一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法

1.本发明涉及干细胞技术领域，具体地，涉及一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法。


背景技术：

2.基质细胞(marrow stromal cells,mscs)是体内最为常见的细胞之一，其对于大多数组织的发育、维持、功能和再生至关重要。它们可以沿多个结缔谱系分化，但与其他大多数干/祖细胞不同，它们在保持发育潜力的同时执行各种其他功能，例如在体内通过分泌营养因子和促进细胞外基质(ecm)分子再生来响应损伤，并在再生失败时促进纤维化修复过程(cell stem cell.2021 oct 7；28(10):1690-1707.)；其中骨髓中的基质细胞还参与形成骨髓造血微环境，支持造血、成骨分化等(nature.2014 jan 16；505(7483):327-34.)，同时由于其低免疫原性在骨损伤修复及重建骨髓造血微环境或生态位等方面有着不可替代的作用，具有广阔的临床应用前景。
3.然而骨髓基质细胞的获取不但具有较大的创伤性，且不同个体的骨髓来源的基质细胞存在较大的异质性，同时难以在体外连续传代和大量扩增，无法满足临床治疗的需求。因此，如何在体外稳定且大量获取骨髓基质细胞成为解决其临床转化受限的关键问题。
4.近年来，大量文章报道多能干细胞包括诱导多能干细胞和胚胎干细胞在分化为各种胚层细胞类型中应用，但未见有报道多能干细胞诱导经体壁中胚层阶段获得其来源骨髓基质细胞的分化方法。其中体壁中胚层细胞(somatic mesoderm cells，sm-mcs)是胚胎发育的过程中，属于侧板中胚层阶段的细胞之一，位于外胚层与胚内体腔之间，是形成结缔组织和四肢骨骼元素(骨骼和软骨)的祖细胞。先前的研究表明，体壁中胚层细胞衍生的基质细胞存在于长骨的骨髓中(front genet.2019 oct 11；10:977；development.2020 jun 19；147(12):dev175059)。另外，现有技术手段(中国专利《永生化大鼠骨髓基质细胞系及其制备方法》)其是将人端粒酶反转录酶催化亚基基因通过逆转录病毒载体导入大鼠骨髓基质细胞，得到永生化大鼠骨髓基质细胞系，此细胞系虽能在体外长期扩增，但由于其种属问题，无法应用于临床的细胞治疗中。


技术实现要素：

5.本发明为了克服现有技术中无法利用多能干细胞制备骨髓基质细胞的难题，从细胞发育起源的角度出发，在体外通过特定诱导分化流程来获得特定发育路径骨髓基质细胞。本发明提供一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法，其由多能干细胞诱导的经体壁中胚层来源的骨髓基质细胞稳定、高效的制备方法，其得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞不但具有高重现性、低异质性、可大量扩增的特点，而且具有更强的骨形成能力及更优越的造血支持能力。可以为细胞治疗的临床转化提供新的、高质量的细胞来源，同时，其也可以为研究支持造血干细胞移植、四肢骨骼发育及其相关疾病的发病机制研究提供理想的体外模型。
6.本发明的第一个目的是提供一种骨髓基质细胞。
7.本发明的第二个目的是提供一种体壁中胚层细胞来源的骨髓基质细胞。
8.本发明的第三个目的是提供一种多能干细胞诱导为体壁中胚层细胞的培养液。
9.本发明的第四个目的是提供一种骨髓基质细胞无血清完全培养液。
10.本发明的第五个目的是提供任一所述培养液和/或所述骨髓基质细胞无血清完全培养液在多能干细胞诱导骨髓基质细胞中的应用
11.本发明的第六个目的是提供一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法。
12.本发明的第七个目的是提供所述方法制备得到的骨髓基质细胞。
13.本发明的第八个目的是任一所述的骨髓基质细胞在制备具有促进造血支持和/或骨修复的药物的应用。
14.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
15.本发明将多能干细胞通过限定诱导方法经中内胚层(mesendoderm)阶段高效诱导为体壁中胚层细胞(somatic mesoderm cells，smcs)后，将体壁中胚层细胞重新消化接种后更换为骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)或市售商业化msc培养液(stemfit)或市售商业化msc培养液(acf)进行连续培养，检测其表型，即得体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells，sm-mscs)
16.本发明中所使用的“smcs”是指体壁中胚层细胞。
17.本发明中所使用的“sm-mscs”是指由多能干细胞诱导的经体壁中胚层细胞的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞。
18.本发明提供了一套新的、标准化、可行性强的骨髓基质细胞体外诱导分化流程，这种可批量生产的骨髓基质细胞，不但可以为细胞治疗领域的临床转化提供新的、高质量的细胞来源，也可以为研究支持造血干细胞移植、四肢骨骼发育及其相关疾病的发病机制研究提供理想的体外模型。
19.具体地，本发明将诱导性多能干细胞于包被了基质胶的培养板或培养皿上传代扩增，待其生长至诱导所需细胞量时，制成单细胞悬液贴壁后，用添加gsk-3抑制剂的培养液定向诱导1～3天，即得到中内胚层细胞；随后改用体壁中胚层细胞诱导培养液定向诱导5～7天，将中内胚层细胞诱导为体壁中胚层细胞群体；最后将上步中的体壁中胚层细胞重新消化接种后，并骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)或市售商业化msc培养液(stemfit或acf)连续传代培养6～8次，流式鉴定其表面标志物，并对其造血支持能力、成骨成软骨能力进行检测。
20.因此本发明要求保护一种骨髓基质细胞，其是由多能干细胞诱导为体壁中胚层细胞后在骨髓基质细胞培养液连续传代培养得到的。
21.以及一种体壁中胚层细胞来源的骨髓基质细胞，所述体壁中胚层细胞来源的骨髓基质细胞由多能干细胞，经历体壁中胚层细胞阶段后诱导得到。
22.优选地，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
23.更优选地，所述诱导性多能干细胞诱导多能干细胞。
24.本发明还要求保护一种多能干细胞诱导为体壁中胚层细胞的培养液，所述培养液为含有gsk-3抑制剂和bmp信号通路激活剂组合的基础培养液。
25.优选地，所述基础培养液为dmem-f12。
26.优选地，所述gsk-3抑制剂为ly2090314、sb216763、chir99021和chir99021 hcl中的一种或几种。
27.更优选地，所述gsk-3抑制剂为chir99021。
28.优选地，所述bmp信号通路激活剂为bmp2、bmp4或bmp7中的一种或几种。
29.更优选地，所述bmp信号通路激活剂为bmp7。
30.再优选地，所述培养液含有1～20μm chir99021和1～500ng/ml bmp7。
31.再更优选地，所述培养液含有1～5μm chir99021和1～100ng/ml bmp7。
32.进一步优选地，所述培养液含有3μm chir99021和100ng/ml bmp7。
33.优选地，所述培养液还含有1～5％(v/v)its培养添加剂、1～5％(v/v)％neaa和1～5％(v/v)％glutamax。
34.更优选地，所述培养液还含有1％(v/v)its培养添加剂、1％(v/v)neaa和1％(v/v)glutamax。
35.最优选地，所述培养为含有1％(v/v)its培养添加剂、1％(v/v)neaa、1％(v/v)glutamax、以及3μm chir99021和100ng/ml bmp7的dmem-f12培养液。
36.本发明也要求保护一种骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)，其可以诱导体壁中胚层细胞诱导为骨髓基质细胞的，含有1～10％(v/v)血清替代物、1～5％(v/v)neaa、1～5％(v/v)its培养添加剂、1～10mm l-谷氨酸、0.1～10mm的β-巯基乙醇、1～100ng/ml bfgf、1～100ng/ml egf、1～100ng/ml vegf、0.1～10mg/ml人血小板衍生生长因子、0.1～10mg/ml维生素c和0.1～5mm尿苷uridine的基础培养液。
37.优选地，所述基础培养液为α-dmem培养液。
38.优选地，所述血清替代为kosr或ultroser
tm g serum substitute。
39.更优选地，所述血清替代为kosr。
40.更优选地，所述人血小板衍生生长因子为pdgfaa和pdgfbb。
41.再优选地，所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)为含有1～5％(v/v)血清替代物kosr、1～5％(v/v)neaa、1～5％(v/v)its培养添加剂、1～5mm l-谷氨酸、1～5mm的β-巯基乙醇、1～10ng/ml bfgf、1～10ng/ml egf、1～10ng/ml vegf、1～100ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfaa、1～100ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfbb、0.1～300ng/ml维生素c、0.1～500μm尿苷uridine的α-dmem培养液。
42.再更优选地，所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)为含有5％(v/v)血清替代物kosr、1％(v/v)neaa、1％(v/v)its培养添加剂、5mm l-谷氨酸、1mm的β-巯基乙醇、2ng/ml bfgf、2ng/ml egf、1ng/ml vegf、20ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfaa、20ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfbb、300ng/ml维生素c、100μm尿苷uridine的α-dmem培养液。
43.本发明要求保护所述培养液和/或所述骨髓基质细胞无血清完全培养液在多能干细胞诱导骨髓基质细胞中的应用。
44.优选地，所述培养液和/或所述骨髓基质细胞无血清完全培养液在多能干细胞诱导的经体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞中的应用。
45.优选地，所述培养液和所述骨髓基质细胞无血清完全培养液的组合多能干细胞诱导骨髓基质细胞中的应用。
46.本发明还要求保护一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法，包括如下步骤：
47.s1.将多能干细胞诱导为中内胚层细胞：将多能干细胞解离分散后接种于包被基质胶的培养板或培养皿中，利用含有chir99021的培养液培养1～3天后，即得到中内胚层细胞；
48.s2.将中内胚层细胞诱导为体壁中胚层细胞：利用所述多能干细胞诱导为体壁中胚层细胞的培养液，培养上一步的产物5～7天后，即得到体壁中胚层细胞；
49.s3.将体壁中胚层细胞诱导为体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞：将得到的体壁中胚层细胞重新消化接种于骨髓基质细胞培养液后，用骨髓基质细胞培养液连续传代培养6～8次后，即得到体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞。
50.优选地，所述骨髓基质细胞培养液为所述的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)或市售商业化msc培养液(例如stemfit或acf)。
51.更优选地，所述骨髓基质细胞培养液为所述的骨髓基质细胞无血清完全培养液。
52.优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞或胚胎干细胞。
53.更优选地，所述多能干细胞为人诱导多能干细胞或人胚胎干细胞。
54.优选地，步骤s1中，含有chir99021的培养液为含有1～10μm chir99021的dmem-f12培养液。
55.优选地，步骤s1中，多能干细胞用accutase解离分散成单细胞或细胞团块，细胞接种于包被基质胶的培养板或培养皿，接种数目为1
×
103～1
×
107/cm2。
56.更优选地，细胞接种数目为1
×
104～2
×
104/cm2。
57.优选地，所述基质胶为matrigel或层粘连蛋白ln。
58.更优选地，所述基质胶为matrigel，其是用预冷的dmem-f12按体积1：100的比例稀释matrigel原液后，提前1～12h包被培养板或培养皿。
59.更优选地，所述基质胶为层粘连蛋白ln，用pbs按体积1:100稀释后，加入孔板中室温包被过夜。
60.优选地，步骤s1中，诱导得到的中内胚层细胞的标志物tbxt和mixl1双阳性细胞比例可达95％以上，无需进行分选纯化即可进行下一步诱导。
61.优选地，步骤s2中，诱导得到的体壁中胚层细胞高表达其标志物hand1、foxf1、tbx4、prrx1和pitx1，同时hand1和foxf1双阳性细胞比例达95％以上。
62.优选地，步骤s3中，通过骨髓基质细胞培养液连续传代培养6～8次后，即得到体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞。
63.根据发明人实验证明使用本发明所述的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)，或市售商业化msc培养液(例如stemfit和acf)均可获得体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞。但在本发明所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)中诱导扩增的骨髓基质细胞，与市售商业化msc培养液(例如stemfit和acf)相比，其增殖速度更快、增殖代数更多，且具有更好的成骨和造血支持能力，有显著统计学差异。，因此，本发明中所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)在诱导多能干细胞来源骨髓基质细胞中有明显的的优势。
64.优选地，步骤s3中，步骤s3中体壁中胚层细胞在骨髓基质细胞培养液持续传代培
养6～8次后，表达cd44、cd90和cd140b，且不表达造血干细胞标志物cd34和cd45时，即得到体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞。
65.以上任一所述方法制备得到骨髓基质细胞也属于本发明的保护范围。
66.所述的骨髓基质细胞在制备具有促进造血支持和/或骨修复的药物的应用，也属于本发明的保护范围。
67.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
68.本发明通过使用特定诱导培养液严格限定细胞分化路径，由多能干细胞诱导经体壁中胚层细胞阶段得到其来源骨髓基质细胞。本发明中体壁中胚层细胞不仅均质且诱导效率能达到95％以上。同时本发明的诱导分化体系可操作性强、诱导分化程序标准化，可保证不同细胞株来源、不同批次间的骨髓基质细胞性状稳定且具有良好功能特性。
69.这种分化路径清晰、来源明确的骨髓基质细胞不但能在体外快速扩增，不但与骨骼间充质细胞具有相似的典型同源结构域转录因子(hox)基因表达模式，且体内外实验表明体壁中胚层细胞诱导的骨髓基质细胞(sm-mscs)相较于骨髓中直接分离的骨髓间充质干细胞(bmscs)具备更好的成骨、成软骨及造血支持能力。因此，这种来源明确、增殖速度快、异质性较低的骨髓基质细胞，可以为细胞治疗领域的临床转化提供新的、高质量的细胞来源，也可以为研究支持造血干细胞移植、四肢骨骼发育及其相关疾病的发病机制研究提供理想的体外模型。
附图说明
70.图1为实施例3培养的hipsc细胞的白光(图1a)及hipsc细胞多能性标记免疫荧光照片(图1b)。
71.图2为实施例3中hipsc细胞在gsk-3抑制剂处理2天后的细胞形态图(图2a)及中内胚层标志物tbxt和mixl1的实时荧光定量pcr检测结果(图2b)和免疫荧光染色图片(图2c)。
72.图3为实施例3中hipsc来源中内胚层细胞用体壁中胚层诱导培养液诱导6天后的细胞形态图(图3a)，实时荧光定量pcr检测其标志物hand1、foxf1、tbx4、prrx1、pitx1基因的表达(图3b)，同时免疫荧光染色检测其标志hand1和foxf1的表达情况(图3c)以及hand1和foxf1的流式检测诱导效率图(图3d)
73.图4为本实施例3中体壁中胚层细胞在骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))中传代6次后的细胞形态图及cd90的免疫荧光染色图(图4a)及细胞表面标记流式分析图(图4b)。
74.图5为本实施例3中利用荧光定量pcr检测骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))诱导得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞的同源结构域转录因子(hox)基因表达情况图。
75.图6为选取实施例3中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))诱导得到的不同批次体壁中胚层来源骨髓基质细胞中的两批次(sm-mscs 1，sm-mscs 2)与对照例1中不同批次分离得到的骨髓间充质干细胞中的两批次(bmscs 1，bmscs 2)进行增殖能力的比较，其是利用cck-8检测细胞增殖变化并作图。
76.图7实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液的制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞，进一步比较增殖能力(图7a)及增殖代数(图7b)。其中骨髓基质细胞培养
液包括骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)、市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)、以及市售商业化msc培养液(acf；stem cell technologies)。
77.图8为实施例3中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)，进一步比较在体外成骨、成软骨及造血支持的能力，包括体外成骨成软骨染色、酶标仪定量(图8a)及荧光定量pcr检测成骨(col1a1、alp、con和opn)及成软骨(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达量(图8b)、实时荧光定量pcr检测造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)表达(图8c)、流式检测共培养体系中cd34 hsc维持比例(图8d)、克隆形成分析ltc-ic中形成的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(cfu-gm)、爆式红系集落形成单位(bfu-e)及其统计图(图8e)。
78.图9为实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液(sm-mscsmedium、stemfit、acf)中制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞，进一步比较在体外成骨、成软骨及造血支持能力。包括荧光定量pcr检测成骨(col1a1、alp、con和opn)及成软骨(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达量(图9a)、实时荧光定量pcr检测造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)表达(图9b)。
79.图10为实施例3诱导得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞(sm-mscs)与对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)比较在体内成骨及造血支持的能力，包括成骨能力检测masson染色图及其统计图(图10a)、成骨标志物(ocn、opg)免疫荧光染色图(图10b)、he染色后造血细胞簇图及其数目统计图(图10c)、cd45 造血祖细胞免疫荧光染色(图10d)。
80.图11为通过rna-seq对实施例3诱导得到的不同批次体壁中胚层中的两批次(sms 1、sms 2)及不同批次体壁中胚层来源骨髓基质细胞中的两批次(sm-mscs 1和sm-mscs 2)与对照例1中的中不同批次长骨骨髓直接分离的骨髓间充质干细胞中的两批次(bmscs 1和bmscs 2)进行基因表达谱进行分析，同一分化阶段不同批次的2个样本之间(sms 1 vs sms 2；sm-mscs 1 vs sm-mscs 2；bmscs 1 vs bmscs 2)的基因表达谱分析(图11a)，对sms 1、sms 2；sm-mscs 1、sm-mscs 2；bmscs 1、bmscs 2进行不同阶段基因表达分析(图11b)以及sm-mscs 1、sm-mscs 2与bmscs 1、bmscs 2的同源结构域转录因子(hox1-13)基因表达模式图(图11c)。
81.图12为本实施例7中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))制备得到的胚胎干细胞(h1-es)来源骨髓基质细胞流式检测表面标志物图(图12a)，形态图及体外成骨成软骨检测图(图12b)，及利用骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)制备得到的胚胎干细胞(h1-es)来源骨髓基质细胞与相应培养基培养得到的对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)进行比较在免疫缺陷鼠体内骨形成(图12c)及造血支持能力检测图(图12d)。
具体实施方式
82.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
83.以下实施例中荧光定量pcr使用的引物见下表：
[0084][0085]
[0086][0087]
以下实施例中免疫荧光染色使用的抗体见下表：
[0088]
antigenhostdilutioncompanycat.no.nanograbbit1:400cell signaling technology4903soct4mouse1:400cell signaling technology75463stbxtgoat1:400r&d systemsaf2085mixl1rabbit1:400proteintech group22772-1-aphand1goat1:400r&d systemsaf3168foxf1rabbit1:200abcamab168383ocnmouse1:400r&d systemsmab1419opgrabbit1:400merck milliporeabc463anti-mouse cd45rat1:100ebioscience12-0451-82
[0089]
以下实施例中流式检测使用的抗体见下表：
[0090][0091][0092]
细胞免疫荧光染色的方法：将细胞克隆用4％多聚甲醛pfa固定后，pbs洗涤3次，随后用2％bsa封闭30分钟，pbs洗涤2次。加入一抗，4℃过夜，pbs洗涤3次，每次5分钟；加入二
抗，室温孵育30～45分钟；pbs洗涤4次后，加入0.5μg/ml dap i染色10分钟，去除dapi后，用pbs洗涤三遍；完成染色后用封片剂封片，最后共聚焦上拍照。
[0093]
荧光定量pcr的方法：将细胞用accutase消化收集，pbs洗3次后，使用1ml rnazol裂解细胞，提取总rna后，使用定量反转录试剂盒(qiagen)在10μl反应体系中反转录成cdna。使用dynamo colorflash sybr green qpcr试剂盒(thermo fisher scientific)在lightcycler 480检测系统(进行荧光定量pcr检测。热循环条件为:95℃变性10s,60℃退火20s,72℃延伸30s，共45次循环。以gapdh作为内参，采用2-δδct法计算基因表达量。
[0094]
骨髓基质细胞流式检测的方法：将骨髓基质细胞用accutase消化，1100rpm离心4min后弃上清，用50ul pbs重悬细胞，用同型同源抗体(bd pharmingen)作为阴性对照(同型对照)。在另外的管中分别加入流式抗体(cd34、cd45、cd44、cd90、cd140b)染色20min，用pbs洗涤2次，每次5min，1100rpm离心4min后，弃上清，用200ul pbs重悬细胞后在流式细胞仪上机检测阳性细胞的比例。
[0095]
实施例1一种多能干细胞诱导为体壁中胚层细胞(somatic mesoderm cells，smcs)的培养液
[0096]
含有1％(v/v)its培养添加剂、1％(v/v)neaa、1％(v/v)glutamax、以及3μm chir99021和100ng/ml bmp7的dmem-f12培养液。
[0097]
实施例2一种骨髓基质细胞无血清完全培养液
[0098]
含有5％(v/v)血清替代物kosr、1％(v/v)neaa、1％(v/v)its培养添加剂、5mm l-谷氨酸、1mm的β-巯基乙醇、2ng/ml bfgf、2ng/ml egf、1ng/ml vegf、20ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfaa、20ng/ml人血小板衍生生长因子pdgfbb、300ng/ml维生素c和100μm尿苷uridine的α-dmem培养液。
[0099]
对照例1骨髓间充质干细胞(bmscs)的制备及培养方法
[0100]
本实施例的目的在于说明本发明后续实施例中使用的骨髓间充质干细胞(bmscs)的分离、制备及培养方法。
[0101]
其中使用密度梯度离心法分离人长骨骨髓中的间充质干细胞；使用的骨髓基质细胞培养液对骨髓间充质干细胞进行扩增培养，骨髓基质细胞培养液为：无血清的实施例2的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)、或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)或市售商业化msc培养液(acf；stem celltechnologies)。
[0102]
具体的操作步骤如下：
[0103]
(1)将5ml的人骨髓液，用等体积pbs稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟；
[0104]
(2)弃去脂肪层后将剩余的骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积ficoll分离液(1.077g/ml)上面，室温2500rpm离心30分钟；
[0105]
(3)吸取分离液中界面为白膜状层的单个核细胞，用40ml pbs混悬后，室温1500rpm离心10分钟；
[0106]
(4)弃上清并用50ml pbs重复洗涤2次。
[0107]
(5)用骨髓基质细胞培养液重悬细胞，进行扩增培养，以2
×
105/ml的细胞密度，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5％co2培养箱中进行培养。
[0108]
(6)于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，之后每2～3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化，14天培养瓶中基本无悬浮细胞，所有细胞呈纤维状贴壁生长，且细胞状
态良好。
[0109]
(7)待细胞生长达80％～90％融合时，用accutase进行消化，按1：3比例进行传代培养，并将细胞用于后续实验。
[0110]
(8)其中不同批次分离的骨髓间充质干细胞标注为bmscs 1、bmscs 2、bmscs 3等，并将其应用于后续实验中。
[0111]
实施例3人诱导多能干细胞(hipsc)经体壁中胚层细胞向骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells,sm-mscs)诱导分化
[0112]
本实施例的目的在于说明在稳定建立并培养人诱导多能干细胞系(hipsc)的基础上进行诱导分化操作。
[0113]
一、hipsc细胞的培养及多能干细胞的多能性的检测
[0114]
1、实验方法
[0115]
人诱导多能干细胞(hipsc)指的是人皮肤成纤维细胞诱导的多能干细胞，由实验室利用诱导多能干细胞技术(ipscs)构建获得。hipsc细胞使用stem cell公司的mtesr培养液进行大规模扩增，维持其未分化状态。同时，需要在培养液质上包被基质胶，基质胶选择matrigel或层粘连蛋白ln，进行后续实验。
[0116]
具体的操作步骤如下：
[0117]
(1)包被培养皿：(a)冰上融解matrigel并用预冷的dmem-f12按体积1：100的比例稀释matrigel原液后，加入孔板中室温包被过夜备用；或(b)将层黏连蛋白ln用pbs按体积1:100稀释后，加入孔板中室温包被过夜备用。
[0118]
(2)复苏hipsc：37℃水浴锅中快速解冻hipsc细胞，转移至含有5ml mtesr培养液的15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞。
[0119]
(3)吸去包被的matrigel或层粘连蛋白ln，以2ml mtesr重悬细胞，均匀接种细胞，放入37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养。
[0120]
(4)每天更换培养液一次，观察细胞维持未分化状态，继续培养直至hipsc细胞克隆生长至80～90％的密度，进行传代。
[0121]
(5)细胞传代：pbs洗涤细胞两次，加入relesr
tm
，于37℃孵育1至5min，弃去relesr
tm
，以1ml mtesr培养液轻轻吹打细胞至大小合适的细胞团块。
[0122]
(6)收集mtesr重悬细胞，并以每孔100μl体积均匀地将细胞接种入事先铺有matrigel的孔板中，放入37℃、5％co2的培养箱中静置贴壁培养。
[0123]
(7)重复上述培养扩增步骤，以便获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
[0124]
(8)将上步中扩增的hipsc细胞克隆进行细胞免疫荧光染色，检测多能干细胞标志性转录因子nanog和oct4(cell signaling technology)。
[0125]
2、实验结果
[0126]
图1为本实施例中培养的hipsc细胞的白光及多能性标记免疫荧光照片；可见hipsc细胞克隆紧实、平整、无分化；且细胞表达多能性干细胞标志性的转录因子nanog和oct4。其中选用层粘连蛋白ln包被细胞培养板，效果与matrigel差不多，能维持多能干细胞的多能性，保持克隆形态。说明本实施例中用于诱导的hipsc细胞确为多能干细胞。
[0127]
二、人诱导多能干细胞(hipsc)来源体壁中胚层细胞(somatic mesoderm cells，smcs)的诱导分化及鉴定
[0128]
1、实验方法
[0129]
(1)待hipsc细胞长至80～90％的密度时，利用pbs洗涤细胞两次，加入500μl的accutase于37℃孵育4min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去accutase，以pbs轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀。
[0130]
(2)将细胞转移入15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞。
[0131]
(3)用含有3μm chir99021的dmem-f12培养液重悬细胞团，以1
×
104/cm2的细胞密度均匀地将细胞接种入事先包被好matrigel的孔板或培养皿中，放入37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养。
[0132]
(4)培养2天，将hipsc细胞诱导为中内胚层细胞，实时荧光定量pcr检测中内胚层标志物tbxt和mixl1，以及对其进行免疫荧光染色检测中内胚层标志物tbxt(r&dsystems)和mixl1(proteintech group)。
[0133]
(5)其中不同批次诱导的多能干细胞来源体壁中胚层细胞标注为smcs 1、smcs 2、smcs 3等，并将其应用于后续实验中
[0134]
(6)之后，更换的培养液为实施例1的培养液培养5～7天，将中内胚层细胞诱导为体壁中胚层细胞，期间每天换液，实时荧光定量pcr检测中胚层细胞(smcs)标志hand1、foxf1、tbx4、prrx和pitx1，以及对其进行免疫荧光染色检测体壁中胚层细胞标志物hand1(r&d systems)和foxf1(abcam)。
[0135]
(7)最后用流式检测hand1 /foxf1 的细胞比例，具体方法为：将体壁中胚层细胞消化后，用4％多聚甲醛pfa固定后，pbs洗涤2次，用1％破膜液洗涤细胞5分钟后，加入hand1和foxf1抗体室温孵育30分钟。随后再用1％破膜液洗涤2次，每次5分钟，用200ul pbs重悬细胞后在流式细胞仪上机检测hadn1和foxf1阳性细胞的比例。
[0136]
2、实验结果
[0137]
图2为本实施3例中hipsc细胞在gsk-3抑制剂(3μm chir99021)处理2天后的细胞形态图(图2a)及中内胚层标志物tbxt和mixl1的实时荧光定量pcr检测结果(图2b)以及tbxt和mixl1免疫荧光染色图片(图2c)。
[0138]
图3为本实施例3中hipsc来源中内胚层细胞用体壁中胚层诱导培养液诱导6天后的细胞形态图(图3a)，实时荧光定量pcr检测其标志物hand1、foxf1、tbx4、prrx1、pitx1基因的表达(图3b)，同时免疫荧光染色检测其标志hand1和foxf1的表达情况(图3c)以及hand1和foxf1的流式检测诱导效率图(图3d)
[0139]
结果表明多能干细胞可以被chir99021高效诱导为中内胚层细胞，高表达tbxt和mixl1，随后在实施例1含有gsk3抑制剂(chir99021)和bmp信号通路激活剂(bmp7)组合的培养液中，可以高效诱导为体壁中胚层细胞，hand1和foxf1双阳性比例达95％以上。
[0140]
三、体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells，sm-mscs)的诱导分化方法及鉴定
[0141]
1、实验方法
[0142]
上步中通过人诱导多能干细胞(hipsc)诱导获得的体壁中胚层细胞诱导为骨髓基质细胞使用的是骨髓基质细胞培养液，其中骨髓基质细胞培养液为：实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)、或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)或市售商业化msc培养液(acf；stem celltechnologies)。
[0143]
具体的操作步骤如下：
[0144]
(1)将上一步鉴定体壁中胚层细胞的培养液更换为基质细胞培养液，并于37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养，间隔每2～3天换液一次。
[0145]
(2)细胞生长至80～90％融合后，利用accutase消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞，弃上清后将细胞按1:3比例接种入新的培养皿中，完成细胞传代。
[0146]
(3)重复步骤2，在骨髓基质细胞培养液连续传代培养6～8次后，取部分细胞流式检测细胞表面分子cd34、cd45、cd44、cd90和cd140b的表达情况。当细胞表达骨髓基质细胞标志物cd44、cd90和cd140b，而不表达造血干细胞标志物cd34和cd45时，即得到体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞的表面标志物。
[0147]
(4)其中不同批次诱导的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞标注为sm-mscs 1、sm-mscs 2、sm-mscs 3等，并将其应用于后续实验中。
[0148]
(5)利用cell counting kit(cck-8)cck-8试剂盒检测本实施例制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)与人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(bmscs)进行增殖比较。
[0149]
(6)使用rnazol提取诱导分化得到的体壁中胚层细胞及其来源骨髓基质细胞总rna后，逆转录成cdna，荧光定量pcr检测同源结构域转录因子(hox9-13)基因表达情况。
[0150]
2、实验结果
[0151]
图4为本实施例3中体壁中胚层细胞在骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))中传代6次后的细胞形态图及cd90的免疫荧光染色(图4a)及细胞表面标记流式分析图(图4b)；诱导得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞形态与骨髓基质细胞类似，表现为典型的纤维状，且免疫荧光染色表明其高表达cd90；并且流式检测结果表明体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞表达骨髓基质细胞表面标志cd44、cd90、cd140b，不表达造血干细胞表面标志cd34、cd45。
[0152]
图5为本实施例3中利用荧光定量pcr检测骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))诱导得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞的同源结构域转录因子(hox)基因表达情况，结果表明诱导得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞与骨骼间充质细胞具有相似的典型同源结构域转录因子(hox)基因表达模式。
[0153]
图6为选取实施例3中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))诱导得到的不同批次体壁中胚层来源骨髓基质细胞中的两批次(sm-mscs 1，sm-mscs 2)与对照例1中不同批次分离得到的骨髓间充质干细胞中的两批次(bmscs 1，bmscs 2)进行增殖能力的比较，其是利用cck-8检测细胞增殖变化并作图。结果表明诱导得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞具有更强的增殖能力。
[0154]
图7为实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液的制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞，进一步比较增殖能力(图7a)及增殖代数(图7b)。其中骨髓基质细胞培养液包括骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)、市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)、以及市售商业化msc培养液(acf；stem cell technologies)。结果表明除了市售商业化msc培养液(stemfit和acf)外可诱导骨髓基质细胞外，实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)也可诱导获得骨髓基质细胞且其增殖速
度更快、增殖代数更多，有显著统计学差异。实施例4体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells，sm-mscs)体外成骨成软骨及造血支持能力检测
[0155]
一、实验方法
[0156]
本实施例中使用的是实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞及对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞。并且均以市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)或以实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)作为骨髓基质细胞培养液培养得到。
[0157]
1、体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞体外成骨、成软骨的能力
[0158]
(1)体外成骨分化：当实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞及对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞(bmscs)生长密度达80～90％时，将培养液更换为成骨诱导分化培养液(dmem(l)添加10％(v/v)fbs、10mmβ-glycerophosphate、50μg/ml维生素c及100nm的地塞米松)。每3天换液一次，诱导培养21天后进行茜素红染色。
[0159]
(2)体外成软骨分化：消化收集实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)，以2.0～3.0
×
105/15ml离心管的细胞量分接入15ml离心管中，300
×
g离心5min，弃上清，加入1ml软骨分化诱导培养液(dmem(h)添加10ng/ml重组人转化生长因子(recombinant human transforming growth factor-β3，tgf-β3)、100nm地塞米松、50μg/ml维生素c、1mm丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸及its培养添加剂)，置于培养箱孵育培养。每3天换液一次，诱导培养21天后进行阿辛蓝染色。
[0160]
(3)使用rnazol提取上述均以市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)诱导扩增的实施例3的骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)骨分化方法诱导的骨细胞总rna和软骨分化方法诱导得到的软骨细胞总rna，逆转录成cdna后，荧光定量pcr分别检测成骨基因(col1a1、alp、ocn和opn)、成软骨基因(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达情况。
[0161]
(4)使用rnazol提取上述实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液(sm-mscsmedium、stemfit、acf)中制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞的总rna，逆转录成cdna后，荧光定量pcr检测造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)表达；以及提取上述实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液中(sm-mscs medium、stemfit、acf)制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞用骨分化方法诱导的骨细胞总rna和软骨分化方法诱导得到的软骨细胞总rna，逆转录成cdna后，荧光定量pcr分别检测成骨基因(col1a1、alp、ocn和opn)、成软骨基因(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达情况。
[0162]
2、体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells，sm-mscs)体外造血支持能力检测
[0163]
(1)使用rnazol提取实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)总rna后，逆转录成cdna后，荧光定量pcr比较其造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l和angpt1)表达情况。
[0164]
(2)造血干细胞(hematopoietic stem cell，hscs)体外维持检测
[0165]
实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的
骨髓间充质干细胞(bmscs)以90％的密度预接种到24孔板上，培养过夜，第二天在培养液中加入0.5mg/ml丝裂霉素c处理bmscs和sm-mscs，3h后，弃去含有丝裂霉素c的培养液，用pbs洗涤3次，换成新鲜的培养液，得到丝裂霉素c处理后的bmscs和sm-mscs。随后将流式分选出的人脐带血中cd34 hscs，用stemspan
tm cd34 扩增培养液(stem cell technologies)重悬，按每孔5000个细胞的量接种于处理后的bmscs和sm-mscs中。共培养9天，期间每两天进行半换液。同时以在相同的stemspan
tm cd34 扩增培养液中单独培养的cd34 hsc作为对照。在共培养9天后，收集培养液中悬浮的细胞，用流式检测不同共培养条件下cd34 细胞的维持情况。
[0166]
(3)造血干细胞(hematopoietic stem cell，hscs)与体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞的体外长时程共培养(long-term culture initiating cell assays，ltc-ic)测定
[0167]
实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)以90％的密度预接种到24孔板上，培养过夜，第二天在培养液中加入0.5mg/ml丝裂霉素c处理对照例1中得到的bmscs和实施例3制备得到的sm-mscs，3h后，弃去含有丝裂霉素c的培养液，用pbs洗涤3次，换成新鲜的培养液，得到丝裂霉素c处理后的bmscs和sm-mscs。将cd34 hsc(细胞)按每孔1000个细胞接种到bmscs和sm-mscs中，用stemspan
tm cd34 扩增培养液(stem cell technologies)进行培养，期间每两天进行半换液。同时以在相同培养液中单独培养的cd34 hsc作为对照。共培养35天后，从共培养系统的上清液中分离出的10000个细胞接种在甲基纤维素(stem cell technologies)板中，并在37℃和5％co2中孵育14天后，对形成的菌落进行拍照、计数和分析。
[0168]
二、实验结果
[0169]
图8为实施例3中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)，进一步比较在体外成骨、成软骨及造血支持的能力，包括体外成骨成软骨染色、酶标仪定量(图8a)及荧光定量pcr检测成骨(col1a1、alp、con和opn)及成软骨(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达量(图8b)、实时荧光定量pcr检测造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)表达(图8c)、流式检测共培养体系中cd34 hsc维持比例(图8d)、克隆形成分析ltc-ic中形成的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(cfu-gm)、爆式红系集落形成单位(bfu-e)及其统计图(图8e)。
[0170]
结果表明体壁中胚层来源骨髓基质细胞(sm-mscs)相较于骨髓间充质干细胞(bmscs)，其茜素红s染色显示着色更深呈现深红色，同时酶标仪测量562nm处的吸光度也表明sm-mscs的茜素红s染色着色更深(图8a)，表明诱导sm-mscs成骨时生成的钙盐沉积更丰富，成骨能力更强；对于软骨分化，甲苯胺蓝染色显示sm-mscs诱导的软骨细胞呈紫蓝色，生成的软骨基质丰富，软骨球直径更大(图8a)，荧光定量pcr进一步检测相应的成骨(col1a1、alp、con、opn)及成软骨(col2a1、acan、runx2、sox9)标志物，结果也表明sm-mscs在体外具备更强的成软骨分化能力(图8b)。上述证据表明体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)相较于bmscs在体外有着优越的成骨成软骨能力。另外，体外荧光定量pcr检测到sm-mscs相较于bmscs表达更多的造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)(图8c)，且具有统计学差异。同时体外造血的支持能力检测显示与sm-mscs共培养的cd34 hsc维持阳性的比例显着高于bmscs和对照组(图8d)。cfu分析也表明sm-mscs产生了最多数
量的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(cfu-gm)、爆式红系集落形成单位(bfu-e)(图8e)。
[0171]
上述证据表明sm-mscs相较于bmscs在体外具备更强的成骨、成软骨分化能力，同时表达更高的造血支持基因，能更好的维持cd34 hscs的表达以及更优的促造血干细胞体外克隆形成及增殖能力。
[0172]
图9为实施例3中分别在不同骨髓基质细胞培养液(sm-mscsmedium、stemfit、acf)中制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞，进一步比较在体外成骨、成软骨及造血支持能力。包括荧光定量pcr检测成骨(col1a1、alp、con和opn)及成软骨(col2a1、acan、runx2和sox9)基因表达量(图9a)、实时荧光定量pcr检测造血支持基因(vcam1、cxcl12、mcp1、kitlg、flt3l、angpt1)表达(图9b)。
[0173]
结果表明实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)诱导获得的骨髓基质细胞具有更好的成骨、成软骨(图9a)和造血支持(图9b)能力，有显著统计学差异。
[0174]
上述图7和图9证据表明本发明中所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)不但能稳定、高效诱导及扩增骨髓基质细胞，且获得的骨髓基质细胞具有更好的成骨、成软骨和造血支持能力。因此，本发明中所述骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-msc medium)在诱导多能干细胞来源骨髓基质细胞中有一定的优势。
[0175]
实施例5体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells,sm-mscs)的体内成骨及造血支持能力检测
[0176]
一、实验方法
[0177]
本实施例中使用的是实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞及对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞。并且均使用市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)作为骨髓基质细胞培养液培养得到。
[0178]
(1)样品准备：选用实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)，以对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)作为对照。两组细胞同时制成2
×
107cells/ml细胞悬，各吸取50μl细胞悬液充分混合到预先用50μl成软骨诱导液浸泡过夜的30mg羟基磷灰石支撑材料中，稍松管盖，置于37℃，5％co2孵箱中进行孵育约2h后一起包埋入免疫缺陷鼠皮下。
[0179]
(2)体内移植：利用1％戊巴比妥按每只免疫缺陷鼠50mg/kg的使用量进行腹腔麻醉，每组各5只。待麻醉成功后，碘酒消毒皮肤表面，在最上方背右侧部位用剪刀剪出长约1cm的伤口，用分离钳钝性分离伤口，向伤口左侧进行加深，将bmscs组细胞与材料一起分次送入颈左侧，之后对伤口进行缝合，消毒。而后在腹右侧同样剪约1cm的伤口，将sm-mscs组细胞与材料一起送至腹右侧部位，缝合，消毒伤口。待其清醒后，放入鼠笼。随后每日观察小鼠状态，常规饲养8周。
[0180]
(3)8周后收取样品：(a)收取标本固定、脱钙并对切片进行masson染色及免疫荧光染色，对比sm-mscs与bmscs的体内骨形成能力；(b)固定、脱钙并对切片进行he染色后拍照并统计形成的造血细胞簇数目，并对cd45 造血祖细胞进行免疫荧光染色，对比sm-mscs与bmscs的体内造血支持能力。
[0181]
二、实验结果
[0182]
图10为实施例3诱导得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞(sm-mscs)与对照例1中
的骨髓间充质干细胞(bmscs)比较在体内成骨及造血支持的能力，包括成骨能力检测masson染色图及其统计图(图10a)、成骨标志物(ocn、opg)免疫荧光染色图(图10b)、he染色后造血细胞簇图及其数目统计图(图10c)、cd45 造血祖细胞免疫荧光染色(图10d)。
[0183]
结果表明实施例3制备得到的体壁中胚层来源骨髓基质细胞(sm-mscs)相较于对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)在免疫缺陷鼠体内有更强的成骨能力，具体表现为masson染色着色更深且范围更广，同时免疫荧光染色检测到更多的骨保护素(opg)和骨钙素(ocn)阳性细胞。另外，实施例3诱导得到的sm-mscs也能在免疫缺陷鼠皮下移植部位支持更多的造血细胞簇形成以及存在更多cd45 造血祖细胞。
[0184]
上述证据表明本发明诱导的体壁中胚层来源骨髓基质细胞(sm-mscs)相较于成体长骨骨髓中直接分离得到骨髓间充质干细胞(bmscs)在体内具有更强的骨形成能力及更优越的造血支持能力。
[0185]
实施例6体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞somatic mesoderm derived marrow stromal cells,sm-mscs)的测序分析
[0186]
一、实验方法
[0187]
本实施例中使用的是实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞及对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞。并且均使用市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)作为骨髓基质细胞培养液培养得到。
[0188]
(1)样品准备：收取实施例3制备得到的体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞(sm-mscs)，以对照例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)作为对照按qiagen公司生产的rna提取试剂盒的操作步骤提取其总rna，完成其总rna的完整性评价后进行下一步操作；
[0189]
(2)建库：利用illumina提供的试剂，按照相应的操作步骤，从总rna中分离纯化mrna并将其逆转录成cdna，随后将修饰后的cdna片段进行pcr扩增，纯化和富集，从而建立cdna文库。
[0190]
(3)测序并分析：利用建立的cdna文库，通过ga高通量测序仪(illumina，san diego，usa)进行rna测序检测并分析基因表达谱。
[0191]
二、实验结果
[0192]
图11为通过rna-seq对实施例3诱导得到的不同批次体壁中胚层中的两批次(sms 1、sms 2)及其来源骨髓基质细胞中的两批次(sm-mscs 1和sm-mscs 2)与对照例1中的中不同批次长骨骨髓直接分离的骨髓间充质干细胞中的两批次(bmscs 1和bmscs 2)进行基因表达谱进行分析，同一分化阶段不同批次的2个样本之间(sms 1 vs sms 2；sm-mscs 1 vs sm-mscs 2；bmscs 1 vs bmscs 2)的基因表达谱分析(图11a)，对sms 1、sms 2；sm-mscs 1、sm-mscs 2；bmscs 1、bmscs 2进行不同阶段基因表达分析(图11b)以及sm-mscs 1、sm-mscs 2与bmscs 1、bmscs 2的同源结构域转录因子(hox1-13)基因表达模式图(图11c)。
[0193]
结果表明，不同批次同一分化阶段的2个样本之间的基因表达谱具有高度的相似性(smcs1 vs smcs 2；sm-mscs 1 vs sm-mscs 2；bmscs 1 vs bmscs 2)，显示了本发明诱导方法的高重现性(图11a)。rna-seq基因表达谱分析出smcs高表达体壁中胚层标志，如pitx1、hand1、tbx4，而经体壁中胚层往后诱导的骨髓基质细胞表达模式则与bmscs相似，已不再表达体壁中胚层标志物pitx1、hand1、tbx4，而是表达，如cd44的骨髓基质细胞表面标志物(图11b)，另外sm-mscs与骨骼间充质细胞表达相似的同源结构域转录因子(hox9-13)
基因(图11c)。
[0194]
实施例7胚胎干细胞(human embryonic stem cells；h1-es)经体壁中胚层向骨髓基质细胞的诱导分化
[0195]
本实施例的目的在于说明在稳定建立并培养人胚胎干细胞系(h1-es)的基础上进行诱导分化操作。
[0196]
一、实验方法
[0197]
1、胚胎干细胞(human embryonic stem cells；h1-es)的培养
[0198]
胚胎干细胞(h1-es)通过商业化购买获得。h1-es细胞同样使用stem cell公司的mtesr培养液进行大规模扩增，维持其未分化状态。同时，需要在培养液质上包被基质胶，可以选择matrigel亦或是层粘连蛋白ln等。
[0199]
具体的操作步骤如下：
[0200]
(1)包被培养皿：冰上融解matrigel并用预冷的dmemf12按体积1：100的比例稀释matrigel原液后，加入孔板中室温包被过夜备用。
[0201]
(2)复苏胚胎干细胞(h1-es)：37℃水浴锅中快速解冻h1-es细胞，转移至含有5ml mtesr培养液的15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞。
[0202]
(3)吸去包被的matrigel或层粘连蛋白ln，以2ml mtesr重悬细胞，均匀接种细胞，放入37℃，5％co2孵箱中静置培养。
[0203]
(4)每天更换培养液一次，观察细胞维持未分化状态，继续培养直至h1-es细胞克隆生长至80～90％的密度，进行传代。
[0204]
(5)细胞传代：pbs洗涤细胞两次，加入relesr
tm
，于37℃孵育1至5min，弃去relesr
tm
，以1ml mtesr培养液轻轻吹打细胞至大小合适的细胞团块。
[0205]
(6)收集mtesr重悬细胞，并以每孔100μl体积均匀地将细胞接种入事先铺有matrigel的孔板中，放入37℃，5％co2孵箱中静置贴壁培养。
[0206]
(7)重复上述培养扩增步骤，以便获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
[0207]
2胚胎干细胞(h1-es)来源体壁中胚层细胞(somatic mesoderm cells，smcs)的诱导分化及鉴定
[0208]
(1)待细胞长至80～90％的密度时，利用pbs洗涤细胞两次，加入500μl的accutase于37℃孵育4min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去accutase，以pbs轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀。
[0209]
(2)将细胞转移入15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞。
[0210]
(3)用含有3μm chir99021的dmem-f12培养液重悬细胞团，以1
×
104/cm2的细胞密度均匀地将细胞接种入事先包被好matrigel的孔板或培养皿中，放入37℃，5％co2孵箱中静置培养。
[0211]
(4)培养2天后，诱导得到中内胚层细胞。
[0212]
(5)之后，更换为实施例1的培养液诱导培养5～7天，将中内胚层细胞诱导为体壁中胚层细胞，期间每天换液。
[0213]
2、胚胎干细胞(h1-es)来源体壁中胚层细胞向骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells,sm-mscs)的诱导分化及鉴定
[0214]
将上步中通过胚胎干细胞(h1-es)诱导获得的体壁中胚层细胞利用骨髓基质细胞
培养液进一步诱导为骨髓基质细胞，其中骨髓基质细胞培养液为：实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)、或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)或市售商业化msc培养液(acf；stem celltechnologies)。
[0215]
具体的操作步骤如下：
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(1)将上步诱导的体壁中胚层细胞培养液更换为骨髓基质细胞培养液，并于37℃，5％co2孵箱中静置培养，间隔每2～3天换液一次。
[0217]
(2)细胞生长至80～90％融合后，利用accutase消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞，弃上清后将细胞按1:3比例接种入新的培养皿中，完成细胞传代6～8次。
[0218]
(3)重复步骤2，在连续传代培养6～8次后，取部分细胞流式检测细胞表面分子cd34、cd45、cd44、cd90和cd140b的表达情况。当细胞表达骨髓基质细胞标志物cd44、cd90和cd140b，而不表达造血干细胞标志物cd34和cd45时，即得到体壁中胚层细胞来源骨髓基质细胞的表面标志物。
[0219]
3、胚胎干细胞(h1-es)诱导的经体壁中胚层细胞得到的骨髓基质细胞(somatic mesoderm derived marrow stromal cells,sm-mscs)体内成及造血支持能力检测
[0220]
本步骤中使用的是实施例7制备得到的胚胎干细胞(h1-es)诱导的经体壁中胚层细胞得到的骨髓基质细胞(sm-mscs)及对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞(bmscs)。并且均以实施例2中的骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)作为骨髓基质细胞培养液培养得到。
[0221]
(1)样品准备：选用本实施例7中人胚胎干细胞(h1-es)诱导的经体壁中胚层细胞得到的骨髓基质细胞(sm-mscs)，并以对照例1中分离得到的骨髓间充质干细胞(bmscs)作为对照。两组细胞同时制成2
×
107cells/ml细胞悬，各吸取50μl细胞悬液充分混合到预先用50μl成软骨诱导液浸泡过夜的30mg羟基磷灰石支撑材料中，稍松管盖，置于37℃，5％co2孵箱中进行孵育约2h后一起包埋入免疫缺陷鼠皮下。
[0222]
(2)体内移植：利用1％戊巴比妥按每只免疫缺陷鼠50mg/kg的使用量进行腹腔麻醉，每组各5只。待麻醉成功后，碘酒消毒皮肤表面，在最上方背右侧部位用剪刀剪出长约1cm的伤口，用分离钳钝性分离伤口，向伤口左侧进行加深，将bmscs组细胞与材料一起分次送入颈左侧，之后对伤口进行缝合，消毒。而后在腹右侧同样剪约1cm的伤口，将sm-mscs组细胞与材料一起送至腹右侧部位，缝合，消毒伤口。待其清醒后，放入鼠笼。随后每日观察小鼠状态，常规饲养8周。
[0223]
(3)8周后收取样品：(a)收取标本固定、脱钙并对切片进行masson染色及免疫荧光染色，对比sm-mscs与bmscs的体内骨形成能力；(b)固定、脱钙，并对切片进行he染色后拍照并统计形成的造血细胞簇数目，并对cd45 造血祖细胞进行免疫荧光染色，对比sm-mscs与bmscs的体内造血支持能力。
[0224]
二、实验结果
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图12为本实施例7中利用骨髓基质细胞培养液(市售商业化msc培养液(stemfit))制备得到的胚胎干细胞(h1-es)来源骨髓基质细胞流式检测表面标志物图(图12a)，形态图及体外成骨成软骨检测图(图12b)，及利用骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)制备得到的胚胎干细胞(h1-es)来源骨髓基质细胞与相应培养基培养得到的对照
例1中的骨髓间充质干细胞(bmscs)进行比较在免疫缺陷鼠体内骨形成(图12c)及造血支持能力检测图(图12d)。
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结果表明本实施例人胚胎干细胞(h1-es)诱导的经体壁中胚层细胞得到的骨髓基质细胞(sm-mscs)形态与骨髓基质细胞类似，表现贴壁生长及典型的纤维状，表达骨髓基质细胞标志物cd44、cd90、cd140b，不表达造血干细胞的表面标志cd34、cd45；茜素红s染色显示其诱导的成骨细胞着色呈现深红色，甲苯胺蓝染色显示诱导的软骨细胞呈紫蓝色，生成的软骨基质丰富。
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另外免疫缺陷鼠体内移植实验表明本实施例7中利用骨髓基质细胞无血清完全培养液(sm-mscs medium)制备得到的胚胎干细胞(h1-es)诱导的经体壁中胚层细胞的骨髓基质细胞(sm-mscs)同样具有良好的功能特性，其相较于相同骨髓基质细胞培养液培养的成体长骨骨髓直接分离的骨髓间充质干细胞(bmscs)在免疫缺陷鼠体内具有更强的骨形成能力(图12c)及更优越的造血支持能力(图12d)。
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最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。