用于表达重组治疗性肽的N-末端延伸序列的制作方法

用于表达重组治疗性肽的n-末端延伸序列
技术领域
1.本发明涉及用于高水平表达重组治疗性肽的n-末端延伸序列。本发明还涉及使用所述n-末端延伸序列高水平表达重组治疗性肽的方法。


背景技术：

2.自20世纪20年代胰岛素疗法问世以来，肽疗法在医学实践中发挥了显著作用。目前，市场上有60多种经批准的肽类药物，并且预计数量将显著增长。
3.胰高血糖素样肽-1(glp-1)是一种长度为31个氨基酸的肽激素，其来源于胰高血糖素原样肽的组织特异性翻译后处理。它由肠道内分泌的l细胞和脑干孤束核内的某些神经元在进食时产生和分泌。利拉鲁肽(liraglutide)是人肠促胰岛素(代谢激素)的衍生物，胰高血糖素样肽-1(glp-1)用作长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂，与刺激胰岛素分泌的内源性代谢激素glp-1结合同一受体。
4.特立帕肽(teriparatide)是甲状旁腺激素的重组蛋白形式，由其甲状旁腺激素的初始(n-末端)34个氨基酸组成，是甲状旁腺激素的生物活性部分。它是一种用于治疗某些形式的骨质疏松症有效合成代谢(促进骨形成)剂。
5.一种表达质粒被设计成含有作为增强子和启动子区域的调控序列，并导致表达载体上携带的基因的有效转录。精心设计表达载体的目标是高效生产蛋白质，并且这可通过合成大量稳定的信使rna来实现。
6.可以设计对表达施加严格控制的表达载体，并且只有在必要时通过使用合适的表达条件才能大量产生蛋白质。在缺乏对基因表达的严格控制的情况下，该蛋白质也可以组成型表达。
7.美国专利第4,916,212号公开了编码生物合成胰岛素前体的dna序列以及在酵母细胞中制备胰岛素前体和人胰岛素的方法。
8.美国专利第7,572,884号公开了一种在酿酒酵母中制备利拉鲁肽的前体，重组利拉肽(lirapeptide)的方法。
9.in 201741024763a公开了一种通过表达编码利拉肽的合成寡核苷酸制备利拉鲁肽的方法，该合成寡核苷酸可操作地连接至酵母细胞中信号肽的寡核苷酸序列。
10.wo 1998/008871a1公开了利用重组dna技术制备的glp-1衍生物及其类似物。
11.wo 1998/008872a1公开了利用重组dna技术制备的glp-2衍生物。
12.wo 1999/043708a1公开了利用重组dna技术制备的肠促胰岛素类似物(exendin)和glp-1(7-c)的衍生物。
13.wo 2017/021819a1公开了一种通过在原核细胞中表达编码所需蛋白质或肽的合成寡核苷酸作为泛素融合构建体来制备肽或蛋白质或其衍生物的方法。
14.avicenna j med biotech 2017；9(1)：19-22公开了在大肠埃希杆菌(escherichia coli)中过表达特里帕肽(1-34)，其是人甲状旁腺激素(pth)的重组生物活性部分。
15.本发明的发明人在努力将重组治疗性肽的表达提高数倍的过程中，提出了一种短n-末端延伸序列的使用方法，该序列在上述现有技术中未公开。
16.发明目的
17.本发明的目的是提供治疗性肽的数倍高水平表达。


技术实现要素：

18.本发明提供了n-末端延伸序列、核酸、载体和重组宿主细胞，用于高效生产生物活性肽，比如利拉肽。
19.本发明考虑了一种多维方法，通过提供一种表达构建体在宿主细胞中获得高产量的肽，比如利拉肽，其中在该表达构建体中，编码利拉肽的核酸可操作地融合至编码tev(tobacco etch virus，烟草蚀刻病毒)切割位点和n-末端延伸序列(ne-3)的修饰的基因序列。
20.本发明提供了如seq id no:1中示出的n-末端延伸序列(ne-3)，以增强治疗性肽在细菌或酵母中的表达。
21.本发明还提供了用于高水平表达利拉肽的表达载体和重组宿主细胞，其中该表达载体包括编码n-末端延伸序列ne-3的修饰的基因序列、编码tev(tobacco etch virus，烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列和编码利拉肽的修饰的基因序列。
附图说明
22.图1a：没有n-末端延伸序列的表达盒的示意图。
23.图1b：具有n-末端延伸序列(ne1)的表达盒的示意图。
24.图1c：具有n-末端延伸序列(ne3)的表达盒的示意图。
25.图2a：没有n-末端延伸序列的表达质粒。
26.图2b：具有n-末端延伸序列-1(ne1)的表达质粒。
27.图2c：具有n-末端延伸序列-3(ne3)的表达质粒。
28.图3：通过elisa的利拉肽表达。
29.图4：利拉肽的细胞干重。
30.序列表的描述
31.seq id no:1(n-末端延伸序列ne-3的氨基酸序列)
32.eeqae
33.seq id no:2(修饰的tev切割位点的氨基酸序列)
34.enlyfq
35.seq id no:3(利拉肽的氨基酸序列)
36.haegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg
37.seq id no:4(毕赤酵母(pichia pastoris)的编码n-末端延伸ne-3序列的核酸序列)
38.gaagaacaagccgaa
39.seq id no:5(毕赤酵母的编码修饰的tev切割位点的核酸序列)
40.gagaacttgtacttccaa
41.seq id no:6(毕赤酵母的编码利拉肽的核酸序列)
42.cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
43.seq id no:7(谷氨酸棒杆菌的编码n-末端延伸ne-3序列的核酸序列)
44.gaagaacaggcagaa
45.seq id no:8(谷氨酸棒杆菌的编码修饰的tev切割位点的核酸序列)
46.gaaaacctgtacttccag
47.seq id no:9(谷氨酸棒杆菌的编码利拉肽的核酸序列)
48.cacgcagaaggcacctttacctccgatgtgtcctcctacctggaaggccaggcagcaaaagaattcattgcatggctggttcgcggtcgcggttag
49.seq id no:10(大肠埃希杆菌的编码n-末端延伸ne-3序列的核酸序列)
50.gaagaacaggcagaa
51.seq id no:11(大肠埃希杆菌的编码修饰的tev切割位点的核酸序列)
52.gaaaacctgtacttccag
53.seq id no:12(大肠埃希杆菌的编码利拉肽的核酸序列)
54.catgcggaaggcaccttcaccagcgatgttagcagctacctggagggtcaggcggcgaaggaatttatcgcgtggctggttcgtggccgtggttaa
55.seq id no:13(枯草芽孢杆菌的编码n-末端延伸ne-3序列的核酸序列)
56.gaagaacaagccgaa
57.seq id no:14(枯草芽孢杆菌的编码修饰的tev切割位点的核酸序列)
58.gagaacttgtacttccaa
59.seq id no:15(枯草芽孢杆菌的编码利拉肽的核酸序列)
60.cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
61.seq id no:16(特立帕肽的氨基酸序列)
62.svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnf
63.seq id no:17(n-末端延伸序列ne-1的氨基酸序列)
64.eea
65.seq id no:18(编码n-末端延伸ne-1序列的核酸序列)
66.gaggaagcg
67.seq id no:19(包括可操作地融合至n-末端延伸序列ne-3和tev切割位点的利拉肽的融合蛋白)
68.eeqaeenlyfqhaegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg
69.seq id no:20(包括可操作地融合至n-末端延伸序列ne-1和tev切割位点的利拉肽的融合蛋白)
70.eeaenlyfqhaegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg
71.定义
72.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与该方法所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述类似或等效的任何载体、宿主细胞、方
法和组合物也可用于该载体、宿主细胞、方法和组合物的实践或测试，但是现在仅描述代表性示例。
73.在提供数值范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限与该范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个中间值均包括在所述方法和组合中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在方法和组合的范围内，以所述范围内任何具体排除的界限为准。如果所述范围包括一个或两个界限，则不包括其中一个或两个限值的范围也包括在所述方法和组合中。
74.应理解，为清楚起见，在单个实施例的上下文中描述的方法的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的方法和组合物的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。应当注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”包括复数提及物。需要进一步指出的是，撰写的权利要求可不包括任何可选要素。因此，本声明旨在作为在叙述权利要求要素或使用“负面”限制时使用“单独”、“仅”等排他性术语的在先基础。
75.本领域技术人员在阅读本发明后将显而易见地发现，本文中描述和图示的每个单独实施例具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与任何其他实施例的特征分离或组合，而不偏离本方法的范围或精神。任何所列举的方法都可以按照列举的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
76.术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或曾经是表达构建体的对象的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。用于本发明目的的宿主细胞是指能够适当用于本发明目的的毕赤酵母(pichia pastoris)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠埃希杆菌(escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的任何菌株。
77.术语“重组菌株”或“重组宿主细胞”指已用本发明的表达构建体或载体转染或转化的宿主细胞。
78.术语“表达载体”或“表达构建体”是指设计用于在转化到宿主后能够表达插入的核酸序列的任何载体、质粒或载体。
79.术语“启动子”是指定义基因转录起始点的dna序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5’端。rna聚合酶和必要的转录因子与启动子序列结合并启动转录。启动子可以是组成型或诱导型启动子。组成型启动子是一种允许相关基因持续转录的启动子，因为它们的表达通常不受环境和发育因素的制约。组成型启动子是基因工程中非常有用的工具，因为组成型启动子在无诱导剂的条件下驱动基因表达，通常比常用的诱导型启动子表现出更好的特性。诱导型启动子是由生物或非生物以及化学或物理因素的存在或不存在所诱导的启动子。诱导型启动子是基因工程中的一种非常强大的工具，因为在生物体或特定组织或细胞的发育或生长的特定阶段，可以开启或关闭与它们相关的基因的表达。
80.术语“表达”是指由编码序列编码的产物的生物学制造。在大多数情况下，包括编码序列在内的dna序列被转录形成信使rna(mrna)。信使rna随后被翻译成具有相关生物活性的多肽产物。此外，表达过程可能涉及转录rna产物的进一步处理步骤，例如剪接以去除内含子，和/或多肽产物的翻译后处理。
81.本文中使用的术语“修饰的核酸”是指编码由seq id no:19或seq id no:20表示的修饰利拉肽的核酸或其功能等效变体。功能性变体包括与seq id no:19或seq id no:20具有实质性或显著序列同一性或相似性且保留蛋白质生物活性的任何核酸。
82.术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然氨基酸聚合物、含有修饰残基的聚合物和非天然氨基酸聚合物。“多肽”是指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和长链(通常称为蛋白质)。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。同样，“蛋白质”是指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然氨基酸和肽键或合成的拟肽结构组成。因此，本文使用的“氨基酸”或“肽残基”是指天然氨基酸和合成氨基酸。“氨基酸”包括亚氨基酸残基，如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(r)构型或(s)构型。
83.术语“n-末端延伸序列”是指与所需多肽的n-末端氨基酸可移除地连接的肽或多肽序列。在优选实施方式中，n-末端延伸序列包括seq id no:1的氨基酸序列。
具体实施方式
84.本发明公开了用于高效生产生物活性肽比如利拉肽的n-末端延伸序列、核酸、载体和重组宿主细胞。
85.本发明考虑一种在宿主细胞中获得高产量重组利拉肽的多维方法，该方法是提供一种表达构建体，其中编码利拉肽的核酸可操作地融合至编码tev(烟草蚀刻病毒)切割位点和n末端延伸序列(ne-3)的修饰的基因序列。
86.在一个实施方式中，本发明涉及seq id no:1中示出的n-末端延伸序列(ne-3)。本发明涉及一种在细菌或酵母中利用如seq id no:1中示出的短n-末端延伸序列使重组治疗性肽的表达增强数倍的方法。
87.在另一个实施方式中，编码seq id no:1中所述n-末端延伸序列(ne-3)的核酸也涵盖在本发明的范围内。
88.用于表达重组治疗性肽的合适宿主细胞选自真核宿主，比如但不限于包括毕赤酵母和酿酒酵母的酵母。也可使用细菌宿主，例如但不限于谷氨酸棒杆菌、大肠埃希杆菌和枯草芽孢杆菌。
89.术语治疗性肽包括肽，比如但不限于利拉肽、特立帕肽、艾塞那肽(exenatide)等。
90.本领域技术人员已知的组成型或诱导型启动子可用于本发明一个或多个实施方式中的表达盒中。
91.在另一个实施方式中，本发明提供了包括启动子、信号序列、n-末端延伸序列(ne-3)、利拉肽或特立帕肽的编码基因、tev切割位点和终止子的表达盒。
92.在一个实施方式中，本发明提供了如seq id no:1中示出的n-末端延伸序列，以增强治疗性肽在酵母中的表达，其中酵母为毕赤酵母、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、大肠埃希杆菌和枯草芽孢杆菌。
93.本发明还提供了具有seq id no:2中示出的氨基酸序列的tev切割位点。
94.在一个实施方式中，本发明提供了在细菌或酵母中利用如seq id no:1中示出的n-末端延伸序列增强表达如seq id no:3中示出的利拉肽和如seq id no:16中示出的特立
帕肽。
95.本领域技术人员已知的用于表达原核或真核蛋白质的表达结构可用于本发明的一个或多个实施方式中。
96.在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于高水平表达利拉肽的表达构建体，包括：
97.1、编码n-末端延伸序列(ne3)的修饰的基因序列，
98.2、编码tev(烟草蚀刻病毒)切割位点的修饰的基因序列，以及
99.3、编码利拉肽的修饰的基因序列。
100.在另一个实施方式中，本发明还提供了一种用于高水平表达利拉肽的表达构建体，包括：
101.1、如seq id no:4中示出的编码n-末端延伸序列(ne-3)的基因序列，
102.2、如seq id no:5中示出的编码tev(烟草蚀刻病毒)切割位点的基因序列，以及
103.3、如seq id no:6中示出的编码利拉肽的基因序列。
104.在另一个实施方式中，本发明还提供了一种在毕赤酵母中高水平表达如seq id no:3所述的利拉肽的方法，包括：
105.1、构建包括如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中示出的基因序列的重组载体(表达构建体)，
106.2、将表达构建体转化至毕赤酵母中，
107.3、评估和选择克隆，
108.4、将选择的克隆进行发酵处理，
109.5、分离和纯化利拉肽，并且
110.6、从纯化的利拉肽中切割n-末端延伸序列。
111.在另一个实施方式中，本发明还提供了一种用于高水平表达利拉肽的表达构建体，包括：
112.1、如seq id no:7中示出的编码n-末端延伸序列的基因序列，
113.2、如seq id no:8中示出的编码tev切割位点的基因序列，以及
114.3、如seq id no:9中示出的编码利拉肽的基因序列。
115.在一个实施方式中，本发明还提供了一种在谷氨酸棒杆菌中高水平表达如seq id no:3中示出的利拉肽的方法，包括：
116.1、构建包括seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9中示出的基因序列的重组载体(表达构建体)，
117.2、将表达构建体转化至谷氨酸棒杆菌中，
118.3、评估和选择克隆，
119.4、将选择的克隆进行发酵处理，
120.5、分离和纯化利拉肽，并且
121.6、从纯化的利拉肽中切割n-末端延伸序列。
122.本发明提供了一种用于高水平表达利拉肽的表达构建体，包括：
123.1、如seq id no:10中示出的编码n-末端延伸序列的基因序列，
124.2、如seq id no:11中示出的编码tev切割位点的基因序列，以及
125.3、如seq id no:12中示出述的编码利拉肽的基因序列。
126.在一个实施方式中，本发明还提供了一种在大肠埃希杆菌中高水平表达如seq id no:3中示出的利拉肽的方法，包括：
127.1、构建包括如seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中示出的基因序列的重组载体(表达构建体)，
128.2、将表达构建体转化至大肠埃希杆菌中，
129.3、评估和选择克隆，
130.4、将选择的克隆进行发酵处理，
131.5、分离和纯化利拉肽，并且
132.6、从纯化的利拉肽中切割n-末端延伸序列。
133.本发明提供了一种用于高水平表达利拉肽的表达构建体，包括：
134.1、如seq id no:13中示出的编码n-末端延伸序列的基因序列，
135.2、如seq id no:14中示出的编码tev切割位点的基因序列，以及
136.3、如seq id no:15中示出的编码利拉肽的基因序列。
137.在一个实施方式中，本发明还提供了一种在枯草芽孢杆菌中高效表达如seq id no:3中示出的利拉肽的方法，包括：
138.1、构建包括如seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15中示出的基因序列的重组载体(表达构建体)，
139.2、将表达构建体转化至枯草芽孢杆菌中，
140.3、克隆的评价和选择，
141.4、将选择的克隆进行发酵处理，
142.5、分离和纯化利拉肽，并且
143.6、从纯化的利拉肽中切割n-末端延伸序列。
144.本发明提供了使用包括n-末端延伸序列的表达构建体在谷氨酸棒杆菌中高水平表达如seq id no:16中示出的特立帕肽。
145.本发明提供了利用包括n-末端延伸序列的表达构建体在毕赤酵母中高水平表达如seq id no:16中示出的特立帕肽。
146.本发明提供了在谷氨酸棒杆菌中高水平表达如seq id no:16中示出的特立帕肽，包括下述步骤：
147.1、构建重组载体(表达载体)
148.2、将表达构建体转化至谷氨酸棒杆菌中，
149.3、评估和选择克隆，
150.4、将选择的克隆进行发酵处理，
151.5、分离和纯化特立帕肽，并且
152.6、从纯化的特立帕肽中切割n-末端延伸序列。
153.本发明还提供了如seq id no:1中示出的n-末端延伸序列，以增强特立帕肽在毕赤酵母中的表达，包括下述步骤：
154.1、构建重组载体(表达构建体)，
155.2、将构建的载体转化至毕赤酵母中，
156.3、评估和选择克隆，
157.4、将选择的克隆进行发酵处理，
158.5、分离和纯化特立帕肽，并且
159.6、从纯化的特立帕肽中切割n-末端延伸序列。
160.在另一个实施方式中，本发明提供了一种修饰的利拉肽，其中该利拉肽可操作地融合至tev(烟草蚀刻病毒)切割位点和n-末端延伸序列(ne-3)，并且其中该修饰的利拉肽如seq id no:19中示出。
161.在另一个实施方式中，本发明提供了一种使用本发明的重组宿主细胞表达利拉肽的方法，其中发酵过程包括：
162.a、将重组宿主细胞在bmgy培养基中培养约24小时；
163.b、通过离心收获重组宿主细胞；
164.c、将重组宿主细胞在bmmy培养基中重悬至od
600nm
为约10；
165.d、将宿主细胞置于摇瓶培养箱中在30℃下培养约24小时；
166.e、收集并且纯化培养物上清以获得利拉肽。
167.利拉鲁肽是人glp-1的类似物并且作为glp-1受体激动剂。利拉肽是通过将c-16脂肪酸(棕榈酸)用谷氨酸间隔子(spacer)连接在肽前体(如seq id no:3中示出的利拉肽)位置26处的剩余赖氨酸残基上而制备的。
168.在另一个实施方式中，本发明提供了利拉鲁肽的制备，包括利用本领域已知的方法将根据本发明产生的利拉肽与棕榈基谷氨酸衍生物，比如1-甲基棕榈基谷氨酸结合。
169.在另一个实施方式中，本发明提供了利拉鲁肽的制备，包括使用本领域已知的方法将根据本发明产生的利拉肽与棕榈基谷氨酸酯衍生物的缀合，其中衍生物为甲基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、乙基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、丙基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、丙-2-基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、丁基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、丁-2-基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、2-甲基丙-1-基(1-甲基棕榈基谷氨酸)、2-甲基丙-2-基(叔丁基)(1-甲基棕榈基谷氨酸)、己基(1-甲基棕榈基谷氨酸)等。该缀合反应在偶联剂存在下进行。偶联剂可选自dic/6-cl-hobt、dic/hobt、hbtu/hobt/diea或dic/oxyma。
170.在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括下述步骤：
171.a、在合适的培养基中培养本发明的重组宿主细胞以获得利拉肽；
172.b、将利拉肽转化为利拉鲁肽，其中所述方法包括将步骤(a)中获得的利拉肽与棕榈基谷氨酸酯衍生物缀合。
173.以上公开一般描述了本发明。通过下述具体实例可以获得更完整的理解。本示例仅出于举例说明的目的而描述，并不是意在限制本发明的范围。虽然本文中使用了特定术语，但此类术语的目的是描述性的，而非限制性的。
174.实施例
175.实施例1：用于表达利拉肽的修饰的核酸
176.为了在毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、大肠埃希杆菌和枯草芽孢杆菌中获得最佳表达，对编码利拉鲁肽前体肽的表达盒进行了修饰。该修饰的开放阅读框包括编码利拉肽的核苷酸序列，该核苷酸序列融合至编码tev(烟草蚀刻病毒)切割位点的序列和编码n-末端延伸
序列(ne-3或ne-1)的序列。使用在毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、大肠埃希杆菌和枯草芽孢杆菌中表达的优选密码子以替代稀有密码子。
177.作为对照，制备了包括编码利拉肽的核苷酸序列的开放阅读框，该核苷酸序列不含任何n-末端延伸序列。
178.在毕赤酵母中表达
179.为了在毕赤酵母中表达，对编码利拉肽的核苷酸序列、编码tev切割位点的核苷酸序列和编码n末端延伸序列的核苷酸序列进行了修饰。
180.编码利拉肽的核苷酸序列由seq id no:6表示。编码tev切割位点的核苷酸序列由seq id no:5表示。编码n-末端延伸序列(ne-3)的核苷酸序列由seq id no:4表示。
181.这种修饰的开放阅读框是使用用于利拉肽序列、tev切割位点序列和n-末端延伸序列人工合成的。
182.图1示出了修饰后的开放阅读框，其包括编码不含n-末端延伸序列(图1a)和具有n-末端延伸序列-1(ne1)(gaggaagagcg，图1b)、n-末端延伸序列-3(ne3)(gaagagagagagagcgaa，图1c)的利拉肽，以及tev(烟草蚀刻病毒)切割位点序列(gagaaagttactctcaa)和信号序列盒的dna。
183.将重组利拉肽的修饰的编码序列克隆到pd912表达载体(atum，usa)中。重组质粒包括开放阅读框和启动子。
184.pd912的质粒载体图谱(vector map)如图1中所示。
185.在谷氨酸棒杆菌中的表达
186.为了在谷氨酸棒杆菌中表达，对编码利拉肽的核苷酸序列、编码tev切割位点的核苷酸序列和编码n-末端延伸的核苷酸序列进行了修饰。
187.编码利拉肽的核苷酸序列由seq id no:9表示。编码tev切割位点的核苷酸序列由seq id no:8表示。编码n-末端延伸(ne-3)的核苷酸序列由seq id no:7表示。
188.利用thermo fisher scientific technique，利用利拉肽序列、tev切割位点序列和n-末端延伸序列，人工合成了这种修饰的开放阅读框。
189.将重组利拉肽的修饰的编码序列克隆到pd912表达载体(atum，usa)中。重组质粒包括开放阅读框和启动子。
190.在大肠埃希杆菌中表达
191.为了在大肠埃希杆菌中表达，对编码利拉肽的核苷酸序列、编码tev切割位点的核苷酸序列和编码n末端延伸的核苷酸序列进行了修饰。
192.编码利拉肽的核苷酸序列由seq id no:12表示。编码tev切割位点的核苷酸序列由seq id no:11表示。编码n-末端延伸(ne-3)的核苷酸序列由seq id no:10表示。
193.这种修饰的开放阅读框是利用利拉肽序列、tev切割位点序列和n-末端延伸序列人工合成的。
194.将重组利拉肽的修饰的编码序列克隆到pd912表达载体(atum，usa)中。重组质粒包括开放阅读框和启动子。
195.在枯草芽孢杆菌中表达
196.为了在枯草芽孢杆菌中表达，对编码利拉肽的核苷酸序列、编码tev切割位点的核苷酸序列和编码n末端延伸的核苷酸序列进行了修饰。
197.编码利拉肽的核苷酸序列由seq id no:15表示。编码tev切割位点的核苷酸序列由seq id no:14表示。编码n-末端延伸(ne-3)的核苷酸序列由seq id no:13表示。
198.这种修饰的开放阅读框是利用利拉肽序列、tev切割位点序列和n-末端延伸序列人工合成的。
199.将重组利拉肽的修饰的编码序列克隆到pd912表达载体(atum，usa)中。重组质粒包括开放阅读框和启动子。
200.质粒dna线性化的确认
201.用ecori和bglii限制性内切酶消化合成的不含n-末端延伸序列、n-末端延伸序列-1、n-末端延伸序列-3和质粒pd912的利拉肽dna。将限制性酶切片段连接并转化至大肠埃希杆菌菌株中。对含有利拉肽表达盒、不含n-末端延伸序列(图2a)、n-末端延伸序列-1(图2b)、n-末端延伸序列-3(图2c)的合成质粒进行测序，以确认利拉肽、n-末端延伸序列和tev切割位点序列。用用sac i酶使序列确认的质粒dna线性化。
202.实施例2：通过重组质粒转化重组宿主细胞的开发
203.如前述实施例所述，携带融合至信号肽的利拉肽前体肽基因的重组pd912质粒用于重组宿主的开发。
204.利用质粒通过电穿孔法转化毕赤酵母宿主细胞(获自美国atum)。
205.将转化的细胞接种在含有100μg/ml博莱霉素的ypd琼脂(酵母蛋白胨葡萄糖)平板上。转化的毕赤酵母细胞在20ml bmgy培养基中培养24小时。通过离心收集细胞，并在20ml bmmy培养基中重悬至od
600nm
为10。细胞悬浮液在30℃的摇瓶培养箱中培养24小时。
206.实施例3：利拉肽表达的分析和评价
207.24小时后，收集、纯化培养上清，并使用针对利拉肽特异性的单克隆抗体通过elisa(图3)分析利拉肽的表达。此外，使用水分分析仪测量细胞干重(图4)。
208.表1和表2提供了一种比较，确定了n-末端延伸序列在提高利拉肽产量方面的效果。
209.表1：与没有n-末端延伸序列的对照组相比，不同的n-末端延伸序列和利拉肽表达
[0210][0211]
表2：与没有n-末端延伸序列的对照组相比，不同的n-末端延伸序列和利拉肽表达的倍数差异
[0212]
延伸序列克隆倍数差异eea11.0
eea20.8eea30.9eeqae14.6eeqae24.8eeqae34.4
[0213]
上述数据清楚地表明，与对照组和已知的n-末端延伸序列相比，n-末端延伸序列能够将利拉肽的表达提高约5倍。