工程化的调节性T细胞的制作方法

工程化的调节性t细胞
发明领域
1.本发明涉及工程化的调节性t细胞(treg)。特别地，本发明涉及包含t细胞受体(tcr)的treg，所述t细胞受体能够与髓鞘碱性蛋白(mbp)特异性结合。本发明还涉及提供工程化treg的方法并涉及所述工程化treg的方法和用途。


背景技术：

2.许多自身免疫性和炎性中枢神经系统(cns)疾病涉及自身反应性t细胞。例如，多发性硬化(ms)，其是中枢神经系统的自身免疫性炎性脱髓鞘性疾病并且是青年当中最常见的神经系统疾病。
3.自身免疫性和炎性cns疾病的现有治疗通常抑制免疫系统。例如，一种治疗包括移植骨髓连同施用细胞抑制剂和免疫抑制药物。自体造血干细胞移植可能对一些患者具有持久有益效果，但该程序需要与巨大毒性和风险相关的激进清髓预处理(myelo-ablative conditioning)。
4.尽管已经批准了几种降低临床复发频率的病情改善疗法(dmt)，但按照现行治疗方案，大部分患者继续在临床上加重。dmt或干细胞移植均不能介导对于自身免疫性疾病和炎性cns疾病的免疫病理的cns特异性抑制。
5.目前，不存在有效的自身免疫性疾病和炎性cns疾病疗法。治疗仅致力于减少其症状，通常借助于免疫系统的总体抑制。需要特异性靶向与cns疾病的发作和进展相关的局部免疫应答的疗法。
6.发明概述
7.本发明至少部分地基于发明人确定：t细胞受体基因转移技术可以用来产生抗原特异性tregs。已经显示，人抗原特异性tregs可以抑制活化的t细胞。
8.特别地，发明人已经生产例如mbp特异性tregs，通过将mbp-tcr基因经逆转录病毒转入纯化的tregs和通过将mbp-tcr和叉头框p3(foxp3)基因经逆转录病毒转入常规的cd4

t细胞来产生。不希望受理论约束，具有mbp特异性tcr的这些工程化的tregs可以用于抑制例如自身免疫性疾病的疾病，其中，在中枢神经系统(cns)内mbp特异性tregs的局部活化可以抑制如ms和其他cns炎性病症中所见的cns病理。
9.此外，大量的tcr不能作为外源性tcr成功表达。无法预测哪些tcr可以作为外源tcr有效表达，特别是在treg中。
10.本发明具体涉及一种工程化的调节性t细胞(treg)，其包含的t细胞受体具有有利特性，例如在效应细胞因子的表达方面。
11.因此，本发明提供工程化的调节性t细胞(treg)，其包含t细胞受体，其中tcr包含α链和β链，
12.其中α链和β链各自包含三个互补决定区(cdr)并且每个cdr3的序列如下：
13.cdr3α-atdttsgtykyi(seq id no:1)
14.cdr3β-sardltsganneqf(seq id no:2)
15.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体。
16.当多肽由主要组织相容性复合体(mhc)分子呈递时，tcr可以与多肽特异性结合，该多肽与mbp 82-102(seq id no:12)或其片段有至少90％的一致性。
17.mbp82-102多肽与hla-dr15(drb1*1501)结合。
18.tcr的α链可以包含三个具有以下氨基酸序列的cdr：
19.cdr1α-tsinn(seq id no:3)
20.cdr2α-irsnere(seq id no:4)
21.cdr3α-atdttsgtykyi(seq id no:1)
22.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体；
23.并且tcr的β链可以包含三个具有以下氨基酸序列的cdr：
24.cdr1β-dfqatt(seq id no:5)
25.cdr2β-snegska(seq id no:6)
26.cdr3β-sardltsganneqf(seq id no:2)
27.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体。
28.tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列；并且
29.tcr的β链的可变区可以包含与seq id no:8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。
30.tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且
31.tcr的β链的可变区可以包含与seq id no:8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
32.tcr的α链和β链的恒定区结构域可以各自包含额外的半胱氨酸残基，从而使得在α链和β链之间形成额外二硫键成为可能。适当地，额外的二硫键减少与内源tcr链的错误配对。
33.tcr的α链可以包含与seq id no:9具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且
34.tcr的β链可以包含与seq id no:10具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
35.在一个方面，treg衍生自从受试者分离的t细胞。
36.在另一个方面，本发明提供包含根据本发明的工程化treg的药物组合物。
37.在一个方面，本发明涉及根据本发明的工程化treg或药物组合物用于治疗疾病。
38.在另一个方面，本发明涉及根据本发明的工程化treg或药物组合物在制备药物中的用途。
39.在一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用本发明的工程化treg或药物组合物。
40.在另一个方面，提供了根据本发明的工程化treg或药物组合物用法、或用途或方法，其中疾病是多发性硬化。
41.在另一个方面，提供根据本发明的工程化treg或药物组合物用法、或用途或方法，其中受试者为drb1*1501阳性受试者。
42.在另一个方面，提供一种载体，其包含了编码如本文定义的tcr的核酸序列和编码
foxp3的核酸序列。
43.在一个方面，提供一种多核苷酸套件或载体套件，所述套件包含第一多核苷酸或载体和第二多核苷酸或载体，所述第一多核苷酸或载体包含了编码如本文定义的tcr的核酸序列，所述第二多核苷酸或载体包含了编码foxp3的核酸序列。适当地，第一和第二多核苷酸或载体是分离的。
44.在一个方面，提供一种产生根据本发明的工程化treg的方法，所述方法包括步骤：向体外或离体细胞引入编码如本文定义的tcr的多核苷酸。
45.适当地，t细胞是表达foxp3的天然treg。
46.在一个方面，该方法还包括步骤：向体外或离体细胞引入编码foxp3蛋白的多核苷酸。适当地，细胞是t细胞。
47.适当地，t细胞是
‘
常规’t细胞。
48.适当地，细胞是人类细胞，例如人类t细胞。适当地，细胞是人的treg细胞。
49.在本发明方法的一个方面，依次、分别或同时进行引入编码tcr的多核苷酸和编码foxp3的多核苷酸的步骤。
50.在本发明方法的另一个方面，使用本发明的载体，向细胞引入编码tcr的多核苷酸和编码foxp3的多核苷酸。
附图说明
51.图1
–
ob-1a12 tcr的逆转录病毒载体示意图以及ob-1a12 tcr的表达和功能研究。(a)ob-1a12 tcr被克隆到逆转录病毒pmp71载体中，使用α链-p2a-β链-t2a-截短的小鼠cd19(tmcd19)构造。截短的小鼠cd19被用来作为转导效率的标志物。可变域和恒定域经过了密码子优化。(b)3个独立实验的代表性实例显示了用ob-1a12逆转录病毒构建体转导的jurkat细胞(不表达内源性tcr)。顶部栏：cd19的表达水平。底部栏：在门控的cd19
high
细胞中的cd3表达水平和trbv20(imgt命名法)表达水平。cd3用作tcr细胞表面表达的代用标志物。细胞用抗trbv20抗体染色以确定可变β链的表达。(c)4个独立实验的代表性实例显示了macs分选的用ob-1a12 tcr逆转录病毒构建体转导的cd4 人t细胞。顶部栏：cd19的表达水平。底部栏：门控的cd19
high
细胞中表达trbv20的cd4 细胞的百分比。细胞用抗trbv20抗体染色以确定可变β链的表达。(d)4个独立实验的代表性实例显示用ob-1a12 tcr转导并用加载了饱和浓度的相关肽或对照肽的apc进行刺激的人类cd4 t细胞。显示了门控的cd19
high
细胞的频率，所述细胞产生il2和/或ifng，如在有bfa存在的情况下刺激18小时后通过细胞内细胞因子染色确定的。apcs是表达cd80和cd86以及hla-drb1*1501的cho细胞。(e)比较用ob-1a12和ob-2f3tcrs转导的cd4 t细胞在一定的肽浓度范围内产生的抗原特异性细胞因子。所示为转导细胞中细胞因子产生细胞的频率(cd19
high
)，如图c中所描述的通过细胞内细胞因子染色所测量的。
52.图2
–
显示实施例1中使用的逆转录病毒载体和开放读码框的图示。
53.图3
–
将tcr转导的t conv用cfse染色并且按1tconv:0.1apc的比率，与或不与肽冲击的照射的apc一起培养4天。按所示比率添加空白对照treg(最左侧上的图标)、参考mbp tcr转导的treg(从左起第二图标)、参考mbp tcr-foxp3转导的treg(从左起第三图标)和参考mbp tcr-foxp3转导的tconv(每个组从左起第四图标)。通过分析cfse染色的tconv的稀
释物测定增殖(b)。这些数据显示tcr转导的treg以抗原特异性方式抑制t细胞应答。
54.图4
–
将tcr转导的t conv用cfse染色并且按1tconv:0.1apc的比率，与或不与肽冲击的照射的apc一起培养4天。按所示比率添加空白对照treg(最左侧上的图标)、参考mbp tcr转导的treg(从左起第二图标)、参考mbp tcr-foxp3转导的treg(从左起第三图标)和参考mbp tcr-foxp3转导的tconv(每个组从左起第四图标)。收集上清液并通过elisa对其测定il-2。这些数据显示tcr转导的treg以抗原特异性方式抑制t细胞应答。
55.图5-tcr转导的调节性t细胞可以移植到辐照过的宿主体内，但需要外源foxp3的表达来防止tcr foxp3-细胞的积累。通过珠分选法从hla-drb*0401转基因小鼠的淋巴结和脾细胞分离thy1.1 cd4

cd25

treg。treg用参考tcr或参考tcr 鼠类foxp3进行转导或用无病毒上清液(模拟)培养。转导1天后，将tcr或tcr foxp3转导的细胞注射到经4gy照射预处理的hla-drb*0401转基因宿主体内。7周后用流式细胞仪确定转导的treg的移植。a.转导效率是通过转导后第1天人可变2.1和小鼠foxp3的表达来确定的b.接受了由tcr或tcr foxp3转导的treg的小鼠的脾细胞对thy1.1染色以鉴定转移的细胞(顶部栏)和foxp3和tcr.c.累积数据显示了用tcr或tcr foxp3转导的treg的转导效率(左图)和转导细胞的绝对数量(右图)相对于注射日的倍数变化(n＝3)。误差条显示了平均值的标准误差。通过未配对的t检验进行统计分析。d.转导7周后转导细胞内foxp3的代表性表达。图中显示了第7周时转导群体中foxp3 细胞的累积百分比(左)，以及foxp3 细胞相对于注射当天的倍数变化(n＝3)。误差条显示平均值的标准误差。*p＝》0.05，**p＝》0.01，通过非配对t检验确定。
56.图6-表达外源性foxp3的treg在体内7周后仍保持treg功能，而不表达外源性foxp3的tregs获得产生效应细胞因子的能力。a将脾细胞与用无关肽或10um mbp脉冲过的cd86 hla-dr4 cho细胞培养4小时。通过流式细胞仪测定il-2和ifng的产生。流式细胞术图显示cd45.1细胞(顶部栏)含有单独表达参考tcr的treg，以及thy1.1细胞含有表达参考tcr foxp3的treg。b图显示表达tcr(深灰色)和表达tcr foxp3(浅灰色)的treg的il-2和ifng的产生累积。误差条显示平均值的标准差(n＝3)。
57.图7-ob-2f3的特征
58.图8-ob-3d1的特征
59.图9-hy-1a8的特征
60.图10-hy-2e11的特征
61.图11-hd1-14的特性
62.图12-ms3-1的特征
63.图13-ms3-11的特征
64.图14-ms1-4h12的特征
65.图15-hd4-1c2的特征。
66.发明详述
67.髓鞘碱性蛋白(mbp)肽
68.髓鞘碱性蛋白在神经的髓鞘形成过程中重要并且存在于神经系统的髓鞘细胞中，如少突胶质细胞和schwann细胞。mbp转录物还存在于骨髓和免疫系统中。髓鞘的一个功能是增加轴突脉冲传导的速度。mbp有助维持髓鞘质的正确结构并且与髓鞘质膜中的脂质相互作用。已知mbp定位于cns及各种造血细胞。
69.mbp已经涉及脱髓鞘病诸如多发性硬化(ms)的发病机制。研究已经展示针对mbp的抗体在ms发病机制中的作用。
70.在一个方面，mbp的示意性氨基酸序列包含uniprotkb登录号p02686-1的序列，其显示为seq id no:11：
71.mgnhagkrelnaekastnsetnrgesekkrnlgelsrttsednevfgeadanqnngtssqdtavtdskrtadpknawqdahpadpgsrphlirlfsrdapgredntfkdrpsesdelqtiqedsaatsesldvmasqkrpsqrhgskylatastmdharhgflprhrdtgildsigrffggdrgapkrgsgkdshhpartahygslpqkshgrtqdenpvvhffknivtprtpppsqgkgrglslsrfswgaegqrpgfgyggrasdyksahkgfkgvdaqgtlskifklggrdsrsgspmarr(seq id no:11)。
72.mbp的示意性氨基酸序列可以包含seq id no:11或其变体或片段。
73.适当地，mbp的示意性氨基酸序列可以是uniprotkb登录号p02686-1的同工型，如uniprotkb登录号p02686-5。同工型p02686-5不同于上文在seq id no:11中如下所示的规范序列，氨基酸残基1-133丢失。
74.将uniprotkb登录号p02686-5显示为seq id no:13：
75.masqkrpsqrhgskylatastmdharhgflprhrdtgildsigrffggdrgapkrgsgkdshhpartahygslpqkshgrtqdenpvvhffknivtprtpppsqgkgrglslsrfswgaegqrpgfgyggrasdyksahkgfkgvdaqgtlskifklggrdsrsgspmarr(seq id no:13)。
76.除非另外声明，否则如本文所用的mbp xxx-xxx指muraro等人,jci 1997；100,2,339-349中所用的编号，所述文献通过引用方式或通过引用seq id no:13(不包括起始的甲硫氨酸)的方式并入本文。使用本领域可用的方法，可以确定肽是否能够被mhc分子呈递并被t细胞识别。例如，某测定法可以包括将表达mhc:待测试肽复合体的抗原呈递细胞(apcs)与包含本文定义的tcr的t细胞共培养。随后可以测定t细胞增殖作为成功呈递肽的指标(例如通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)测定法)。备选地，也可以测量效应子细胞因子产生。
77.如本文所用，“特异性结合”意指tcr与该肽结合，但不与其他肽结合，或以较低亲和力与其他肽结合。
78.可以定量两个分子(例如tcr和肽)或其片段之间的结合亲和力，例如，通过测定解离常数(kd)来定量。可以通过例如通过表面等离子体共振(spr)法(biacore tm
)测量tcr和肽之间复合物形成和解离的动力学，确定kd。与复合物缔合和解离相对应的速率常数分别称作结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd.(或koff)。kd通过等式kd＝kd/ka，与ka和kd有关。
79.可以通过比较各个tcr/肽复合物的kd值，比较与不同的分子相互作用相关的结合亲和力例如比较不同tcrs和肽的结合亲和力。
80.肽可能能够由任何的人白细胞抗原
–
抗原d相关(hla-dr)呈递。
81.在一个方面，肽能够由hla-dr15呈递。
82.在一个方面，肽能够由drb1*1501分子呈递。
83.在一个方面，该肽与mbp 82-102:denpvvhffknivtprtppps(seq id no:12)具有至少90％同一性。与mbp 82-102(seq id no:12)相比，mbp肽可以经突变。例如，可以通过氨基酸插入、缺失或置换使mbp肽突变，只要修饰的mbp肽保留未修饰的肽的mhc结合特异性并且
能够呈递给t细胞即可。该肽可以相对于mbp 82-102(seq id no:12)例如具有3、2、1或0个突变。适当地，该肽可以相对于mbp 82-102(seq id no:12)例如具有3、2、1或0个保守性突变。适当地，该肽可以相对于mbp 82-102(seq id no:12)例如具有3、2、1或0个插入。适当地，mbp肽片段可以相对于mbp 82-102(seq id no:12)例如具有3、2、1或0个缺失。适当地，mbp 82-102(seq id no:12)肽片段保留82-102(seq id no:12)肽的mhc结合特异性，并且能够被呈递给t细胞。
84.t细胞受体(tcr)
85.tcrα-链和β-链两者的可变结构域各自具有三个高变或互补决定区(cdr)。cdr3是负责识别已加工抗原的主要cdr，不过还已经显示α链的cdr1与抗原性肽的n端部分相互作用，而β-链的cdr1与肽的c端部分相互作用。认为cdr2识别mhc分子。框架区(frs)是位于cdr之间。这些区域提供tcr可变区的结构。
86.本发明的tcr包含其足够的可变结构域，以能够与其肽/mhc复合物相互作用。例如，可以使用biacore
tm
仪器测量这种相互作用。适当地，tcr可以与hla-dr15、适当地drb1*1501相互作用。
87.通过组合性连接可变基因(v)、连接基因(j)和多样性基因(d)并且通过n区多样化(通过脱氧核苷酸转移酶插入的核苷酸)，产生tcr可变区的组库。
88.α链从v区段和j区段之间的重组事件形成。β链从涉及v区段、d区段和j区段的重组事件形成。
89.人tcrα基因座，其也包含tcrδ基因座，位于第14号染色体(14q11.2)上。tcrβ基因座位于第7号染色体(7q34)上。tcrα链的可变区由46个不同vα(可变)区段之一和58个jα(连接)区段之一之间的重组形成(koop等人,1994；genomics；19:478-493，所述文献通过引用方式并入本文)。tcrβ链的可变区从54个vβ、14个jβ和2个dβ(多样性)区段之间的重组形成(rowen等人,1996；science；272:1755-1762，所述文献通过引用方式并入本文)。
90.已经鉴定每个tcr链基因座的v和j(和d如果适宜)基因区段并且已知并注释每个基因的种系序列(例如参见scaviner和lefranc；2000；exp clin immunogenet；17:83-96及folch和lefranc；2000；exp clin immunogenet；17:42-54，所述文献通过引用方式并入本文)。
91.天然tcr的α链的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3和cdr3由vα基因编码。天然tcr的β链的fr1、cdr1、fr2、cdr2和fr3由vα基因编码。
92.由于本领域已知每个可变基因的种系序列(参见scaviner与lefranc；如上文；和folch与lefranc；上文)，可以对具体tcr的vα和/或vβ测序并且可以鉴定tcr中使用的种系v区段(参见，例如，hodges等人,2003；j clin pathol；56:1-11；zhou等人,2006；laboratory investigation；86；314-321；所述文献通过引用方式并入本文)。
93.本发明提供包含工程化t细胞受体的工程化treg。
94.本发明提供工程化的treg，其包含能够在相对于mbp 82-102(seq id no:12)或其片段包含至少90％同一性的肽由主要组织相容性复合体(mhc)分子呈递时，与该肽特异性结合的tcr。在一个方面，tcr包含α链和β链，
95.其中α链和β链各自包含三个互补决定区(cdr)并且每个cdr3的序列如下：
96.cdr3α-atdttsgtykyi(seq id no:1)
97.cdr3β-sardltsganneqf(seq id no:2)
98.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体。
99.在一个方面，tcr的α链包含三个具有以下氨基酸序列的cdr：
100.cdr1α-tsinn(seq id no:3)
101.cdr2α-irsnere(seq id no:4)
102.cdr3α-atdttsgtykyi(seq id no:1)
103.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体；
104.并且其中tcr的β链包含三个具有以下氨基酸序列的cdr：
105.cdr1β-dfqatt(seq id no:5)
106.cdr2β-snegska(seq id no:6)
107.cdr3β-sardltsganneqf(seq id no:2)
108.或这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体。
109.适当地，cdr中的氨基酸变化是保守性置换、插入或缺失。优选地，氨基酸变化是保守性置换。
110.在一个方面，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有80％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有80％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。适当地，cdr序列是如本文中公开那样。适当地，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有80％、85％、90％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列、并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有80％、85％、90％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
111.适当地，tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有85％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有85％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。
112.适当地，tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有90％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有90％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。适当地，tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有95％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有95％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。适当地，tcr的α链的可变区可以包含与seq id no:7具有97％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有97％序列同一性的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。适当地，tcr的α链的可变区可以包含seq id no:7中所述的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含seq id no:8中所述的氨基酸序列，其中序列同一性不包含cdr序列。
113.换言之，tcr可以包含如本文定义的并且以与seq id no:7和/或seq id no:8的剩余序列中至少80％,85％,90％,95％或97％序列同一性的α链和β链。
114.在另一个方面，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有80％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有80％序列同一性的氨基酸序列。
115.适当地，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有85％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有85％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有90％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β
链的可变区包含与seq id no:8具有90％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有95％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有95％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链的可变区包含与seq id no:7具有97％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链的可变区包含与seq id no:8具有97％序列同一性的氨基酸序列。
116.例证性的tcrα链可变区(seq id no:7)
117.sqqgeedpqalsiqegenatmncsyktsinnlqwyrqnsgrglvhlilirsnerekhsgrlrvtldtskksssllitasraadtasyfcatdttsgtykyifgtgtrlkvlan
118.例证性的tcrβ链可变区(seq id no:8)
119.gavvsqhpswvicksgtsvkiecrsldfqattmfwyrqfpkqslmlmatsnegskatyeqgvekdkflinhasltlstltvtsahpedssfyicsardltsganneqffgpgtrltvl
120.在一个方面，tcr的α链包含与seq id no:9具有80％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链包含与seq id no:10具有80％序列同一性的氨基酸序列。
121.例证性的tcrα链(seq id no:9)
122.sqqgeedpqalsiqegenatmncsyktsinnlqwyrqnsgrglvhlilirsnerekhsgrlrvtldtskksssllitasraadtasyfcatdttsgtykyifgtgtrlkvlaniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
123.例证性的tcrβ链(seq id no:10)gavvsqhpswvicksgtsvkiecrsldfqattmfwyrqfpkqslmlmatsnegskatyeqgvekdkflinhasltlstltvtsahpedssfyicsardltsganneqffgpgtrltvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg
124.适当地，tcr的β链包含人恒定区氨基酸序列，其在恒定区(下划线)位置22处包含半胱氨酸残基，如seq id no:10中所示。
125.适当地，tcr的α链包含与seq id no:9具有85％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链包含与seq id no:10具有85％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链包含与seq id no:9具有90％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链包含与seq id no:10具有90％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链包含与seq id no:9具有95％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链包含与seq id no:10具有95％序列同一性的氨基酸序列。适当地，tcr的α链包含与seq id no:9具有97％序列同一性的氨基酸序列，并且tcr的β链包含与seq id no:10具有97％序列同一性的氨基酸序列。
126.在另一个方面，tcr的α链和β链的恒定区结构域各自包含额外的半胱氨酸残基，从而使得在α链和β链之间形成额外二硫键成为可能。
127.适当地，恒定α链中的残基48从苏氨酸转换成半胱氨酸并且恒定β链中的残基57从丝氨酸转换成半胱氨酸，以便形成额外的二硫键。
128.适当地，tcr经密码子优化。
129.适当地，tcr针对小鼠中表达进行密码子优化。
130.在一个方面，tcr中所用的恒定结构域是鼠序列。
131.适当地，恒定区已经鼠化。例如，恒定-α结构域和恒定-β结构域均已经鼠化。
132.在另一个方面，tcr针对人类中表达进行密码子优化。适当地，tcr中所用的恒定结构域是人序列。
133.在一个方面，tcr可以例如包含人可变区和鼠恒定区。
134.本发明的tcr可以包含不由种系vα或vβ基因编码的一个或多个如本文定义的氨基酸残基。换言之，tcr可以包含α链和/或β链的部分，其中与如未改变的种系vα或vβ基因编码的相应α链和/或β链相比，所述的部分在本文所述的一个或多个位置包含改变的氨基酸残基。根据国际免疫遗传学信息体系(imgt)鉴定了本文中作为构架区(fr)或互补性决定区(cdr)鉴定的氨基酸残基。这个体系是本领域公知的(lefrance等人,2003；dev comp immunol；27:55-77)并基于高保守的可变区结构。编号考虑并合并了fr和cdr的定义、来自x光衍射研究的结构数据和高变环的表征。
135.在imgt编号体系范围内规定fr区和cdr区的定界。fr1区包含位置1
–
26(25
–
26个氨基酸，取决于v-gene群或亚群)，第1-cys在位置23处。fr2区包含位置39
–
55(16
–
17个氨基酸)，在位置41处有一个保守的trp。fr3区包含位置66
–
104(36
–
39个氨基酸，取决于vgene群或亚群)，在位置89处有一个保守的疏水性氨基酸且在位置104处具有第2-cys。igmt编号体系的残基1是fr1中的第一残基。igmt编号体系的残基104是fr3中的最后残基。
136.本领域已知适于生成本发明tcr的方法。
137.例如，可以进行诱变，以改变编码tcr的核酸序列中的具体核苷酸。这种诱变将改变tcr的氨基酸序列，从而它包含一个或多个如本文所述的氨基酸残基。
138.诱变方法的实例是quikchange法(papworth等人；1996；strategies；9(3)；3-4)。这种方法涉及使用一对互补性致突变引物，使用高保真无链置换作用的dna聚合酶(如pfu聚合酶)，在热循环反应中扩增模板核酸序列。
139.如本文所用的术语“一个或多个”或“至少一个”可以包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个如本文所述的氨基酸残基。
140.如本文所用的术语“两个或更多个”可以包括、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个如本文所述的氨基酸残基。
141.保守性置换
142.适当地，本发明中在给定位置存在的氨基酸残基可以定义为是与针对给定seq id nos所列举的氨基酸在生物化学上相似的残基。
143.具有相似生物化学属性的氨基酸可以定义为可以经由保守性置换来替换的氨基酸。
144.可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性本质的相似性进行“保守性”氨基酸置换，只要保留tcr高表达即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的具有不带电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
145.可以例如根据下表3进行保守性置换。在第二列中处于相同格子内并且优选处于
第三列相同行中的氨基酸可以互相置换。
146.表3
[0147][0148][0149]
本发明还涵盖同源性置换(置换和替换在本文中均用来意指现存氨基酸残基与替代性残基的互换)，即，同质置换，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性置换等。
[0150]
除非本文中通过引用具体、独立的氨基酸的方式另外明确地声明，否则可以使用如下文所列举的保守性置换，置换氨基酸。
[0151]
脂族非极性氨基酸可以是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基。脂族、极性不带电荷的氨基酸可以是半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺残基。
[0152]
脂族、极性带电荷的氨基酸可以是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸残基。
[0153]
芳族氨基酸可以是组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸残基。
[0154]
适当地，可以在表3的相同行里的氨基酸之间进行保守性置换。
[0155]
序列
[0156]
本发明还提供编码本文所述的tcrα链和/或β链的核苷酸序列。在一个方面，可以向细胞引入编码本文所述的tcr的核苷酸序列。
[0157]
适当地，编码tcr的α链可变区的核苷酸序列可以包含seq id no:14或与seq id no:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。适当地，所述核苷酸序列可以具有与seq id no:14至少85％、90％、95％或99％的同一性。
[0158]
seq id no:14
[0159]
agccagcagggcgaagaggatccccaggctctgtctattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgcagctacaagaccagcatcaacaacctgcagtggtacagacagaacagcggcagaggactggtgcacctgatcctgatcagaagcaacgagagagagaagcactccggcagactgagagtgaccctggacaccagcaagaagtccagcagcctgctgatcacagccagcagagccgccgataccgccagctacttttgtgccaccgataccacctccggcacctacaagtacatcttcggcaccggcaccagactgaaggtgctggccaac
[0160]
适当地，编码tcr的β链可变区的核苷酸序列可以包含seq id no:15或与seq id no:15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。适当地，所述核苷酸序列可以具有与seq id no:15至少85％、90％、95％或99％的同一性。
[0161]
seq id no:15
[0162]
ggagctgtggtgtctcagcacccctcttgggtcatctgcaagagcggcaccagcgtgaagatcgagtgcagaagcctggacttccaggccaccaccatgttttggtacaggcagttccccaagcagagcctgatgctgatggccac
ctctaacgagggcagcaaggccacatatgagcagggcgtcgagaaggacaagttcctgatcaaccacgccagcctgacactgagcaccctgacagtgacaagcgcccatcctgaggacagcagcttctacatctgcagcgccagggatctgacaagcggcgccaacaacgagcagttctttggccctggcaccaggctgacagtgctc
[0163]
适当地，编码tcr的α链的核苷酸序列可以包含seq id no:16或与seq id no:16具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。适当地，所述核苷酸序列可以具有与seq id no:16至少85％、90％、95％或99％的同一性。
[0164]
seq id no:16
[0165]
agccagcagggcgaagaggatccccaggctctgtctattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgcagctacaagaccagcatcaacaacctgcagtggtacagacagaacagcggcagaggactggtgcacctgatcctgatcagaagcaacgagagagagaagcactccggcagactgagagtgaccctggacaccagcaagaagtccagcagcctgctgatcacagccagcagagccgccgataccgccagctacttttgtgccaccgataccacctccggcacctacaagtacatcttcggcaccggcaccagactgaaggtgctggccaacattcagaaccccgatcctgccgtgtaccagctgagagacagcaagagcagcgacaagagcgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgatgtgtatatcaccgacaagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagtcctgagagcagctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaggtggccggcttcaacctgctgatgaccctgagactttggagcagc
[0166]
适当地，编码tcr的β链的核苷酸序列可以包含seq id no:17或与seq id no:17具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。适当地，所述核苷酸序列可以具有与seq id no:17至少85％、90％、95％或99％的同一性。
[0167]
seq id no:17
[0168]
ggagctgtggtgtctcagcacccctcttgggtcatctgcaagagcggcaccagcgtgaagatcgagtgcagaagcctggacttccaggccaccaccatgttttggtacaggcagttccccaagcagagcctgatgctgatggccacctctaacgagggcagcaaggccacatatgagcagggcgtcgagaaggacaagttcctgatcaaccacgccagcctgacactgagcaccctgacagtgacaagcgcccatcctgaggacagcagcttctacatctgcagcgccagggatctgacaagcggcgccaacaacgagcagttctttggccctggcaccaggctgacagtgctcgaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagccttctgaggccgagatctgtcacacccagaaagccacactcgtgtgtctggccaccggcttctaccccgatcacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtcagcacagatccccagccactgaaagaacagcccgctctgaacgacagccggtactgtctgtctagccggctgagagtgtccgccaccttctggcagaaccccagaaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgatgagtggacccaggatagagccaagcctgtgacacagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgtggctttaccagcgagagctaccagcaaggcgtgctgtctgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaagccactctgtacgccgtgctggtttctgccctggtcctgatggctatggtcaagcggaaggactctagaggc
[0169]
如本文所用，术语“引入”指将外来dna插入细胞中的方法。如本文所用，术语引入包括转导法和转染法。转染是通过非病毒方法向细胞引入核酸的过程。转导是借助病毒载体向细胞引入外来dna的过程。
[0170]
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”意在彼此同义。核酸序列可以是任何合适类型的核苷酸序列，如合成性rna/dna序列、cdna序列或部分基因组dna序列。
[0171]
如本文所用的术语“多肽”按正常含义用来意指一般通过毗邻氨基酸的α-氨基和
羧基之间的肽键彼此连接的一连串残基，一般是l-氨基酸。该术语同义于“蛋白质”。
[0172]
技术人员将理解，作为遗传密码简并性的结果，众多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，熟练技术人员可以利用例行技术，做出不影响由本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸替换，以反映其中待表达多肽的任何具体宿主生物的密码子选择。本发明的核酸可以包括dna或rna。它们可以是单链或双链的。它们也可以是在其内部包括合成性或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知许多不同类型的寡核苷酸修饰。这些修饰包括甲基磷酸酯主链和硫代磷酸酯主链、在分子的3'末端和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于如本文所述的用途的目的，应当理解，可以通过本领域中可用的任何方法修饰多核苷酸。可以实施这类修饰以增强目的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0173]
多核苷酸可以处于分离或重组的形式。可以将它并入载体中并且可以将载体并入宿主细胞中。这类载体和合适的宿主又形成本发明的其他方面。
[0174]
多核苷酸可以是双链或单链的，并且可以是rna或dna。
[0175]
多核苷酸可以经密码子优化。不同细胞在其特定密码子利用率方面不同。这种密码子偏好性对应于细胞类型中特定trna的相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子，从而调整它们以匹配于相应trna的相对丰度，可以增加表达。适当地，多核苷酸可以为疾病的鼠模型中表达进行密码子优化。适当地，多核苷酸可以为人类受试者中表达进行密码子优化。
[0176]
许多病毒，包括hiv和其他慢病毒，使用多种稀有密码子，并且通过改变这些稀有密码子，以对应于常用的哺乳动物密码子，可以在哺乳动物生产细胞中实现包装组件的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表。
[0177]
密码子优化还可以涉及消除mrna不稳定性基序和隐匿性剪接位点。
[0178]
多核苷酸可以包含一个核酸序列，所述核酸序列使得编码α链的核酸序列和编码β链的核酸序列二者从同一mrna转录物表达成为可能。
[0179]
例如，多核苷酸可以在编码α链和β的核酸序列之间包含内部核糖体进入位点(ires)。ires是允许在mrna序列的中间启动翻译的核苷酸序列。
[0180]
多核苷酸可以包含由内部自我剪切性序列连接的编码α链的核酸序列和编码β链的核酸序列。内部自我剪切性序列可以是使得包含α链的多肽和包含β链的多肽变得分离成为可能的任何序列。
[0181]
该剪切位点可以有自我剪切性，从而当产生多肽时，它立即被切割成独立肽，无需任何外部剪切活性。
[0182]
出于方便，本文中使用术语“剪切”，但是剪切位点可以通过除经典剪切作用之外的机制，使肽分离成独立的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自我剪切性肽，已经提出多种模型解释“剪切”活性：借助宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自动蛋白酶解或翻译效应(donnelly等人(2001)j.gen.virol.82:1027-1041，所述文献通过引用方式并入本文)。出于本发明目的，这类“剪切作用”的确切机制不重要，只要位于编码蛋白质的核酸序列之间时，剪切位点引起蛋白质作为独立实体表达即可。
[0183]
自我剪切性肽可以是来自口蹄疫病毒或心病毒的2a自我剪切性肽。
[0184]
可以根据相似性(即具有相似化学属性/功能的氨基酸残基)认定变体，优选地，根据术语序列同一性表述变体。
[0185]
可以通过肉眼或更常见地借助轻易可获得的序列比较程序，进行序列比较。这些公众可获得且市售的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的序列同一性。
[0186]
可以在连续序列范围内计算序列同一性，即，将一个序列与另一个序列对齐并且将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称作“无空位比对”。一般，这类无空位比对仅在相对小数目的残基范围(例如少于50个连续氨基酸)内进行。尽管这是一种非常简单和一致的方法，但是它没有考虑到例如当执行全局比对时，例如在另外的相同序列对中，一个插入或缺失将导致后续氨基酸残基从比对结果中出局，因此可能造成同源性％大大降低。因此，大部分序列比较方法设计成产生最佳比对结果，所述的最佳比对结果考虑了可能的插入和缺失，而没有不当地罚除总体同源性评分。这通过在序列比对结果中插入“空位”以尽力使局部同源性最大化来实现。
[0187]
然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，从而，对于相同数目的相同氨基酸，空位尽可能少-反映两个所比较序列之间更高的相关性-的序列比对结果将比具有许多空位的一个序列比对结果实现更高评分。一般使用“仿射空位成本”，它对缺口的存在要求相对高的成本并且对空位中的每个后续残基要求较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的优化比对结果。大多数比对程序允许调整空位罚分。然而，使用这种软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，使用gcg wisconsin bestfit软件包(参见下文)时，氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12和每个延伸-4。最大序列同一性％的计算因而首先要求在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对结果。用于开展此类比对的合适计算机程序是gcg wisconsin bestfit软件包(美国威斯康辛大学；devereux等人,1984,nucleic acids research 12:387，所述文献通过引用方式并入本文)。可以执行序列比较的其他软件的实例包括但不限于blast软件包(参见ausubel等人,1999ibid
–
第18章)、fasta(atschul等人,1990,j.mol.biol.,403-410，所述文献通过引用方式并入本文)和geneworks比较工具软件包。blast和fasta均可用于离线和在线搜索(见ausubel等人,1999 ibid,第7-58页至第7-60页，所述文献通过引用方式并入本文)。然而，优选使用gcg bestfit程序。
[0188]
在一个实施方案中，在整个序列范围内测定序列同一性。在一个实施方案中，在与本文援引的序列正在比较的整个候选序列范围内测定序列同一性。
[0189]
尽管可以就同一性方面测量最终序列同一性，然而比对过程本身一般不基于全或无配对比较。相反，通常使用比例相似性评分矩阵，该评分矩阵基于化学相似性或进化距离对每个成对比较结果分配评分。此种常使用的矩阵的例子是blosum62矩阵-即程序blast套装的默认矩阵。gcg wisconsin程序通常使用公共默认值或定制符号比较表，若提供(关于进一步细节，参见用户手册)。优选使用gcg软件包的公共默认值，或在其他软件的情况下，优选使用默认矩阵，如blosum62。
[0190]
一旦软件已经产生最佳比对结果，则可能计算序列同一性％。该软件一般将此作为序列比较的一部分并产生数值结果。
[0191]
本发明的术语“变体”包括从序列中或对序列进行任何置换、变异、修饰、替换、缺失或添加一个或多个氨基酸，条件是所得到的氨基酸序列基本上保留与未修饰的序列相同的活性。例如，可以进行保守性氨基酸置换。如本文所用，变体多肽意在包括一种多肽，所述多肽包含与本文中所示序列至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序
列。在一个方面，变体维持亲本序列的功能。
[0192]
foxp3
[0193]
在一个方面，根据本发明的细胞包含已经被引入细胞的编码foxp3蛋白的核苷酸序列。
[0194]
在一个方面，本发明的细胞、工程化treg或药物组合物可以包含工程化的编码foxp3蛋白的核酸序列，换言之，该工程化的核酸序列不是细胞内源性基因组的部分。
[0195]
foxp3是转录因子fox蛋白家族的成员并且作为调节性t细胞发育和功能中调节途径的主调节因子发挥作用。
[0196]
适当地，foxp3多肽来自人，例如uniprotkb登录号：q9bzs1：
[0197]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahassss
[0198]
lnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrr
[0199]
hlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgp(seq id no:18)。
[0200]
适当地，foxp3多肽包含seq id no:18中所述的氨基酸序列或其片段。适当地，foxp3多肽包含与seq id no:18至少80％相同的氨基酸序列或其片段。适当地，该多肽包含与seq id no:18为85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其片段。适当地，该片段保留foxp3活性。适当地，该片段能够与foxp3靶结合并充当转录因子。
[0201]
适当地，foxp3多肽可以是seq id no:18的天然变体。适当地，foxp3多肽是seq id no:18的同工型。例如，foxp3多肽可以相对于seq id no:18包含氨基酸位置72-106的缺失。备选地，foxp3多肽可以相对于seq id no:18包含氨基酸位置246-272的缺失。适当地，foxp3多肽包含seq id no:25中所述的氨基酸序列。
[0202]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqveelsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgpegrgslltcgdveen(seq id no:19)。
[0203]
适当地，foxp3多肽包含seq id no:19中所述的氨基酸序列或其片段。适当地，foxp3多肽包含与seq id no:19至少80％相同的氨基酸序列或其片段。适当地，该多肽包含与seq id no:19为85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列或其片段。适当地，该片段保留foxp3活性。适当地，该片段能够与foxp3靶结合并充当转录因子。
[0204]
适当地，foxp3多肽可以是seq id no:19的天然变体。适当地，foxp3多肽是seq id no:19的同工型。例如，foxp3多肽可以相对于seq id no:19包含氨基酸位置72-106的缺失。备选地，foxp3多肽可以相对于seq id no:19包含氨基酸位置246-272的缺失。
[0205]
适当地，foxp3多肽由seq id no:20中所述的多核苷酸序列编码：
[0206]
atgcccaaccccaggcctggcaagccctcggccccttccttggcccttggcccatccccaggagcctcgcccagctggagggctgcacccaaagcctcagacctgctgggggcccggggcccagggggaaccttccagggccgagatcttcgaggcggggcccatgcctcctcttcttccttgaaccccatgccaccatcgcagctgcagctgcccacactgcccctagtcatggtggcaccctccggggcacggctgggccccttgccccacttacaggcactcctccaggacaggccacatttcatgcaccagctctcaacggtggatgcccacgcccggacccctgtgctgcaggtgcaccccctggagagcccagccatgatcagcctcacaccacccaccaccgccactggggtcttctccctcaaggcccggcctggcctcccacctgggatcaacgtggccagcctggaatgggtgtccagggagccggcactgctctgcaccttcccaaatcccagtgcacccaggaaggacagcaccctttcggctgtgccccagagctcctacccactgctggcaaatggtgtctgcaagtggcccggatgtgagaaggtcttcgaagagccagaggacttcctcaagcactgccaggcggaccatcttctggatgagaagggcagggcacaatgtctcctccagagagagatggtacagtctctggagcagcagctggtgctggagaaggagaagctgagtgccatgcaggcccacctggctgggaaaatggcactgaccaaggcttcatctgtggcatcatccgacaagggctcctgctgcatcgtagctgctggcagccaaggccctgtcgtcccagcctggtctggcccccgggaggcccctgacagcctgtttgctgtccggaggcacctgtggggtagccatggaaacagcacattcccagagttcctccacaacatggactacttcaagttccacaacatgcgaccccctttcacctacgccacgctcatccgctgggccatcctggaggctccagagaagcagcggacactcaatgagatctaccactggttcacacgcatgtttgccttcttcagaaaccatcctgccacctggaagaacgccatccgccacaacctgagtctgcacaagtgctttgtgcgggtggagagcgagaagggggctgtgtggaccgtggatgagctggagttccgcaagaaacggagccagaggcccagcaggtgttccaaccctacacctggcccctga(seq id no:20)
[0207]
在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:20或其功能性片段至少80％相同的多核苷酸序列。适当地，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:20或其功能性片段至少85％、90％、95％、98％或99％相同的多核苷酸序列。在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含seq id no:20或其功能性片段。
[0208]
适当地，foxp3多肽由seq id no:21中所述的核酸序列编码：
[0209]
gaattcgtcgacatgcccaaccccagacccggcaagccttctgccccttctctggccctgggaccatctcctggcgcctccccatcttggagagccgcccctaaagccagcgatctgctgggagctagaggccctggcggcacattccagggcagagatctgagaggcggagcccacgcctctagcagcagcctgaatcccatgccccctagccagctgcagctgcctacactgcctctcgtgatggtggcccctagcggagctagactgggccctctgcctcatctgcaggctctgctgcaggaccggccccactttatgcaccagctgagcaccgtggacgcccacgccagaacacctgtgctgcaggtgcaccccctggaaagccctgccatgatcagcctgacccctccaaccacagccaccggcgtgttcagcctgaaggccagacctggactgccccctggcatcaatgtggccagcctggaatgggtgtcccgcgaacctgccctgctgtgcaccttccccaatcctagcgcccccagaaaggacagcacactgtctgccgtgccccagagcagctatcccctgctggctaacggcgtgtgcaagtggcctggctgcgagaaggtgttcgaggaacccgaggacttcctgaagcactgccaggccgaccatctgctggacgagaaaggcagagcccagtgcctgctgcagcgcgagatggtgcagtccctggaacagcagctggtgctggaaaaagaaaagctgagcgccatgcaggcccacctggccggaaagatggccctgacaaaagccagcagcgtggccagctccgacaagggcagctgttgtatcgtggccgctggcagccagggacctgtggtgcctgcttggagcggacctagagaggcccccgatagcctgtttgccgtgcggagacacctgtggggcagccacggcaactctaccttccccgagttcctgcacaacatggactacttcaagttccacaacatgaggccccccttcacctacgccaccctgatcagatgggccattctggaagcccccgagaagcagcggaccctgaacgagatctaccactggtttacccggatgttcgccttct
tccggaaccaccccgccacctggaagaacgccatccggcacaatctgagcctgcacaagtgcttcgtgcgggtggaaagcgagaagggcgccgtgtggacagtggacgagctggaatttcggaagaagcggtcccagaggcccagccggtgtagcaatcctacacctggccctgagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcc(seq id no:21)。
[0210]
适当地，foxp3多肽由seq id no:21中所述的核酸序列或其片段编码。适当地，foxp3多肽由与seq id no:21至少80％相同的核酸序列或其片段编码。适当地，foxp3多肽由与seq id no:21为85％、90％、95％、98％或99％相同的核酸序列或其片段编码。适当地，该片段保留foxp3活性。适当地，该片段编码的多肽能够与foxp3靶结合并充当转录因子。
[0211]
编码tcr和/或foxp3的核酸可以包含起始密码子上游的前导序列。这个序列可以调节转录物的翻译。通过举例，用于本发明中的合适的前导序列是：metllgvslvilwlqlarvn(seq id no:22)和mlllllllgpgislllpgslagsgl(seq id no:23)。
[0212]
在又一个方面，本发明提供一种核酸序列套件，其包含：
[0213]
编码如本文定义的tcr的第一核酸序列和编码foxp3的第二核酸。
[0214]
载体
[0215]
本发明还提供一种载体，其包含编码如本文所述的tcr的核苷酸序列。适当地，该载体可以另外包含编码叉头框p3(foxp3)多肽的核苷酸序列。在一个方面，提供一种载体套件，其包含一个或多个本发明核酸序列，诸如编码如本文定义的tcr的核酸和编码foxp3的核酸。术语“载体”包括表达载体，即，使得本发明tcr即α链和/或β链的表达成为可能的构建体。适当地，载体额外地使得表达foxp3多肽的表达成为可能。在一些实施方案中，载体是克隆载体。
[0216]
如果该载体除了包括编码foxp3的多核苷酸外，还包含编码tcr的多核苷酸；该载体可以具有以下方向：5'foxp3-tcr 3'。因此，编码foxp3的多核苷酸可以在编码tcr的多核苷酸的5'方向。
[0217]
适当地，编码foxp3的多核苷酸可以与编码tcr的多核苷酸被核酸序列分隔开，这使得编码foxp3的核酸序列和编码tcr的核酸序列都能从同一个mrna转录本上表达。
[0218]
例如，多核苷酸可以在编码(i)foxp3和(ii)tcr的核酸序列之间包含一个内部核糖体进入位点(ires)。ires是一种允许在mrna序列的中间启动翻译的核苷酸序列。
[0219]
该多核苷酸可以包含由内部自剪切序列连接的编码(i)foxp3和(ii)tcr的核酸序列。编码tcrα和β链的多核苷酸也可以通过内部自剪切序列分隔开。
[0220]
适当地，该载体可以具有这样的结构。5'强启动子(例如ltr)-foxp3-2a-tcr-3'ltr。这里，foxp3的表达是由强ltr启动子直接驱动的，以达到最佳表达。tcr前有一个2a序列，因此tcr的表达依赖于ltr启动子活性和2a自剪切活性两者。重要的是，foxp3在5'到3'方向先于tcr的配置确保了tcr的表达只能在foxp3已经表达时发生，并且没有foxp3表达的tcr的表达不会发生。这在本发明的工程化treg中是一个特别的优势，因为它降低了工程treg获得效应表型的风险和/或降低了与引入tcr到起始群体中存在的t效应细胞之中相关的风险。
[0221]
剪切序列可以是任何序列，其使得包含(i)foxp3和(ii)tcr的多肽分离。
[0222]
剪切位点可以是自剪切的，这样当多肽产生时，它立即被剪切成单个的多肽，而不需要任何外部剪切活性。
[0223]
为方便起见，这里使用了"剪切"一词，但剪切位点可以通过经典剪切以外的机制使多肽分成单个的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自剪切肽，已经提出了各种模型来解释"剪切"活性：宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自体蛋白分解或翻译效应(translational effect)(donnelly等人(2001)j.gen.virol.82:1027-1041，以参考方式并入本文)。只要当剪切位点位于编码蛋白质的核酸序列之间时引起蛋白质作为单独的实体被表达，这种"剪切"的确切机制对本发明的目的来说并不重要。
[0224]
自剪切多肽可以是来自口蹄疫或心病毒的2a自剪切多肽。
[0225]
变体可以从相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)方面考虑，优选以序列同一性来表示变体。
[0226]
序列比较可以通过肉眼进行，或更通常地，借助于现成的序列比较程序。这些公开的和商业化的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的序列同一性。
[0227]
适当地，从本载体中表达的foxp3多肽可以被定位在一个自剪切肽例如2a自剪切肽的n端。这样的foxp3-2a多肽可以包含seq id no：24或25所示的序列；或seq id no：24或25的变体，其与之至少80％相同。合适地，该变体可与seq id no:24或25至少85、90、95、98或99％相同。
[0228]
seq id no:24
[0229]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgpgatnfsllkqagdveenpgps
[0230]
seq id no:25
[0231]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqveelsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgpegrgslltcgdveengatnfsllkqagdveenpgps
[0232]
合适的载体可以包括但不限于质粒、病毒载体、转座子、与多肽复合或固定化到固相粒子上的核酸。
[0233]
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
[0234]
逆转录病毒是生活周期异于裂解性病毒的rna病毒。在这个方面，逆转录病毒是借助dna中间体复制的感染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组由逆转录酶酶转化成dna形式。dna副本充当模板，所述模板用于产生为组装出感染性病毒粒子必需的新rna基因组和病毒编码的蛋白质。
[0235]
存在许多逆转录病毒，例如鼠白血病病毒(mlv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、马传染性
贫血病毒(eiav)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)、fujinami肉瘤病毒(fusv)、莫洛尼鼠白血病病毒(mo-mlv)、fbr鼠骨肉瘤病毒(fbr msv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(mo-msv)、abelson鼠白血病病毒(a-mlv)、禽髓细胞增多症病毒-29(mc29)和禽成红细胞增多症病毒(aev)和全部其他逆转录病毒科病毒，包括慢病毒。
[0236]
可以在coffin等人(“retroviruses”1997cold spring harbour laboratory press编者：jm coffin,sm hughes,he varmus第758-763页)中找到详细的逆转录病毒名单，所述文献通过引用方式并入本文。
[0237]
慢病毒也属于逆转录病毒科，不过它们可以感染分裂性和非分裂性细胞(lewis等人(1992)embo j.3053-3058)，所述文献通过引用方式并入本文。
[0238]
载体可以有能力将本发明的多核苷酸转移至细胞，例如如本文定义的宿主细胞。载体应当理想地能够在宿主细胞中持久地高水平表达，从而α链和/或β链适当地在宿主细胞中表达。
[0239]
载体可以是逆转录病毒载体。载体可以基于或可衍生自mp71载体骨架。载体可以缺少全长或截短形式的美洲旱獭肝炎反应元件(wpre)。
[0240]
为了高效感染人细胞，可以用兼嗜性包膜蛋白或长臂猿猿白血病病毒包膜蛋白包装病毒粒子。
[0241]
细胞
[0242]
本发明还提供包含本发明多核苷酸或载体的细胞，例如宿主细胞。
[0243]
宿主细胞可以是可以用来表达并产生tcr的任何细胞。
[0244]
适当地，细胞是t细胞，如常规t细胞。
[0245]
适当地，细胞是treg细胞。
[0246]
在一个方面，细胞，如t细胞或treg，可以分离自从受试者获得的血液。适当地，细胞，如t细胞或treg，分离自从受试者获得的外周血单个核细胞(pbmcs)。
[0247]
适当地，细胞是表达foxp3的天然treg。
[0248]
在一个方面，细胞是干细胞。
[0249]
在另一个方面，细胞是祖细胞。
[0250]
如本文所用，术语“干细胞”意指能够无限产生相同类型的更多干细胞并且可以从其中通过分化生成其他专化细胞的未分化细胞。干细胞是多能的。干细胞可以例如是胚胎干细胞或成年干细胞。
[0251]
如本文所用，术语“祖细胞”意指能够分化以形成一个或多个类型细胞，但在体外具有有限自我更新的细胞。
[0252]
适当地，细胞能够分化成t细胞，如treg。
[0253]
适当地，细胞有能力分化成成表达foxp3的t细胞如treg。
[0254]
适当地，细胞是人细胞。适当地，细胞是人treg。
[0255]
适当地，细胞可以是胚胎干细胞(esc)。适当地，细胞是造血干细胞或造血祖细胞。适当地，细胞是诱导型多潜能干细胞(ipsc)。适当地，细胞可以是从获得的脐带血。适当地，细胞可以是从成体外周血获得。
[0256]
在一些方面，可以从脐带血获得造血干细胞和祖细胞(hspc)。脐带血可以根据本领域已知的技术收获(例如，美国专利号7,147,626和7,131,958，所述文献通过引用方式并
入本文)。
[0257]
在一个方面，hspc可以从多潜能干细胞源(例如，诱导型多潜能干细胞(ipscs)和胚胎干细胞(escs))获得。
[0258]
如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“hspc”指表达抗原性标志物cd34(cd34 )的细胞和这类细胞的群体。在具体的实施方案中，术语“hspc”指依据存在抗原性标志物cd34(cd34

)和不存在谱系(lin)标志物鉴定的细胞。包含cd34 和/或lin(-)细胞的细胞群体包括造血干细胞和造血祖细胞。
[0259]
hspc可以从成体骨髓获得或分离，所述成体骨髓包括股骨、髋骨、肋骨、胸骨和其他骨。可以使用针头和注射器，从髋骨直接获得或分离含有hspc的骨髓穿刺物。其他hspc来源包括脐带血、胎盘血、动员的外周血，wharton胶、胎盘、胎儿血、胎儿肝或胎儿脾。在具体的实施方案中，收获足够的量hspc用于治疗应用可能需要在受试者中动员干细胞和祖细胞。
[0260]
如本文所用，术语“诱导型多潜能干细胞”或“ipsc”指已经被再编程到多能状态的非多能细胞。一旦已经将受试者的细胞再编程到多潜能状态，则可以将细胞编程到达所需的细胞类型，如造血干细胞或祖细胞(分别是hsc和hpc)。
[0261]
如本文所用，术语“再编程”涉及一种增加细胞潜力到较低分化状态的方法。
[0262]
如本文所用，术语“编程”涉及一种降低细胞潜力或使细胞分化到较高分化状态的方法。适当地，细胞匹配于受试者或相对受试者为自体。细胞可以从自患者的自身外周血(第1部分)、或在来自供体外周血的造血干细胞移植物时的情况下(第2部分)、或在来自无关供体的外周血时的情况下(第3部分)离体生成。
[0263]
适当地，细胞相对受试者为自体。适当地，受试者是人。
[0264]
在一些方面，细胞可以从诱导性祖细胞或胚性祖细胞离体分化成免疫细胞衍生。在这些情况下，通过采用许多手段之一(包括用病毒载体转导、用dna或rna转染)，引入编码本发明tcr的dna或rna，产生细胞。
[0265]
适当地，通过采用许多手段之一(包括用病毒载体转导、或者用dna或rna转染)，除本发明的tcr以外引入编码foxp3的dna或rna，产生细胞。
[0266]
如本文所用，术语“常规t细胞”或tconv意指表达αβt细胞受体(tcr)以及可以是分化抗原簇4(cd4)或分化抗原簇8(cd8)的辅助受体的t淋巴细胞细胞。常规t细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。foxp3由胸腺衍生的tregs表达并且可以由新近活化的常规t细胞表达。如本文所用，术语“调节性t细胞”或treg意指表达标志物cd4、cd25和foxp3的t细胞(cd4

cd25

foxp3

)。也可以使用细胞表面标志物cd4和cd25，在表面蛋白cd127不存在下或组合其低水平的表达(cd4

cd25

cd127-)，鉴定treg。treg还可以在细胞表面上表达高水平的ctla-4(细胞毒t-淋巴细胞相关分子-4)或gitr(糖皮质激素诱导的tnf受体)。不通于常规t细胞，调节性t细胞不产生il-2并且因此在基线时无活力。treg细胞包括胸腺衍生的天然treg(ntreg)细胞和外周生成的诱导型treg(itreg)细胞。
[0267]
在一个方面，treg为cd4

cd25

foxp3

t细胞
[0268]
在一个方面，treg为cd4

cd25

cd127-t细胞。
[0269]
在一个方面，treg为cd4

cd25

foxp3

cd127-t细胞。
[0270]
如本文所用，术语“天然t reg”意指胸腺衍生的treg。天然t regs是cd4

cd25

foxp3

helios

neuropilin1

。与itreg相比，ntregs具有更高的pd-1(程序性细胞死亡-1，pdcd1)、神经纤毛蛋白1(nrp1)、helios(ikzf2)和cd73表达。ntreg可以基于单独地表达helios蛋白或神经纤毛蛋白1(nrp1)与itreg区分。
[0271]
如本文所用，术语“诱导的调节性t细胞”(itreg)意指从胸腺外部成熟cd4

常规t细胞发育而来的cd4

cd25

foxp3

helios-neuropilin1-t细胞。例如，itregs可以在il-2和tgf-β存在下从cd4

cd25-foxp3-细胞体外诱导。
[0272]
本发明的方法可包括将编码本tcr的第一核苷酸序列和编码foxp3的第二核苷酸序列引入如本文所描述的天然treg(其已表达内源性foxp3)。适当地，本发明的方法包括引入一个载到如本文定义的天然treg中，所述载体除了包含编码foxp3的多核苷酸外，还包含编码本tcr的多核苷酸；其中该载体具有以下方向：5'foxp3-tcr 3'(如本文所述)。因此，编码foxp3的多核苷酸可以在编码tcr的多核苷酸的5'方向。在不希望受理论约束的情况下，本发明人已经表明，外源性foxp3在调节性t细胞(tregs)(已经表达内源性foxp3)中的表达会增强其调节功能。特别是，本发明人已经确定，在已经表达内源性foxp3的treg中增加foxp3的表达(例如通过引入外源性foxp3)，比在不表达内源性foxp3的常规t细胞中表达外源性foxp3所提供的调节功能，能增强treg的调节功能到更高的程度。此外，在已经表达内源性foxp3的treg中增加foxp3的表达，使得treg在给受试者服用后具有改善的功能谱的体内保留。例如，已经确定不表达外源性foxp3的天然tregs在给受试者用药后可能会失去它们的treg谱——例如不表达外源性foxp的天然tregs在给受试者用药后的一段时间后可能具有降低的foxp3表达水平，并能够产生促炎症、效应细胞因子。由本发明提供的tregs可以在给受试者用药后的一段时间后保留foxp3的表达，并具有降低的产生促炎症、效应细胞因子的能力。
[0273]
组合物
[0274]
本发明还提供包含本发明的工程化treg、载体或细胞的组合物。适当地，本发明提供包含根据本发明的工程化treg的组合物。适当地，本发明提供包含根据本发明载体的的组合物。适当地，本发明提供包含根据本发明的细胞的组合物。
[0275]
在一些实施方案中，组合物是药物组合物。这种药物组合物可以包含可药用载体、稀释剂、辅料或辅助剂。可以根据预期施用途径和标准药物实践选择药用载体，辅料或稀释剂的选项。作为载体、辅料或稀释剂(或除其之外)，药物组合物可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和其他载体剂。
[0276]
药物组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。肠胃外施用制剂包括但不限于如本文中讨论的混悬剂、溶液剂、油质或水质载体中的乳剂、糊剂和植入式持续释放或可生物降解制剂。可以使用肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂制备无菌注射制剂。根据本发明使用的药物组合物可以包含在所用剂量和浓度对受试者无毒的可药用分散剂、润湿剂、助悬剂、等渗剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、载体、辅料、盐或稳定剂。优选地，这种组合物还可以包含用于治疗疾病的可药用载体或辅料，所述可药用载体或辅料与给定的施用方法和/或部位(例如肠胃外(例如皮下、皮内或静脉内注射)或鞘内施用)相容。
[0277]
在药物组合物包含本发明细胞的情况下，可以使用现行药品生产管理规范(cgmp)产生组合物。适当地，包含细胞的药物组合物可以包含有机溶剂，如但不限于，乙酸甲酯、二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲氧基乙烷(dme)和二甲基乙酰胺，包括其混
合物或组合。
[0278]
适当地，包含细胞的药物组合物无内毒素。
[0279]
治疗方法
[0280]
本发明提供一种治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用本发明的工程化treg。
[0281]
本发明提供一种治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用本发明的药物组合物。
[0282]
本发明还提供本发明的工程化treg用于治疗和/或预防疾病。
[0283]
本发明还提供本发明的药物组合物用于治疗和/或预防疾病。
[0284]
本发明还涉及本发明的工程化treg、载体或细胞在制造治疗和/或预防疾病的药物中的用途。优选地，本发明的治疗方法涉及向受试者施用本发明的药物组合物。
[0285]
术语“治疗/处置/处理”涉及向患有现存疾病或病状的受试者施用如本文所述的工程化的treg、细胞，载体或药物组合物，旨在减轻、减少或改善至少一个与疾病相关的症状和/或减缓、减少或阻断疾病进展。
[0286]
如本文所用的提及“预防”/“防止”(或预防)，指延迟或防止疾病症状的初起。预防可以是绝对的(从而，无疾病发生)或可以仅在一些个体中有效或有限时间量有效。
[0287]
在本发明的一个优选实施方案中，本文所述的任何方法的受试者是哺乳动物、优选地猫、犬、马、驴、羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。优选地，受试者是人。
[0288]
可以使用使得有效成分生物可利用的多种途径中任一者，实现施用本发明的药物组合物。例如，可以将treg、细胞、载体或药物组合物静脉内、鞘内、通过口服和肠胃外途径、鼻内、腹腔内、皮下、透皮或肌内施用。
[0289]
在一个方面，静脉内施用本发明的工程化treg或本发明的药物组合物。
[0290]
在另一个方面，鞘内施用本发明的工程化treg或本发明的药物组合物。
[0291]
一般，医师将确定最合适于个体受试者的实际剂量，并且该计量将随具体患者的年龄、重量和反应变动。剂量是这样的，它从而足以减少和/或防止疾病症状。
[0292]
本领域技术人员将领会，例如，递送途径(例如，口服与静脉内与皮下等)可能影响给药量和/或要求的给药量可能影响递送途径。例如，在特定部位或位置内部特别高浓度的药剂有意义的情况下，聚焦递送可能是需要的和/或有用的。优化给定治疗方案的途径和/或给药方案时待考虑的其他因素可以包括，例如，正在接受治疗的疾病(例如，类型或分期等)、受试者的临床状况(例如，年龄、总体健康等)、存在或不存在联合疗法和医疗执业者已知的其他因素。剂量是这样的，它从而足以稳定或改善疾病的症状。
[0293]
本发明还提供一种治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用本发明的药物组合物，所述药物组合物包含细胞，例如本发明的t细胞。
[0294]
适当地，本发明还提供一种治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用本发明的工程化treg。
[0295]
该方法可以包括以下步骤：
[0296]
(i)从受试者分离含有细胞的样品；
[0297]
(ii)向细胞引入编码tcr的核酸序列和任选地，编码foxp3蛋白的核酸；并且
[0298]
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
[0299]
适当地，来自(ii)的细胞可以在施用至受试者之前体外扩增。
[0300]
该方法可以包括以下步骤：
[0301]
(i)向含有细胞的样品引入编码tcr的核酸序列和任选地，编码foxp3蛋白的核酸；
[0302]
并且
[0303]
(ii)向受试者施用来自(i)的细胞。
[0304]
疾病
[0305]
通过本发明的方法和用途待治疗和/或预防的疾病可以是诱导t细胞介导免疫应答的任何疾病。疾病可以例如是癌症、传染性疾病或自身免疫疾病。
[0306]
适当地，通过本发明的方法和用途待治疗和/或预防的疾病可以是自身免疫疾病。
[0307]
不希望受理论约束，通过本发明的方法和用途待治疗和/或预防的疾病可以是其中mbp是抗原例如其中mbp是自身抗原的任何疾病。
[0308]
适当地，疾病可以是自身免疫性疾病和炎性中枢神经系统疾病(例如慢性神经变性病)。
[0309]
适当地，疾病可以是慢性神经变性病如多发性硬化(ms)、阿尔茨海默病、帕金森病、嗜神经病毒性感染、卒中、副肿瘤性(paraneoplastic)病症和外伤性脑损伤。
[0310]
在一个方面，疾病是多发性硬化。
[0311]
适当地，疾病是慢性进展型多发性硬化。
[0312]
适当地，疾病是复发/缓解型多发性硬化。
[0313]
在一个方面，疾病可以具有全身性自身免疫性和炎性疾病(如病、类肉状瘤病(sarcoidosis)、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、硬皮病和综合征)的中枢神经系统(cns)累及。
[0314]
适当地，疾病存在于hla-drb1*1501或drb1*1503阳性受试者中。
[0315]
适当地，疾病是多发性硬化并且受试者为hla-drb1*1501或drb1*1503阳性。
[0316]
适当地，疾病是慢性进展型多发性硬化并且受试者为hla-drb1*1501或drb1*1503阳性。适当地，疾病是复发/缓解型多发性硬化并且受试者为hla-drb1*1501或drb1*1503阳性。适当地，受试者是hla-drb1*1501阳性受试者。
[0317]
多发性硬化
[0318]
多发性硬化(ms)是欧洲和美国青年当中最常见的神经系统疾病。ms特征在于脱髓鞘病并且是中枢神经系统慢性退行性疾病，其中髓鞘质逐步破坏呈片状遍及脑和/或脊髓发生，干扰神经连接性并造成肌肉虚弱、协调障碍和言语与视觉障碍。
[0319]
已经鉴定几种ms进展类型或样式，包括临床孤立综合征(cis)、复发缓解型ms(rrms)、原发进展型ms(ppms)和继发进展型ms(spms)。对于一些患者，失能增加或进展为非常逐步，并且对于其他患者，它可能更快地发生。然而，通常，从侵袭中恢复变得越来越不完整，并且症状倾向于增加且失能增长。
[0320]
尽管已经批准了几种降低临床复发频率的病情改善疗法(dmt)，但按照现行治疗方案，大部分患者继续在临床上加重。自体造血干细胞移植可能对患者具有持久有益效果，但该程序需要与巨大毒性相关的激进清髓预处理。dmt或干细胞移植均不能介导ms的免疫病理的抗原特异性抑制。不希望受理论约束，在未来，施用一个剂量的本发明的工程化treg可能提供对ms免疫病理学的持久抑制，无全身性副作用。这将显著影响ms罹患者中疾病的
进展。
[0321]
适当地，本发明的treg、载体或药物组合物可以减少或减轻一个或多个ms症状，所述症状包括视力减弱或减退、步态蹒跚和不均匀、言语不清、尿频和失禁、情绪变化和抑郁、肌痉挛和麻痹。
[0322]
方法
[0323]
本发明也提供一种产生工程化treg的方法，所述方法包括向体外或离体细胞引入编码如本文定义的tcr的多核苷酸。适当地，该方法还包括在允许本发明tcr分子表达的条件下孵育细胞。任选地，该方法还可以包括步骤：纯化工程化的treg细胞。
[0324]
适当地，细胞是t细胞。
[0325]
适当地，细胞是treg细胞。
[0326]
适当地，细胞是表达foxp3的天然treg。
[0327]
在一个方面，细胞是干细胞。适当地，在本发明的方法中，已经将编码如本文定义tcr的核酸引入干细胞并且干细胞随后分化成表达foxp3的t细胞如treg。
[0328]
适当地，干细胞具有分化成表达foxp3的t细胞如treg的能力。适当地，细胞可以是胚胎干细胞(esc)。适当地，细胞可以是从获得的脐带血。适当地，细胞可以是从成体外周血获得。适当地，细胞是造血干细胞和祖细胞(hspc)。适当地，细胞是诱导型多潜能干细胞(ipsc)。
[0329]
在另一个方面，细胞是祖细胞。适当地，祖细胞具有分化成表达foxp3的t细胞如treg的能力。
[0330]
在另一个方面，本发明提供一种产生工程化treg的方法，所述方法包括向体外或离体细胞引入编码如本文定义的tcr的多核苷酸和编码foxp3蛋白的多核苷酸。适当地，细胞可以是如本文定义的天然treg。适当地，编码如本文定义的tcr的多核苷酸和编码foxp3蛋白的多核苷酸作为各自独立的多核苷酸提供。适当地，将独立的多肽分别、依次或同时引入细胞中。在分别或依次引入多肽的情况下，适当地，首先引入编码tcr的多核苷酸。在分别或依次引入多肽的情况下，适当地，首先引入编码foxp3的多核苷酸。适当地，在相同的多核苷酸上提供编码如本文定义的tcr的多核苷酸和编码foxp3蛋白的多核苷酸。
[0331]
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括。
[0332]
(a)从细胞群中分离出天然treg；以及
[0333]
(b)增加天然treg中的foxp3表达。
[0334]
"从细胞群中分离treg"的表述意为从多种不同类型的细胞的异质混合物中分出treg。适当的细胞群是来自人类受试者的样本。
[0335]
适当地，treg被分离为treg的群体。
[0336]
适当地，treg群包含至少70％的treg，诸如75％、85％、90％或95％的treg。
[0337]
适当地，该方法还包括在引起foxp3和本发明tcr分子表达的条件下孵育细胞。任选地，该方法还可以包括步骤：纯化工程化的treg细胞。
[0338]
在一个方面，本发明提供一种产生工程化treg的方法，所述方法包括向体外或离体细胞引入编码如本文定义的tcr的多核苷酸和编码foxp3蛋白的多核苷酸并且使细胞分化成表达foxp3的t细胞，如treg。适当地，该方法还包括在引起foxp3和本发明tcr分子表达的条件下孵育细胞。任选地，该方法还可以包括步骤：纯化工程化的treg细胞。
[0339]
适当地，在一个方面，向细胞引入foxp3之前，使细胞分化成t细胞。
[0340]
可以通过本领域已知的任何方法实现对工程化treg的纯化。适当地，可以使用细胞群体正向和/或负向选择，使用荧光激活细胞分选(facs)或免疫磁性分离(即，使用与磁性纳米粒子或珠连接的抗体)，纯化工程化的treg。
[0341]
适当地，可以使用如本文定义的tcr的表达，纯化工程化的t细胞。
[0342]
本公开不受本文公开的示例性方法和材料限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可以用于实施或检验本公开的实施方案。数值范围包括界定该范围的数值。除非另外说明，否则任何核酸序列从左至右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至由以氨基至羧基方向书写，各自地。
[0343]
在提供一个值范围的情况下，应当理解除非上下文明确说明，否则还具体地披露了这个范围的上限与下限之间的每个中间值至该下限的十分之一单位。本公开范围内涵盖在所述范围内任一所述值或居间值与这个所述范围内任一其他所述值或居间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地纳入该范围内或排除在外，并且本公开范围内还涵盖其中两个限值中任一者纳入、二者均不纳入或二者均纳入较小范围情况下的每个范围，受所述范围中任何具体排除的限值约束。在所述的范围包含所述限值中一者或两者情况下，排除这些已纳入限值中任一者或两者的范围也纳入公开。
[0344]
必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。
[0345]
如本文所用的术语“包含”、“包括”和“包含了”同义于“含”、“内含”或“含有”、“包含有”，并且是包含性的或开放式的并且不排除附加、未列举的成员、要素或方法步骤。术语“包含”、“包括”和“包含了”还包括术语“由
……
组成”。
[0346]
应当指出，如本文所述的本发明实施方案可以组合。
[0347]
本文讨论的出版物仅因它们的公开先于本技术的提交日而提供。本文中这些出版物均不得解释为承认这类出版物相对于所附权利要求构成现有技术。
[0348]
本发明进一步的方面
[0349]
在以下编号的段落(paras)中提供了本发明的进一步的方面：
[0350]
1.工程化的treg，其包含t细胞受体(tcr)，其中tcr包含α链和aβ链，
[0351]
其中α链和β链各自包含如表1或表2中所示的或如这些序列的具有多达三个氨基酸变化的变体的tcr的三个互补决定区(cdr)。
[0352]
2.根据段落1所述的工程化treg，其中tcr包含如表1或表2中所示的或如与其具有至少80％序列同一性的变体的一种α链和一种β链的组合。
[0353]
3.根据段落1或2所述的工程化treg，其中tcr的α链和β链的恒定区结构域各自包含额外的半胱氨酸残基，从而使得在α链和β链之间形成额外二硫键成为可能。
[0354]
4.根据任一前述权利要求所述的工程化treg，其中treg衍生自从受试者分离的t细胞。
[0355]
5.药物组合物，包含根据任一前述段落所述的工程化treg。
[0356]
6.根据任一前述段落所述的工程化treg或药物组合物，用于治疗疾病。
[0357]
7.根据段落1至5中任一项所述的工程化treg或药物组合物在制备药物中的用途。
[0358]
8.在有需要的受试者中治疗或预防疾病的方法，所述方法包括步骤：向受试者施
用根据段落1至5中任一项所述的工程化treg或药物组合物。
[0359]
9.根据段落6至8中任一项所述的工程化treg或药物组合物用法、用途或方法，其中疾病是多发性硬化。
[0360]
10.根据段落6至9中任一项所述的工程化treg或药物组合物用法、用途或方法，其中受试者为hladrb1*1501或hladrb1*0401阳性受试者。
[0361]
11.载体，其包含了编码如段落1至5中任一项所限定的tcr的核酸序列和编码foxp3的核酸序列。
[0362]
12.多核苷酸或载体套件，所述套件包含第一多核苷酸或载体和第二多核苷酸或载体，所述第一多核苷酸或载体包含了编码如段落1至5中任一项所限定的tcr的核酸序列，所述第二多核苷酸或载体包含了编码foxp3的核酸序列。
[0363]
13.产生根据段落1至5中任一项的工程化treg的方法，所述方法包括步骤：向体外或离体细胞引入编码根据段落1至5中任一项所限定的tcr的多核苷酸。
[0364]
14.根据段落13所述的方法，其中该方法还包括步骤：向体外或离体细胞引入编码foxp3蛋白的多核苷酸。
[0365]
15.根据段落13或14所述的方法，其中细胞是t细胞。
[0366]
16.根据段落15所述的方法，其中t细胞是表达foxp3的天然treg。
[0367]
17.根据段落16所述的方法，其中t细胞是常规t细胞。
[0368]
18.根据段落13至17所述的方法，其中依次、分别或同时进行引入编码tcr的多核苷酸和编码foxp3的多核苷酸的步骤。
[0369]
19.根据段落18所述的方法，其中使用根据段落11的载体，向细胞引入编码tcr的多核苷酸和编码foxp3的多核苷酸。
[0370]
表1
–
mbp81-99/dr15 tcrs
[0371]
[0372][0373]
表2
–
mbp111-129/dr4
[0374]
[0375][0376]
现在将通过实施例进一步描述本发明，所述实施例意在起到辅助本领域普通技术人员实施本发明的作用并且不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0377]
实施例1
–
表达和功能研究
[0378]
ob-1a12 tcr被克隆到逆转录病毒pmp71载体中，使用的配置为α链-p2a-β链-t2a-截短的小鼠cd19(tmcd19)(图1a)。
[0379]
ob-1a12 tcr在jurkat细胞(图1b)和cd4 人t细胞(图1c)中高效表达。
[0380]
用ob-1a12转导并用加载了饱和浓度的相关肽的apc刺激的的人cd4 t细胞，能够
产生抗原特异性细胞因子反应(图1d)。
[0381]
ob-1a12与产生细胞因子的cd4 人t细胞的百分比增加有关，特别是在低抗原浓度下(图1e)。
[0382]
用参考mbp tcr转导的
·
tregs的抗原特异性抑制
[0383]
将cd80 cd86 dr4 cho细胞载以肽并且照射，之后以0.1x106个细胞/ml重悬。将转导的反应者t细胞用加温的pbs中的cfse细胞追踪染料在37度染色3分钟，之后前添加等体积的温暖fbs并且孵育另外3分钟。
[0384]
将细胞在5x体积完全培养基中洗涤，之后计数并以1x106个转导细胞/ml重悬。通过流式细胞术测tconv和treg的转导效率。将调节性t细胞从培养物移除、洗涤并以1x106个转导的细胞/ml重悬于完全rpmi中。将细胞按1个treg细胞:0.1个cho细胞及不同比率的tconv铺板。通过分析羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)染色的t conv，测定增殖。
[0385]
图4中的数据显示tcr转导的treg以抗原特异性方式抑制增殖。从培养基收集上清液并通过elisa对其分析il-2。图5中呈现的数据显示tcr转导的treg以抗原特异性方式抑制il-2产生。
[0386]
本参考实验中使用的表达盒以5'-3'方向编码foxp3和参考mbp tcr。
[0387]
实施例2a
–
表达外源性foxp3的移植、持续存在和保留foxp3、cd25和tcr表达
[0388]
通过珠分选法从hla-drb*0401转基因小鼠的淋巴结和脾细胞分离thy1.1 cd4 cd25 或cd45.1 cd4

cd25

treg。用tcr转导cd45.1 treg，并用tcr 鼠foxp3转导thy1.1 treg。转导后1天，将tcr或tcr foxp3转导的细胞以1:1的比例注入用4gy辐照预备的hla-drb*0401转基因宿主。facs图显示了注射细胞的cd45.1:thy1.1的比例和它们各自的foxp3表达。
[0389]
7周后用流式细胞术通过tcr染色来识别移植的细胞。确定tcr 群体内cd45.1:thy1.1的比例，并通过foxp3和cd25染色检查移植的cd45.1(用tcr转导的treg)或thy1.1(用tcr foxp3转导的treg)细胞的表型。
[0390]
thy1.1 cd4 cd25 treg是通过珠分选法从hla-drb*0401转基因小鼠的淋巴结和脾细胞分离出的。用tcr、tcr 鼠foxp3转导treg或用无病毒上清(mock)培养treg。转导后1天，将tcr或tcr foxp3转导的细胞以1:1的比例注入用4gy辐照预备的hla-drb*0401转基因宿主。7周后用流式细胞术确定转导的treg的移植情况。图5，a显示转导后第1天通过人的可变2.1和鼠foxp3的表达来确定转导效率。图5，b显示了来自接受了tcr或tcr foxp3转导的treg的小鼠的脾细胞，用thy1.1染色以识别转导的细胞(顶部栏)和foxp3和tcr(底部栏)。图5，c显示累积数据，显示转导效率的倍数变化(左图)和转导细胞绝对数量的倍数变化(右图)，相对于用tcr或tcr foxp3转导的treg的注射之日。图5，d显示转导7周后转导细胞内foxp3的代表性表达。图中显示了第7周时转导群体中foxp3 细胞的百分比累积(左)，以及foxp3 细胞相对于注射当天的倍数变化。
[0391]
实施例2b
‑‑
表达外源性foxp3的treg在体内7周后保持treg功能，而不表达外源性foxp3的tregs获得产生效应细胞因子的能力将脾细胞与用无关肽或10um mbp脉冲的cd86 hla-dr4 cho细胞培养4小时。表达外源性foxp3的treg在体内7周后保持treg功能，正如所表现出的缺乏效应细胞因子的产生，而不表达外源性foxp3的tregs获得了产生效应细胞因子的能力(图6)。
[0392]
实施例3
‑‑
进一步的tcr的表达和功能研究
[0393]
使用实施例1所述的方法对下列tcr进行表达和功能研究。ob-2f3(图7)，ob-3d1(图8)，hy-1a8(图9)，hy-2e11(图10)，hd1-14(图11)，ms3-1(图12)，ms3-11(图13)，ms1-4h12(图14)和hd4-1c2(图15)。
[0394]
方法
[0395]
逆转录病毒转导
[0396]
使用fugene hd试剂(promega)用逆转录病毒载体(如图2所示)转染phoenix ampho细胞。从转染的phoenix ampho细胞收集含有逆转录病毒的上清液，用于转染jurkat细胞或原代cd4细胞。简言之，将细胞与逆转录病毒上清液混合，并转移到用retronectin(takara bioscence)包被的组织培养板中。通过旋染法(spinfection)(2000rpm离心90分钟)进行转导，之后在需要时用含有细胞因子的新鲜培养基替换逆转录病毒上清液。
[0397]
tcr的表达验证
[0398]
转导后3天用流式细胞仪测量tcr的表达。通过截短的鼠cd19分子的表达来识别转导的细胞。对于jurkat细胞，cd3的表达被用作tcr表达的代理，因为该细胞不产生功能性tcr，因此在其原始状态下没有cd3的表达。使用抗cd4磁珠(miltenyi biotech)从健康捐赠者的冷冻白细胞中分离出cd4 t细胞，在转导前用cd3/cd28 dynabeads(life technologies)和il-2(roche)活化48小时。当适用时，使用抗vβ20抗体在cd4 t细胞中测量tcr表达。
[0399]
细胞因子产生测定
[0400]
对于抗原特异性细胞因子的产生，表达相关hla-dr分子的中国仓鼠卵巢(cho)细胞与共刺激分子cd80或cd86一起被用作抗原呈递细胞(apc)。肽被添加到cho-cd80:cho-cd86的1:1混合物中，并孵育2小时以使抗原在mhc分子上呈递。在进行细胞内细胞因子染色之前，将转导的cd4细胞和加载抗原的apcs结合起来，用brefeldin a(bfa)孵育18小时。抗原特异性反应是通过产生白细胞介素-2和干扰素-gamma的细胞增加，在对照组(由不相关肽刺激的细胞)之上来检测。
[0401]
以上说明书中提到的全部出版物均通过引用的方式并入本文。本发明所述方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将显而易见，而不脱离本发明的范围和精神。虽然已经联系具体的优选实施方案描述本发明，应当理解如要求的本发明不应不当地受限于此类具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的多种修改，对于分子生物学、细胞免疫学或相关领域的技术人员显而易见，意在属于所附权利要求的范围内。