者脂肪酸与其酯的混合物、至少一种石蜡型矿物油、至少一种c
16-c
18
甲酯、至少一种c
1-c5醇、环己酮、苯乙酮、二甲苯、芳香族石脑油或它们的混合物。
[0035]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含作为稀释剂的水和至少一种植物油。优选地，所述组合物包含作为稀释剂的水和芝麻油。
[0036]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含选自从乙氧基化蓖麻油、乙氧基化脱水山梨糖醇酯(聚山梨醇酯)、聚乙氧基化脂肪醇的衍生物、聚芳苯基醚磷酸酯、高分子量且低亲水亲油平衡(hlb)的聚合物表面活性剂以及由环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物组成的高hlb聚合物表面活性剂中的至少一种作为表面活性剂。
[0037]
在第二方面的优选实施方式中，所述组合物包含选自聚乙氧基化脂肪醇的衍生物、聚芳苯基醚磷酸酯、高分子量且低hlb的高分子表面活性剂以及由环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物形成的高hlb聚合物表面活性剂中的至少一种作为表面活性剂。
[0038]
在第三方面，本发明涉及第二方面的组合物，用于作为植物检疫产品的用途。优选地，用作保护植物的杀菌剂，优选用于保护果树和园艺树，更优选用于保护葡萄树、橄榄树、扁桃树、榛树、胡桃树、猕猴桃树、番茄、草莓、马铃薯、桃树、杏树、李树、橙树、柠檬树、橘树、苹果树、梨树、榲桲树、咖啡或它们的任意组合。
[0039]
在第三方面的优选实施方式中，第二方面的组合物用于作为植物保护中的杀菌剂的用途，优选用于保护果树和园艺树，更优选用于保护葡萄树、橄榄树、扁桃树、榛树、胡桃树、猕猴桃树、番茄、草莓、马铃薯、桃树、杏树、李树、橙树、柠檬树、橘树、苹果树、梨树、榲桲树、咖啡树或它们的任意组合，抵抗叶缘焦枯病菌、丁香假单胞菌,草莓角斑病菌,地毯草黄单胞菌,树生黄单胞菌,解淀粉欧文氏菌或它们的任意组合的感染，优选抵抗叶缘焦枯病菌或丁香假单胞菌的感染。优选地，感染是叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种(subesp.fastidiosa)或多元亚种(subesp.multiplex).
附图说明
[0040]
图1.解淀粉欧文氏菌的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml为单位显示存活率，且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。(
‑‑‑
)，技术的检测限。
[0041]
图2.树生黄单胞菌李变种(x.arboricola pv.pruni)的存活率取决于与产品接触30分钟(左要)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率，且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。(
‑‑‑
)，技术的检测限。
[0042]
图3.地毯草黄单胞菌疮痂致病变种(x.axonopodis pv.vesicatoria)的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。(
‑‑‑
)，技术的检测限。
[0043]
图4.丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(p.syringae pv.actinidiae)的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。(
‑‑‑
)，技术的检测限。
[0044]
图5.丁香假单胞菌番茄致病变种(p.syringae pv.tomato)的存活率取决于与产品接触30分钟(左侧条)和2小时(右侧条)后应用的处理.纵坐标以log cfu/ml显示存活率并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。(
‑‑‑
)，技术的检测限。
[0045]
图6.叶缘焦枯病菌保卡亚种(x.fastidiosa subsp.pauca)的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。
[0046]
图7.叶缘焦枯病菌多元亚种(xylella fastidiosa subsp.multiplex)的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率，并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、氨苄青霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。
[0047]
图8.叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种(xylella fastidiosa subsp.fastidiosa)的存活率取决于与产品接触30分钟(左条)和2小时(右条)后应用的处理。纵坐标以log cfu/ml显示存活率并且横坐标轴显示以μl/ml为单位的产品浓度、链霉素(100mg/l)和对照(cnt)。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。
[0048]
图9.使用产品处理对用5x10
7 cfu/ml解淀粉欧文氏菌悬接液接种的、会议品种的梨树植物中由解淀粉欧文氏菌引起的感染严重程度的影响。条对应于每次处理的三个重复的平均值。误差条表示考虑标准偏差的置信区间。不同的字母指示存在关于根据waller-duncan检验见证的显著差异。这些结果对应于第一次试验(a)和第二次试验(b)。egl2 ec是本发明的产品并且包含为使产品具有20％w/v 1,8-桉树脑所需量的按树油、至少一种稀释剂、至少一种表面活性剂、至少一种抗氧化剂和至少一种增粘剂。
[0049]
图10.用产品处理对扁桃树植物中由叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种引起的感染严重程度的影响。条对应于每次处理的三个重复的平均值。误差条表示考虑标准偏差的置信区间。不同的字母指示存在关于根据waller-duncan检验见证的显著差异。egl2 ec是本发明的产品并且包含为使产品具有20％w/v 1,8-桉树脑所需量的桉树油、至少一种稀释剂、至
少一种表面活性剂、至少一种抗氧化剂和至少一种增粘剂。
[0050]
图11.叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种的存活率取决于如实施例8所述30分钟和2小时(在每一对列中，左边对应30分钟且右边对应2小时)后应用的处理。条代表在每次处理和时间执行的三个重复中观察到的值的平均值。误差条显示考虑标准偏差的置信区间。
具体实施方式
[0051]
通过参考以下实施例将更好地理解本发明，但本领域技术人员将容易理解，详细的具体实施例仅用于说明本发明。
[0052]
实施例1：组合物
[0053]
以下是本发明的一些组合物，其中每种组分的量以％w/v表示。
[0054][0055]
*％w/v是指以％w/v为单位的1,8-桉树脑的量，因此所述组合物包含所需量的源
自蓝桉树的桉树油，以便通过hplc定量包含所需w/v百分比的1,8-桉树脑。
[0056]
组合物在用于植物保护之前必须稀释。一旦以1％稀释在水(w/v)中，这些组合物在室温(25℃)呈现出4.00至6.50的ph。
[0057]
在组合物9至15中，主要稀释剂是渗透水。此外，任选地将植物油和/或动物油或者脂肪酸与其酯的混合物、石蜡矿物油、16至18个碳的甲酯、1至5个碳原子的醇、或其它如环己酮或苯乙酮用作共稀释剂。使用的表面活性剂是从乙氧基化蓖麻油、乙氧基化脱水山梨糖醇酯(聚山梨醇酯)、聚乙氧基化脂肪醇的衍生物如乙氧基化三苯乙烯酚、聚芳苯基醚磷酸酯(胺盐)、高分子量且低亲水亲油(hlb)平衡的聚合物表面活性剂、和由环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物形成的高hlb聚合物表面活性剂中选择的至少一种。
[0058]
根据cipac mt 187方法使用mastersizer 3000e(光学装置)和hydro sm分散装置分析组合物的粒度。所有组合物的dv10在0.1和5微米之间，并且dv90在0.5和50微米之间。
[0059]
根据cipac mt 192方法使用旋转粘度计以针2、20rpm在25℃下分析组合物的粘度(brookfield设备型号dv1mlvtj0)。所有组合物的粘度在500和5000cp之间，或在500和1500cp之间。
[0060]
实施例2：通过在琼脂中的掺入试验评估抗微生物活性
[0061]
针对检疫性植物病原菌测试本发明产品。所测试的产品以使得最终组合物具有20％w/v 1,8-桉树脑的量包含桉树油(通过hplc测量)并且在室温下保存。
[0062]
针对来自植物健康创新发展中心检疫病原菌保藏中心(cidsav)、来自欧洲感染灶或来自西班牙类型保藏中心的11种植物病原菌株测试了产品的功效(表1)。
[0063]
表1.抗菌活性测试中使用的植物病原菌株的描述
[0064][0065]
接种物获自在bcye琼脂培养基(叶缘焦枯病菌的三个亚种的情况下)、培养基b琼脂(对于草莓角斑病菌)和培养基lb琼脂(对于其余的检疫植物病原细菌)中接种后活跃生长菌株的纯培养物。然后将它们在28℃下温育48小时。在叶缘焦枯病菌的情况下，温育时间为7-10天。每种细菌悬浮液制备为最终浓度1x10
8 cfu/ml。
[0066]
针对11种细菌病原体测试了5种剂量产品的抗菌活性。具体地，使用以下浓度：120、60、30、10和5μl/ml的产品。此外，将效果与浓度为100mg/l的抗生素链霉素的效果进行了比较。还添加了未经处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。
[0067]
为了进行测试，制备了固体培养板，其中产品以相应的剂量掺入。对于每个菌株，
使用适当的培养基。然后在每个板上沉积一滴10μl的108cfu/ml的相应的菌悬液。然后让板干燥并在28℃下温育48小时。在叶缘焦枯病菌的情况下，温育时间增加了7-10天。此后，在每个测试剂量中观察细菌生长，并与未处理的对照进行比较，所述对照对应于在没有产品的培养基中温育的病原体的细菌悬浮液。对于每个处理，进行2次重复。
[0068]
通过测定最低抑菌浓度来确定产品的体外抑菌活性。此外，将所述产品的效果与参考杀菌剂链霉素的效果进行了比较。先前，已确认产品中不存在污染微生物，这可能会干扰测试。
[0069]
表2显示了所述产品针对11种植物病原细菌的抑制活性的总结。
[0070]
一般来说，观察到的抗菌活性取决于产品的浓度和使用的病原体。叶缘焦枯病菌的三个亚种是对产品处理最敏感的菌株，因为在最低测量剂量下(5μl/ml)，抑制了细菌生长。
[0071]
相比之下，解淀粉欧文氏菌是最具耐药的病原体，在60μl/ml的产品浓度下观察到生长(mic 60-120μl/l)。
[0072]
抗生素链霉素(100mg/l)抑制了所有测试的病原体的生长。
[0073]
温育48小时后，在没有产品的对照板中可以观察到所有菌株的生长。
[0074]
表2.5种测试剂量的产品针对11种检疫植物病原细菌的体外抗菌活性。显示了两次重复获得的结果。
[0075]
strep：用作抗菌对照的链霉素(100mg/l)；
[0076]
：细菌生长与在未处理对照中观察到的相同
[0077]
/-：细菌生长低于在未处理对照(cnt)中观察到的细菌生长
[0078]-：没有观察到细菌生长。
[0079][0080]
最低抑菌浓度(mic)确定为在实验结束时没有发生细菌生长的最低产品浓度。表3示出了针对不同菌株的mic的值(范围)。
[0081]
表3.针对11种检疫植物病原细菌获得的最低抑菌浓度(mic)
[0082][0083]
据观察，解淀粉欧文氏菌的mic为剂量120至60μl/ml。丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种和青枯雷尔氏菌呈现的mic值为30至60μl/ml。对于树生黄单胞菌李变种、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种，mic为10至30μl/ml。草莓角斑病菌(在重复中的一个中)和叶缘焦枯病菌的三个亚种的mic小于5μl/ml。
[0084]
总之，该产品对所研究的11种植物病原菌株的mic范围为5-60μl/ml(5-60ppm)。如
果我们将体外获得的mic外推用于田间使用(约10x cmi)，则所需剂量将在植物检疫应用的通常范围内(50-100ppm)。
[0085]
总之，该产品对测试的11种植物病原细菌具有抗菌活性。
[0086]
实施例3：通过接触试验评估杀菌活性
[0087]
针对来自检疫病原体cidsav保藏中心、来自感染灶或来自西班牙类型保藏中心的以下5种植物病原菌株评价了产品的功效。所测试的产品以足以具有20％w/v 1,8-桉树脑的量包含桉树油(通过hplc测量)并且存储在室温下。
[0088][0089]
接种物取自接种于lb琼脂培养基并在28℃下培养24小时后的活跃生长菌株的纯培养物。每种细菌悬浮液制备为最终浓度1x10
8 cfu/ml。
[0090]
评价了5种剂量该产品的杀菌活性。对于每种植物病原体，根据先前在抗菌活性评估中获得的结果(实施例2)测试了不同的浓度。
[0091]
表4.接触测试的杀菌活性试验中使用的浓度，选自抗菌活性测试(mic)
[0092]
植物病原细菌mic(μl/ml)接触测试的浓度(μl/ml)解淀粉欧文氏菌60-120120、60、40、20和10树生黄单胞菌李变种10-3040、30、15、7.5和3.75丁香假单胞菌猕猴桃致病变种10-3040、30、15、7.5和3.75丁香假单胞菌番茄致病变种30-6060、40、30、15和7.5地毯草黄单胞菌疮痂致病变种10-3040、30、15、7.5和3.75
[0093]
此外，将产品的效果与浓度为100mg/l的抗生素链霉素的效果进行了比较。还添加了未经处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。
[0094]
通过与液体培养基中的细菌悬浮液进行接触测试，进行了不同浓度针对不同植物病原细菌的杀菌活性的确定。接触测试包括将每次处理的100μl与100μl浓度为108cfu/ml的细菌悬浮液混合，在板的每个孔中获得200μl的最终体积(细菌悬浮液终浓度为5x10
8 cfu/ml)。不同剂量的产品和链霉素均制备为两倍浓缩(2x)以在每个孔中获得所需的最终浓度。
[0095]
在连续搅拌(150rpm)下在28℃下温育多孔板。在细菌与产品接触30分钟(min)和2小时(h)时，通过计算菌斑中的活菌数来分析其存活率。在28℃下温育48h后对菌落形成单位(cfu)进行计数，确定每次处理的每种植物病原细菌的存活率(cfu/ml)，并且将其与未处理的对照进行比较。每个处理分析三个重复。
[0096]
从每个处理获得的存活率(cfu/ml)，确定最低杀菌浓度(mbc)和对半数细菌种群致死的剂量(ld50)。mbc被确定为与产品一起温育后，在实验结束时未观察到细菌生长的最低产品浓度。对于ld50的计算，通过probit函数转换相对于浓度的存活数据，调整为直线，并进行插值，以获得仅观察到一半初始细菌群的浓度。
[0097]
通过接触测试评估了不同浓度的产品针对解淀粉欧文氏菌、树生黄单胞菌李变种、地毯草黄单胞菌疮痂致病变种、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种和丁香假单胞菌番茄致病变种的杀菌活性，其中将每种细菌的悬浮液与每种浓度的产品一起温育，并在30和120分钟后取样。从制备每种悬浮液的系列稀释液和随后接种lb琼脂平板中在28℃下温育48小时，我们开始计数可生长的活菌数(存活的菌落)。
[0098]
一般来说，观察到的杀菌活性取决于产品浓度、接触时间和使用的病原体。通过增加浓度和与病原体接触的时间来增加产品的杀菌活性。
[0099]
以下是不同剂量的产品对被测植物病原体的杀菌效果：
[0100]
解淀粉欧文氏菌
[0101]
图1示出了相对于产品浓度和接触时间，解淀粉欧文氏菌的存活率。在与产品egl2 ec接触后，在所评估的五个剂量下，在两次测试(30分钟和2小时)的任何一次中都没有观察到ea的生长。在未经处理的对照中存活率为100％。
[0102]
在与浓度为100mg/l的参比抗生素接触30分钟和2小时后，观察到了解淀粉欧文氏菌存活度的显著降低。
[0103]
在暴露30min时，产品的最低测试浓度(10μl/ml，100％死亡率)比参比抗生素链霉素具有更高的杀菌活性。
[0104]
树生黄单胞菌李变种
[0105]
图2示出了树生黄单胞菌李变种的存活率相对于所应用的处理和所研究的接触时间的图。在与产品接触30min时，在15μl/ml的剂量下未观察到存活的树生黄单胞菌李变种。然而，在与30或40μl/ml的剂量接触30min时，观察到7.8％和20.01％的平均细菌存活率，尽管这些结果在重复之间存在较高的可变性(图2)。在与浓度为40、30和15μl/ml的产品接触2小时时，未观察到树生黄单胞菌李变种的生长。
[0106]
在7.5和3.75μl/ml的浓度下，未观察到树生黄单胞菌李变种存活率随时间的显著差异。在这两种情况下，相对于未处理的对照，观察到细菌存活率显着降低(3.75μl/ml剂量的存活率为13.06％；7.5μl/ml剂量为0.99％；未处理的对照中为100％)。
[0107]
在暴露于链霉素30分钟时，定量到0.01％的平均存活率，在三个重复之间观察到高度可变性。然而，在暴露2小时时，在任一重复中均未观察到存活的树生黄单胞菌李变种。
[0108]
地毯草黄单胞菌疮痂致病变种
[0109]
图3示出了取决于所研究的治疗和接触时间的地毯草黄单胞菌疮痂致病变种的存活率。在与产品接触30分钟和2小时时，在15、30或40μl/ml的浓度下均未观察到细菌生长，呈现出比抗生素链霉素更大的杀菌活性。在7.5和3.75μl/ml的浓度下，两次测试之间未观察到显著差异，仅观察到相对于浓度为7.5μl/ml的未处理对照的细菌存活率降低。具体地，在7.5μl/ml下的存活率值类似于使用抗生素链霉素观察到的值(在产品7.5μl/ml 2h下的存活率为8.2％；100mg/l链霉素的存活率为3.06％)。
[0110]
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种
[0111]
图4显示了取决于所研究的处理和接触时间的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的存活率。
[0112]
在浓度为40、30、15和7.5μl/ml的产品和链霉素中，两次测试中均未观察到细菌生长。尽管在3.75μl/ml下在30分钟和2小时时观察到了存活的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种
(0.1％存活率)，与未处理的对照(100％存活率)相比，观察到生长显著减少。
[0113]
丁香假单胞菌番茄致病变种
[0114]
图5示出了取决于所研究的处理和接触时间的丁香假单胞菌番茄致病变种的存活率。
[0115]
在浓度为60、40、30、15μl/ml的产品和链霉素中，两次测试均未观察到细菌生长。在30分钟时，在最低浓度的测试产品(7.5μl/ml)中仅观察到0.0002％的植物病原体存活，并且相对于未处理的对照，仅在三个重复中的一个中观察到。在2小时时，与未处理的对照相比，在任何测试浓度或抗生素链霉素中均未观察到生长。
[0116]
与所测的五种植物病原细菌相比，该产品显示出不同的杀菌活性：在30分钟和2小时，解淀粉欧文氏菌呈现出了低于10μl/ml的cmb值，为该病原体的最低测试浓度。在研究的两次测试中，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的cmb为剂量3.75-7.5μl/ml。测试的最低剂量显示产品的快速杀菌活性(在30分钟时观察到接近100％的死亡率)。对于丁香假单胞菌番茄致病变种，在与产品接触30分钟时的cmb在7.5至15μl/ml之间，在接触2小时后降低至低于7.5μl/ml。树生黄单胞菌李变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种在30分钟时呈现出大于40μl/ml的cmb，而在2小时时的cmb在3.75至7.5μl/ml之间。
[0117]
这些结果表明，在丁香假单胞菌番茄致病变种、树生黄单胞菌李变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种的情况下，在测试的最低浓度下，细菌悬浮液与产品的接触时间必须更长，以观察到接近100％的死亡率。
[0118]
在使用的不同植物病原细菌中，在与产品接触2小时时获得的cmb值低于15μl/ml的浓度。
[0119]
表5.产品针对所测试的不同植物病原体的ld50和cmb，以μl/ml产品表示。
[0120][0121]
nd：无法确定ld50，因为在所有测试的稀释液中都没有细菌生长。
[0122]
产品针对树生黄单胞菌李变种的半数有效剂量(ld50)在两次研究中相似，30分钟时为2.73μl/ml且2小时时为2.78μl/ml。而在丁香假单胞菌猕猴桃致病变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种中，2次测试之间略有不同。对于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的dl50在30分钟时为0.55μl/ml且在2小时时为0.93μl/ml。而对于地毯草黄单胞菌疮痂致病变种，它们为4.5μl/ml和5.48μl/ml。这种变化可归因于温育2小时后以及因此在其余处理中cnt中cfu/ml的轻微增加。
[0123]
对于解淀粉欧文氏菌和丁香假单胞菌番茄致病变种，在30分钟和2小时，无法计算ld50，因为在任何浓度的测试产品中都没有观察到生长。为此，有必要评估低于本研究中测试剂量的杀菌效果。
[0124]
分析cmb和dl50的值，可以确认所述产品针对解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌猕猴
桃致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种、树生黄单胞菌李变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种呈现出了明显且快速的杀菌活性。
[0125]
结果是，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种和丁香假单胞菌番茄致病变种比树生黄单胞菌李变种和地毯草黄单胞菌疮痂致病变种对所述产品更敏感。不能排除的是，解淀粉欧文氏菌比丁香假单胞菌猕猴桃致病变种或丁香假单胞菌番茄致病变种更敏感，因为最低测试剂量为10μl/ml。
[0126]
为了能够准确地确定产品针对植物病原细菌的mic和ld50，有必要在观察到的mic范围内测试产品的更多浓度。
[0127]
实施例4：评估针对叶缘焦枯病菌的三个亚种的杀菌活性
[0128]
针对叶缘焦枯病菌的三个亚种测试了本发明的产品。评估的产品包含足够量的桉树油以包含20％w/v的1,8-桉树脑(通过hplc测量)并且保存在室温下直至使用时，使用时采集一样品量用于进行微生物分析，并且确认不存在污染微生物。
[0129]
针对叶缘焦枯病菌的三个亚种评估了产品的功效：影响意大利橄榄树的保卡亚种菌株codiro(dd1)、来自西班牙感染病灶(分别是巴利阿里群岛和阿利坎特)并分离自扁桃树的叶缘焦枯亚种和多元亚种，保藏在cidsav的检疫病原体保藏中心。在bcye琼脂培养基中接种并在28℃下培养7-10天后，从活跃生长的菌株的纯培养物中获得接种物。每种细菌悬浮物制备为最终浓度1x10
8 cfu/ml。
[0130]
所有操作均在加泰罗尼亚政府(generalitat de catalunya)darp授权在体外条件下使用叶缘焦枯病菌进行研究的生物安全实验室中进行。
[0131]
杀菌活性测试所用菌株如下：
[0132][0133]
针对叶缘焦枯病菌的3个亚种评估了产品5个剂量的杀菌活性。考虑实施例2的结果，测试了产品的浓度0.75、1.25、2.5、5和10μl/ml。此外，将产品的效果与100mg/l的抗生素链霉素和氨苄青霉素的效果进行了比较。还包括未经处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。
[0134]
通过在液体培养基中与细菌悬浮液的接触试验来进行不同浓度产品针对植物病原细菌的杀菌活性的测定。
[0135]
接触测试包括将100μl每种产品/浓度与100μl浓度为108cfu/ml的细菌悬浮液混合，在板的每个孔中获得200μl的最终体积(细菌悬浮液最终浓度为约5x10
7 cfu/ml)。不同剂量的产品和抗生素均制备为两倍浓缩(2x)以在每个孔中获得所需的最终浓度。
[0136]
在连续搅拌(150rpm)下在28℃下温育多孔板。在细菌与产品接触30分钟(min)和2小时(h)时，取样并且通过计算菌斑中的活菌数来分析其存活率。在28℃下温育7-10天后对菌落形成单位(cfu)进行计数，确定存活率(cfu/ml)，并且将其与未处理的对照进行比较。每个处理分析三个重复。
[0137]
从每个处理获得的存活率(cfu/ml)，确定最低杀菌浓度(mbc)和半数致死量(ld50)。mbc被确定为与产品一起温育后，在实验结束时未观察到细菌生长的最低产品浓
度。对于ld50的计算，通过probit函数转换相对于浓度的存活数据，调整为直线，并进行插值，以获得仅观察到一半初始细菌群的浓度。
[0138]
在两次测试中(30分钟和2小时)，在所评估的五个剂量下与产品接触后，未观察到叶缘焦枯病菌三个亚种的生长。未处理的对照中的存活率为约100％。与参比抗生素接触后叶缘焦枯病菌的存活率取决于所研究的亚种以及所测试的抗生素。
[0139]
以下是不同剂量的产品针对被测植物病原体的杀菌效果：
[0140]
叶缘焦枯病菌保卡亚种codiro菌株
[0141]
在pd2琼脂培养基中在28℃下温育8天后进行活菌计数。在图6中，相对于产品浓度和接触时间显示了结果。
[0142]
与产品接触后，在评估的五个剂量下，在两次测试(30分钟和2小时)中均无叶缘焦枯病菌保卡亚种的生长。未处理的对照中的存活率为100％。
[0143]
与浓度为100mg/l的抗生素链霉素接触30和120分钟后分别观察到89.8％和61.7％的存活率。未评价氨苄青霉素的杀菌作用。
[0144]
在暴露30分钟时，产品的最低测试浓度(0.75μl/ml,死亡率100％)呈现出比参比抗生素链霉素更大的杀菌活性。
[0145]
叶缘焦枯病菌多元亚种
[0146]
在bcye琼脂培养基中在28℃下温育8天后进行活菌计数。图7示出了取决于应用的处理和所研究的接触时间的叶缘焦枯病菌多元亚种的生存图。
[0147]
在与所评价的五个剂量下与产品接触后，在两次测试(30分钟和2小时)中均无叶缘焦枯病菌多元亚种的生长。未处理的对照中的存活率为100％。
[0148]
在暴露于氨苄青霉素中30分钟和120分钟后，分别定量到2％和4.4％的平均存活率。在与抗生素链霉素接触后，与未处理的对照相比，未观察到叶缘焦枯病菌存活率的显著差异。
[0149]
在暴露30分钟时，产品的最低测试浓度(0.75μl/ml，100％死亡率)显示出比参比抗生素氨苄青霉素更大的杀菌活性。
[0150]
叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种
[0151]
在pd2琼脂培养基中在28℃下温育8天后进行活菌计数。图8示出了取决于所研究的处理和接触时间的叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种的存活率。在与产品接触30分钟和2小时后，在产品的任何测试剂量下均未观察到细菌生长。未处理对照的存活率是100％。在链霉素暴露30分钟和120分钟时，分别定量了4.4％和20％的平均存活率。在暴露于抗生素氨苄青霉素中30分钟和120分钟时，在直接悬浮液或稀释液-1(原始悬浮液的1/10稀释)中不存在存活的叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种。然而，当进行系列稀释-2(1/100)和-3(1/1000)时，在相同稀释度下获得了与未处理对照中观察到的相似的存活率。这种细菌生长与以下事实有关：通过稀释与氨苄青霉素接触的细菌悬浮液，随后接种在没有抗生素的琼脂培养基板中，抗生素也被稀释1/100和1/1000，使其不再起作用。在这种情况下，氨苄青霉素对叶缘焦枯病菌亚种具有抑菌作用。与实施例1中的测试不同，实施例1中使用琼脂掺入测试评估抗菌活性，抗生素与细菌悬浮液持续接触，在接触试验中，只有抗生素在选定的暴露时间内与细菌悬浮液保持直接接触。
[0152]
在暴露30分钟时，产品的最低测试浓度(0.75μl/ml，死亡率100％)呈现出比参比
抗生素氨苄青霉素和链霉素更大的杀菌活性。
[0153]
产品针对所测试的叶缘焦枯病菌的三个亚种呈现出快速杀菌活性(在30分钟时，观察到接近100％的死亡率，表5)。与产品接触30和120分钟时，获得的cmb值低于浓度0.75μl/ml。
[0154]
表6.产品对所测试的不同植物病原体的ld50和cmb，以μl/ml产品表示
[0155][0156]
nd：ld50无法准确确定，因为在所测试的稀释液中都没有获得细菌的生长。
[0157]
分析cmb值，可以确认该产品针对叶缘焦枯病菌呈现出强烈而快速的杀菌活性。为了准确确定产品针对叶缘焦枯病菌三个亚种的mic并且量化ld50，有必要测试更多低于0.75μl/ml的产品浓度。
[0158]
实施例5：评价在梨树中控制解淀粉欧文氏菌的功效
[0159]
在梨树中解淀粉欧文氏菌的控制中测试了本发明的组合物。所测试的产品包含足够量的桉树油以使组合物具有20％w/v的1,8-桉树脑并且保存在室温下。
[0160]
使用解淀粉欧文氏菌的eps101菌株，其分离出列伊达感染暴发的会议梨树并且低温冷冻保存。接种物获取自接种在lb琼脂培养基中并在28℃下培养24小时后活跃生长菌株的纯培养物。制备细菌悬浮液的最终浓度为5x10
7 cfu/ml。
[0161]
对于本次试验，使用3年生自生植物的会议品种梨树。植物每周用200ppm的npk溶液(20:10:20)施肥一次并在每枝含有5至6片嫩叶时使用。在此过程中，使用杀虫剂和杀螨剂进行标准处理。不使用杀真菌剂或杀菌剂以避免干扰测试。
[0162]
评价了本发明的组合物的2个剂量在梨树中控制解淀粉欧文氏菌的功效。所测试的剂量为40和20μl/ml。此外，将产品的效果与浓度为100mg/l的抗生素链霉素进行了比较。还包括未处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。
[0163]
实验设计包括每次处理3株植物的3次重复，每株植物至少有两个嫩芽(大多数有超过3个嫩芽)。该试验独立进行了两次。
[0164]
根据欧洲和地中海植物保护组织(emopo)为检疫性植物病原体制定的协议，在生物安全温室中在适当的遏制措施下进行测试。温室的温度、相对湿度和光照循环条件完全受控。
[0165]
在处理植物之前且为了促进病原体的进入，由于最嫩叶最易于受到感染，因此在每根新枝的3片最嫩叶中，以1mm间隔并且垂直于中枢神经切割出长度为2mm的2条平行切口。
[0166]
通过叶面喷洒进行处理，每株植物至少使用10ml，确保整个叶面的浸渍。
[0167]
处理后，接种解淀粉欧文氏菌的eps101菌株，这是通过将10μl处于5x10
7 cfu/ml的细菌悬浮液施加在每个先前进行的伤口上来进行的。接种后，将它们装袋以保持较高的相对湿度，这是疾病发展所必需的，并在25
±
2℃和16小时光照以及20
±
2℃和8小时黑暗条件下温育8天。在病原体接种8天后通过指定感染强度指数值从0到4确定疾病水平，具体取
决于综合征的进展：0，无坏死；1，坏死位于伤口周围；2，中枢神经完全坏死；3，坏死进展通过叶柄；和4，坏死进展到新枝。
[0168]
根据以下公式计算每种处理中的感染严重程度：
[0169][0170]
其中s是反复感染的严重程度，i是感染严重程度的指数，n是接种叶片的数量。
[0171]
一旦获得每种治疗的每种反应的严重程度，通过anova确定是否存在显著差异并且使用spss统计软件包(ibm spss statistics v25)以waller-duncan检验进行均值分离。
[0172]
图9示出了产品在梨树植物中解淀粉欧文氏菌控制中的两次功效试验中所观察到的与感染严重程度相对应的结果。
[0173]
在第一次试验中观察到，与未处理的对照相比，两种剂量的产品和链霉素显著降低了感染的严重程度。研究的两种剂量之间没有观察到显著差异。剂量为100mg/l的链霉素是最有效的处理。
[0174]
在第二次试验中，解淀粉欧文氏菌引起的感染的严重度水平高于在第一次试验中观察到的水平。相对于未处理的对照，两个剂量的产品和链霉素也显著地降低了感染的严重程度。与第一次试验不同，在剂量为20和40μl/ml的产品和链霉素之间未观察到显著差异。
[0175]
取决于剂量和试验，产品在梨树植物中控制解淀粉欧文氏菌的有效性为30至62％。具体地，在第一次试验中，20μl/ml剂量的有效性为37％，并且在第二次试验中为36％。并且，40μl/ml剂量分别表现出62％和30％的有效性。
[0176]
实施例6：产品控制叶缘焦枯病菌的功效的植物内评估
[0177]
针对来自西班牙(巴利阿里群岛)感染爆发且分离自扁桃树的叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种(保藏在检疫病原体的cidsav保藏中心)评估了产品的功效。所测试的产品包含足够量的桉树油以具有20％w/v的1,8-桉树脑(通过hplc定量)并且在室温下保存。
[0178]
在bcye琼脂培养基中接种并在28℃下温育7-10天后，从活跃生长菌株的纯培养物中获得接种物。将细菌悬浮液制备为最终浓度1x108cfu/ml。产品在室温下保存直至使用。
[0179]
通过显微注射应用至树干来接种病原体。接种后27天，通过将产品显微注射到树干上，以治疗策略(接种病原体后)和单次施用，对植物进行处理。测试了产品的两个剂量，并且将抗生素氨苄青霉素用作参比产品。此外，还包括未经处理的对照(用水代替产品)。
[0180]
使用常规qpcr对总种群水平进行量化，并且使用活qpcr对活细胞进行量化。
[0181]
使用avijor品种的扁桃树，并且使用标准生长条件，保存在温室的花盆中。用菌株5387.2的细菌悬浮液接种40株植物(每次处理10株)(在4-5cm段中的三个接种点)。在接下来的几天里，测试导电导管(conductive vessel)中叶缘焦枯病菌的存在，以及它是否还活着和它是否通过维管组织上升(通过活体qpcr)。通过qpcr在7、15和27dpi(活体qpcr)分析接种区和顶生区(远离接种点)。在第27天，确认了维管组织中存在活叶缘焦枯病菌。在同一天，施用不同的处理(剂量为20μl/ml和40μl/ml、氨苄青霉素100mg/l、水)。在施用产品过程中(4-5cm段中三个接种点，每点10μl)，观察到其很难被吸收，可能是由地它的组成。因此，施用后，将植物保持在水平位置18小时，以增加植物对产品的吸收。
[0182]
在施用不同处理(dpt)31天后，在叶片中观察到症状，这可能归因于与扁桃树中由叶缘焦枯病菌引起的疾病相关的典型症状。症状的强度随着时间的推移而增加，在对照植物中观察到的疾病更严重。在施用产品31天后(在治疗策略中)通过指定感染强度指数值0到5来确定疾病水平，具体取决于症状的进展：0，无坏死；1，一叶或两叶片出现边缘坏死；2，两或三叶片出现边缘坏死；3，半数以上叶片出现坏死；4，所有叶片出现坏死和5，所有叶片和茎出现坏死。
[0183]
图10示出了在与产品在扁桃树植物中控制叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种的功效试验中观察到的感染严重程度相对应的结果。据观察，相对于未处理的对照，产品的两个测试剂量和氨苄青霉素均显示地降低了感染的严重程度。在两个研究的剂量或使用氨苄青霉素(100mg/l)的处理之间未观察到显著差异。
[0184]
施用不同处理18小时后，从接种点附近的区域和植物的顶生区(距离每个区域8cm)进行树液(savia)提取。在一些对照植物中没有获得树液，最有可能是由于叶缘焦枯病菌生物膜的形成导致树液阻塞引起的坏死。当存在组织坏死时，通常不能通过pcr或qpcr检测到细菌。此外，作为生物膜一部分的大多数细胞已经死亡(这会导致dna降解)。再加上生物膜中的细胞难以提取这一事实，无法通过qpcr/活体qpcr获得叶缘焦枯病菌的定量/检测的真实结果(通常得到nd结果，未检测到)。
[0185]
在以40μl/ml施用产品后，在75％的分析植物中观察到顶生区维管组织中的活细菌减少(总细胞数，即活细胞数和死亡细胞数，高于活体qpcr检测到的活细胞数)。也就是说，它可以与产品施用后18小时的杀菌活性相关联。关于其余的处理，仅在所分析的4株植物中的1株中观察到叶缘焦枯病菌活性下降(25％)。
[0186]
树液18小时dpt的分析与每次处理4株植物的测试表明，用20μl/ml的剂量处理导致25％的植物顶生区域中的活菌下降(通过活体qpcr分析)，而用40μl/ml的剂量处理导致75％的植物顶生区域中的活菌下降。使用氨苄青霉素(100mg/l)处理导致25％的植物接种点的活菌下降，且未处理的对照显示25％的植物顶生区中的活菌下降。
[0187]
施用产品14天后，对接近接种点的顶生叶片和顶生区的叶片进行分析(在这种情况下，我们不分析木质部，因为这是一种破坏性方法，而且我们会减少在实验结束时需要分析的植物数量)。通过qpcr，我们观察到，与未处理的对照相比，叶缘焦枯病菌通过以40μl/ml产品治疗性处理的植物的维管系统进展较慢(从接种点移动到植物顶生区域)。使用20μl/ml产品或使用参比抗生素氨苄青霉素(100mg/l)处理后未观察到这种效应。
[0188]
为了研究施用不同的处理31天后，叶缘焦枯病菌通过导电导管的进展，从植物的三个不同区域进行树液提取(每个区域8cm)。使用常规qpcr(总细胞)分析样品。
[0189]
顶生区1(a1)：产品施用点上方的区域。
[0190]
顶生区2(a2)：最靠近茎的顶生分生组织的区域。
[0191]
基部区(b)：位于接种点和根系起点之间的区域。
[0192]
以与1dpt分析相同的方式，观察了处理31天后从对照植物(和用氨苄青霉素处理的一些植物)提取的树液是如何远低于其余处理的。此外，与其余处理相比，其可能与在对照植物的茎中观察到的更大坏死有关，与观察到的疾病更严重(在31dpt)有关。
[0193]
采用20μl/ml的剂量，在所有分析的植物中均未观察到叶缘焦枯病菌从顶生区向基部区的向下移动。在25％的植物的a1中也未检测到叶缘焦枯病菌。在25％的植物的a2中
也未检测到叶缘焦枯病菌，在100％的植物的b中未检测到叶缘焦枯病菌。
[0194]
采用40μl/ml的剂量，在所有分析的植物中均未观察到叶缘焦枯病菌从顶生区1向顶生区2的向上移动。在25％的植物中仅观察到叶缘焦枯病菌向基部区的进展。在25％的植物的a1中未检测到叶缘焦枯病菌。在100％的植物的a2中未检测到叶缘焦枯病菌。在75％的植物的b中未检测到叶缘焦枯病菌。
[0195]
使用氨苄青霉素处理，在75％所分析的植物中观察到叶缘焦枯病菌的向上移动(顶生区)和向下移动(基部区)，在25％的植物的a1中未检测到叶缘焦枯病菌，在25％的植物的a2中未检测到叶缘焦枯病菌，在25％的植物的b中未检测到叶缘焦枯病菌。
[0196]
在未处理的对照中，在茎上观察到坏死和/或生物膜，特别是在对应于顶生区域的茎中。
[0197]
在使用40μl/ml的剂量处理后，在75％的植物的顶生区1中检测到叶缘焦枯病菌。然而，在100％所分析的植物中，在顶生区2中未观察到叶缘焦枯病菌。此外，在75％所分析的植物的基部区中未检测到叶缘焦枯病菌。这一事实意味着，不存在叶缘焦枯病菌从顶生区1向其余植物区(顶生2和基部)的移动。在使用20μl/ml的剂量处理后，未观察到叶缘焦枯病菌从顶生区移动到植物的基部区。相反，在使用100mg/l剂量的参比抗生素氨苄青霉素处理后，在75％所分析的植物的整个维管系统中观察到叶缘焦枯病菌的向上和向下移动。
[0198]
实施例7：在植物中评估产品控制叶缘焦枯病菌三个亚种的两个菌株的功效
[0199]
针对来自西班牙感染灶(分别是巴利阿里群岛和阿利坎特)且分离自扁桃树的叶缘焦枯病菌的两个亚种(叶缘焦枯亚种菌株ivia 5387.2和多元亚种菌株ivia 5901.2)，评估了产品的功效。
[0200]
在bcye琼脂中接种并在28℃下温育7-10天后，从这些处于活跃生长状态的菌株的纯培养物中获得接种物。每种细菌悬浮液都制备为最终浓度1x10
8 cfu/ml。通过显微注射施用于树干来接种病原体，共进行3次施用，每次10μl(在4-5cm段中的三个接种点，总共3x10
6 cfu)，对应于1.2μl产品。此外，将产品的效果与100mg/l浓度的抗生素氨苄青霉素进行比较。还添加了未处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。使用了精密注射设备。所测试的产品包含足够量的桉树油以具有20％w/v的1,8-桉树脑(通过hplc定量)并且保存在室温下。
[0201]
在使用标准生长条件保存在温室花盆中的avijor品种的扁桃树植物上，评价了产品控制叶缘焦枯病菌多元亚种5901和叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种5387的作用。每周用200ppm npk溶液(20:10:20)给植物施肥一次。在此过程中，使用杀虫剂和杀螨剂进行标准处理。避免使用杀真菌剂和杀菌剂，以排除对测定进展的干扰。
[0202]
相对于未处理的对照，通过在树干中显微注射来治疗性施用产品显著地降低了扁桃树植物中由两种菌株(叶缘焦枯亚种菌株5387、多元亚种菌株5901)引起的感染严重度。相对于未处理的对照，产品在扁桃树中显示出控制叶缘焦枯病菌的功效为52-68％。在通过显微注射到树干施用18小时后，处于4％v/v(40μl/ml)的产品对叶缘焦枯病菌具有杀菌活性。通过活体qpcr，相对于未处理的对照，证实植物顶生区域的维管组织中活细胞减少。治疗性施用4％v/v(40μl/ml)的产品，在处理14和31天后，降低了叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种菌株5387的传播。
[0203]
此外，当完成扁桃树植物中的试验时(接种后4-6个月，施用处理后3-5个月)，通过
以4％v/v的灌溉进行治疗性施用产品(分别在接种病原体叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种5387和叶缘焦枯病菌多元亚种5901后的6个月和4个月)。对于两个叶缘焦枯病菌亚种，与在受感染但未处理的植物中观察到的相比，75％的使用产品处理的植物显示出到更低水平的叶缘焦枯病菌。此外，在扁桃树-叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种的情况下，在树干(没有树液)和先前提取的树液中都观察到了菌属(xylella)种群的这种减少。在5dpt时，与未处理的对照植物相比，当通过灌溉施用时，观察到该产品对菌属的两个亚种具有明显的抗菌作用。与未处理的对照植物相比，通过灌溉进行治疗性施用后，在受感染且疾病严重程度非常高的植物上观察到产品针对多元亚种和叶缘焦枯亚种的明显抗菌作用。
[0204]
实施例8：通过接触测试评估杀菌活性
[0205]
评估了产品针对叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种(ivia菌株5387.2)的功效。所测试的产品包含足够量的桉树油以具有20％w/v的1,8-桉树脑(通过hplc测量)并且保存在室温下。在bcye琼脂培养基中接种并在28℃下温育7-10天后，从活跃生长菌株的纯培养物中获得接种物。细菌悬浮液制备为最终浓度1x10
8 cfu/ml。在产品的4种浓度下评估杀菌活性：1.5、2.5、5和10μl/ml。此外，将产品的效果与空白(无1,8-桉树脑的配方)和浓度为100mg/l的抗生素氨苄青霉素进行了比较。还包括未处理的对照，其中产品用无菌蒸馏水代替。试验如实施例3所述进行，结果如图11所示。
[0206]
在暴露于抗生素氨苄青霉素中30分钟后，定量到100％的中值存活率。然而，在暴露2小时后，下降到20.6％的值。这是正常的，因为其是一种影响细菌壁合成的抗生素，其致死作用被延迟。
[0207]
与产品接触30和120分钟时，在最高温度浓度(10μl/ml，100％死亡率)下不存在存活的叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种。在剂量1.5、2.5和5μl/ml下，观察到存活率显著降低，分别呈现出数值范围11.8-14.9％、14.3-15.6％和0.05-2.9％。一般来说，观察到随着产品剂量的增加，叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种的存活率降低。随着暴露时间增加，浓度为5μl/ml的产品的杀菌作用显著增加(30分钟，存活率为2.8％；120分钟，存活率为0.05％)。产品的dl50在30分钟时为1.15μl/ml且在120分钟时为1.08μl/ml。
[0208]
这些结果显示，本发明的产品对叶缘焦枯病菌叶缘焦枯亚种具有强效杀菌作用。