烟草NtMYB1基因及其编码蛋白与应用

烟草ntmyb1基因及其编码蛋白与应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学与基因工程相关技术领域，具体为涉及烟草ntmyb1基因及其编码蛋白与应用。


背景技术：

2.烟草属一年生或有限多年生草本植物，是我国主要的经济作物之一，在我国国民经济发展中占有十分重要的位置。但与其他发达国家相比，我国烟叶在品质质量等方面还存在较大差距。同时，作为重要的模式植物，许多植物分子生物学研究和基因工程试验都以烟草为对象进行基因的生物学功能验证，但是对烟草自身功能基因的挖掘、鉴定和利用的研究相对匮乏。
3.多酚类化合物是一种广泛存在于植物体内的天然次级代谢产物，在植物器官着色、花粉萌发、根系发育、抗紫外辐射、防御病原菌攻击、提高营养元素的吸收效率以及逆境防御等方面发挥着重要的生物学功能。同时作为一种保健型天然化合物，多酚类物质具有广泛的药理作用，在抗氧化、抗癌、抗炎、防止骨质疏松、保护心血管以及改善记忆等方面具有多种药用功效。
4.uv-b是太阳光中波长320-280nm的一种强效电磁辐射，对植物的生长发育有着显著影响。当前大气臭氧层破坏，导致全球紫外辐射增强，特别是uv-b辐射，引起全世界的广泛关注。高强度的uv-b辐射能够穿透细胞表面，直接损伤植物体内大分子蛋白质和dna，影响植物光合系统、抗氧化系统、初生和次生物质代谢水平，从而降低主茎和分支延伸的生长速率，抑制种子萌发，使植物的生物量减少，角质层增厚，影响植物的正常发育。在高等植物中抗uv-b辐射最有效的防御机制之一是多种酚类化合物的积累。多酚类化合物能够吸收uv-b辐射，有效屏蔽和过滤紫外辐射在表皮层的辐射通量，从而使植物免受紫外辐射的伤害。提高多酚类化合物的积累对植物抵御紫外辐射，保障农作物产量、品质和营养价值具有重要意义。
5.烟草次生代谢产物丰富多样。芸香苷、绿原酸、咖啡酸等是烟草中重要的多酚类化合物，其含量占烟草多元酚酸类物质的80％以上。在烟叶生产过程中，uv-b辐射、cmv等生物和非生物胁迫会致使烟草生长发育受阻，烟叶减产，品质下降，可用性低。而多酚类物质作为烟叶组织中一种重要的抗氧化物质，可在一定程度上减轻或消除逆境胁迫所引起的活性氧伤害，增加烟草抗逆性。。
6.在植物体内的众多转录因子家族中,myb(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子家族是数量最庞大的转录因子家族之一,且功能最为多样化。myb类转录因子在植物体内具有广泛的生物学功能，从表1可以看出myb转录因子有着广泛的生理功能,几乎参与植物发育和代谢的各个方面。不同的myb转录因子具备不同的功能，有的参与对植物激素的应答，有的控制植物细胞的形态和模式建成，有的参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节。虽然现有技术中已经公开了大量的myb类转录因子的生物功能，对于一个未知功能的myb类转录因子究竟具备何种功能尚无法预料。
7.表1植物m yb类转录因子及其生物学功能(根据jin和martin 1999修改)
8.

技术实现要素：

9.本发明的目的是提供烟草ntmyb1基因与应用。
10.本发明的一个目的是提供一种烟草转录因子ntmyb1基因及其编码序列
11.烟草ntmyb1基因，其cds序列如seq id no.1所示。
12.所述的烟草ntmyb1基因优选具有seq id no.2所示的内含子。
13.烟草ntmyb1基因编码的蛋白，氨基酸序列如seq id no.3所示。
14.本发明所述的烟草ntmyb1基因在调节烟草内源性多酚类物质的含量、调控烟草抗逆性中的应用；优选在提高烟草内源性芸香苷(芦丁)、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸以及山奈酚-3-o-芸香苷的含量、提高烟草抗逆性中的应用；进一步优选在提高烟草对aba、uv-b胁迫和/或cmv胁迫抗性中的应用。本发明利用基因编辑方法抑制或失活烟草中内源的ntmyb1基因编码的蛋白，获得三种纯合的ntmyb1基因编辑材料后，所述的基因编辑材料具有如下1)2)3)4)应用：
15.1)调节烟草内源性芸香苷(芦丁)、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸以及山奈酚-3-o-芸香苷的含量；
16.2)参与aba胁迫处理下烟草种子的萌发及生长发育；
17.3)参与uv-b胁迫下的烟草生长发育；
18.4)参与cmv胁迫下的烟草生长发育；
19.所述参与调节烟草内源性多酚类物质含量为降低了多酚类化合物芸香苷(芦丁)、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸以及山奈酚-3-o-芸香苷等物质的含量；
20.所述参与aba胁迫为不同浓度的aba处理后，突变体材料的发芽率均显著降低，并将正常生长的幼苗转移至1μm aba处理后发现突变体材料的主根长显著短于wt；
21.所述参与uv-b胁迫为311nm波长的紫外光处理后，突变体失水较wt快，叶片显著失绿，mda、光合指标、叶绿体荧光参数以及相关基因的表达水平突变体材料均显著低于wt，而
sod、pod、cat等酶的活性则相反。
22.所述参与cmv胁迫为cmv摩擦接种后，突变体植株发病较为严重，病情指数较高，与cmv抗性相关基因的表达水平显著降低，突变体表现较为敏感。
23.本发明的实验证明，通过抑制或失活ntmyb1基因在烟草中表达的蛋白水平，可以降低烟草内源芸香苷(芦丁)、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸以及山奈酚-3-o-芸香苷等物质的含量，并对aba、uv-b、cmv等胁迫变得较为敏感。因此，本发明发现了简单有效的调节植物多酚类物质含量、响应aba、uv-b、cmv等胁迫的关键基因ntmyb1，该基因可应用于高多酚类物质、抗uv-b以及抵御病原菌cmv浸染植物材料的高效培育，同时也为培育类黄酮含量差异的烟草基因工程品系提供了一种新的方法。在食品科学、医药以及分子植物育种领域都有着非常重要的价值与意义。
附图说明
24.图1显示烟草ntmyb1基因pcr扩增检测的电泳结果，结果表明所获基因片段大小约为750bp左右，与目标基因片段大小相近。
25.注：m：dl2000 dna marker；1：无cdna扩增；2：含烟草幼苗cdna扩增
26.图2显示ntmyb1突变体myb1-27、myb1-38、myb1-21突变碱基位点。
27.图3显示ntmyb1突变体myb1-27、myb1-38、myb1-21碱基突变后编码蛋白的氨基酸序列比对。
28.图4显示利用hplc测定野生型和突变体材料在烟叶中多酚类物质含量的结果，其中myb1-27、myb1-38、myb1-21为三个突变体材料，wt为野生型烟草。
29.图5显示0μm、0.5μm、1μm、2μm aba分别处理myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt后种子发芽表型。
30.图6显示myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt在不同浓度aba处理下的发芽率统计。
31.图7显示1μm aba处理正常生长一周龄myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt幼苗一周后表型及主根长测定。
32.图8显示1μm aba处理正常1/2ms生长至一周龄的myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt幼苗14d后主根长统计
33.图9显示311nm波长的uv-b处理正常1/2ms生长至一周龄的myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt 12h后表型。
34.图10显示uv-b处理正常1/2ms生长至一周龄的myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt 6h后与抗紫外辐射相关基因ntcop1和ntuvr8的表达量。
35.图11显示uv-b处理正常生长至4周龄烟草幼苗12h后myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt烟株水分含量，sod、pod等酶活性，cat、mda等抗氧化物质含量。
36.图12显示uv-b处理正常生长至4周龄的烟草幼苗12h后测定叶绿体荧光参数测定。
37.图13显示uv-b处理正常生长至6周龄的烟草幼苗24h后myb1-27、myb1-38、myb1-21以及wt材料烟叶光合参数。
38.图14显示cmv处理后表型以及cmv抗性相关基因的表达水平。
具体实施方式
39.下面结合实施例和数据进一步阐述本发明。
40.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特殊说明，均为现有技术中已有的常规仪器，试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下例实施例中所涉及的技术、实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规技术、实验方法，检测方法等。
41.实施例1烟草幼苗培养及ntmyb1基因扩增
42.野生型wt烟草种子用75％酒精消毒30s，然后用15％h2o2溶液浸泡消毒10min，蒸馏水清洗3次，播种于1/2ms(murashigeandskoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长，培养条件为(25
±
1)℃，光照16h/d。
43.待烟苗长至“两叶一心”时，用灭过菌的剪刀剪取烟草叶片约0.1g，液氮迅速研磨后，利用sls法提取烟草基因组dna，利用上游引物ntmyb1-f：acgcgtcgacatgggaaggtcaccatgttg,下游引物ntmyb1-r：aactgcagtcacttagtttccaaggttct扩增获得基因组全长1190bp的pcr产物，序列分析发现ntmyb1基因包含两个外显子和一个内含子，外显子拼接得到全长为783bp的cds序列，如seq id no.1所示，内含子片段大小为407bp，序列如seq id no.2所示。
44.同样将上述烟草幼苗用于rna提取：所用实验药品均购自广州睿博生物科技有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1％depc水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约0.1g左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml trizol提取液混匀，静置10min；4℃下12,000r/min离心10min；取上清加300μl氯仿混匀，静置5min后4℃下12,000r/min离心15min，样品分为3层，rna位于上层水相中；取500μl水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀10～20min；12,000r/min离心10min，弃上清；用75％酒精洗涤1～2次，7,000r/min离心2min，晾干3min左右，加60μl无rnase水，轻轻震荡使rna溶解，参照vazyme提供的primescript rt-pcr kit(takara,dalian,china)说明书进行反转录，产物用上述引物进行pcr扩增后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现其条带大小与目标产物大小相一致(图1)，测序结果与seq id no.1所示的结果一致。
45.实施例2烟草ntmyb1纯合突变体的获得以及类黄酮含量的测定
46.三种ntmyb1插入或缺失突变体材料的获得利用crispr/cas9技术常规操作进行完成，突变位点如图2所示，突变后ntmyb1基因编码的氨基酸与ntmyb1正常编码的氨基酸截然不同(图3)。该结果可导致烟草ntmyb1基因编码蛋白的活性缺失或抑制。
47.利用sls法提取突变体烟草基因组dna，用myb1-f：aagggcaggctttgattc和myb1-r：taccgaggaggctatgga进行高保真pcr扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳检测并委托睿博生物科技有限公司进行测序，筛选并鉴定获得三种纯合突变体材料。
48.将上述鉴定获得的myb1-27、myb1-38、myb1-21三种突变体材料以及wt种子经0.1％agno3处理10min，清水冲洗并晾干，然后按照托盘育苗法育苗并进行假植，挑取长势一致的6周龄烟草幼苗，用液氮速冻并冷冻干燥后研磨至粉末状，准确称量0.05g，置于15ml离心管中，准确加入10ml 50％甲醇(甲醇：水)，用超声震荡器超声提取20min。取约2ml萃取液经0.22μm微孔滤膜过滤至样品瓶，取20μl滤液用于hplc分析，hplc色谱条件及参数：色谱柱：c18柱(agilent poroshell 120ec-c18柱，250mm
×
4.6mm，孔径4μm；)；流动相:100％甲醇:0.2％甲酸＝55:45，流动相经0.45μm滤膜过滤，并经超声波脱气；流速:0.5ml/min，进样
量20μl，柱温40℃，；检测波长:360nm，具体操作【参照高效液相色谱法测定烟草中多酚类物质[j].西南农业学报,2013,26(02):531-534.】方法进行。
[0049]
结果如图4所示。可知myb1-27、myb1-38、myb1-21三个突变体材料中的咖啡酸、芦丁和山奈酚-3-o芸香苷含量均显著低于wt，此结果说明烟草中ntmyb1基因编码的蛋白缺失导致烟草中多酚类物质含量的降低，该基因参与调控了烟草莽草酸和类黄酮代谢途径中咖啡酸和芦丁等物质的合成，由此可见，该基因在培育高多酚类物质植物材料中具有重要用途。
[0050]
实施例3不同突变体和wt材料在aba胁迫下的种子萌发以及主根长的变化
[0051]
在含有0μm、0.5μm、1μm、2μm aba的1/2ms培养基上生长14d后，观察表型及统计发芽率，如图5-图6所示。myb1-27、myb1-38、myb1-21在0μm aba处理的条件下发芽率没有明显差异，但在0.5μm、1μm和2μm aba处理下，突变体材料的发芽率均显著低于wt，说明ntmyb1基因的缺失导致烟草对aba胁迫后的种子萌发率降低，为了进一步研究ntmyb1基因对aba胁迫的响应，本发明将正常1/2ms生长至1周龄的烟草幼苗移至含有1μm aba浓度的1/2ms培养基中生长2周后，观察表型及测定主根长，如图7-图8所示，突变体材料的主根长显著低于wt，因此说明烟草ntmyb1基因具有增强对aba胁迫的耐受性的功能。
[0052]
实施例4不同突变体和wt材料在uv-b处理后表型、生理指标以及相关基因表达量的变化
[0053]
按照上述实施例2方法育苗获得的4周龄的突变体与野生型材料在311nm波长的uv-b处理12h后，观察表型，如图9所示，处理后wt及突变体植株均有萎蔫变白的症状，其中突变体尤为明显。测定与紫外响应相关基因的表达水平，如图10所示，wt较突变体材料，ntcop1和ntuvr8基因的表达水平显著升高，但nthy5并不敏感。另外对相关抗氧化酶pod、sod和cat的活性测定时发现，uv-b处理后pod、sod和cat的酶活性均有升高，就处理组而言，上述三种酶的活性，wt均显著低于突变体材料，而mda的含量却相反，如图11所示。之后又利用叶绿体荧光检测仪利用fluorcam7所述的方法对叶绿体荧光参数进行了测定，如图12所示，突变体的各项叶绿体荧光参数均显著低于wt，由此可见，紫外处理影响烟草叶片正常的光合作用，其中突变体较敏感。针对上述结论，本发明利用li6400光合仪测定了土培至6周龄并长势一致、同一部位的烟叶进行了光合参数测定，具体操作参照【田间栽培条件下4个冬瓜杨品系光合作用生理指标研究[j].现代农业科技,2020(19):141-143 155.】进行，如图12所示，突变体材料的光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及胞间co2浓度均显著低于wt，争对上述测得各项生理指标、相关基因表达量等，本发明得出紫外处理影响了烟草的正常生长发育，而突变体则更为敏感，这一现象及其机理之前未见报道。因此，该ntmyb1基因可用作抗紫外植物分子育种的重要基因进行应用。
[0054]
上述所涉及的基因表达量测定采用ex taq
tm
(perfect real time)(takapa公司)的试剂盒以及操作说明书进行，每个样品重复三次，pod、sod和cat酶活性参照北京方程佰金科技有限公司提供的试剂盒说明书进行并略有更改，mda含量的测定参照植物丙二醛(mda)检测试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)进行测定。
[0055]
上述所涉及的荧光定量引物如表1所示
[0056][0057]
实施例5
[0058]
用上述实施例2育苗法获得的wt以及myb1-27、myb1-38、myb1-21三个突变体4～5片真叶的幼苗，每个材料3盘，每盘15株。取经过复壮的携带cmv病毒的枯斑三生烟叶于研钵中，加少许石英砂和磷酸缓冲液(39％nah2po4
·
2h2o 61％na2hpo4
·
12h2o)，研磨充分。双层纱布过滤，然后按终体积比为1：5加入磷酸缓冲液定容。待上述烟苗长至，在叶面均匀撒上400～500目的石英砂，用脱脂棉求蘸取病毒水溶液轻轻摩擦1～2遍，然后立即用清水冲洗叶面。在第一次接种3d后进行第二次摩擦接种，每次摩擦力度保持一致。在第二次接种后第14d进行表型观察。如图14所示，突变体材料较wt发病更为严重，病情指数较高。在测定与cmv相关基因表达量时发现，接病14d后突变体材料中，ntcp、nt1a/2a和nt2b基因的表达均显著受到抑制。因此本发明证明ntmyb1基因在植物免受病原菌cmv攻击中扮演着十分重要的角色。可见该基因在植物抗cmv材料分子育种中具有举足轻重的地位。
[0059]
实施例5所用荧光定量引物如表2所示
[0060][0061]