一种发酵酸菜用的复合乳酸菌及其制备方法和应用与流程

23185)，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，cicc 6243)；（2）培养基采用mrs；mrs培养基成分为本行业技术人员公知内容，可通过一般手段获得。mrs固体培养基分装到试管中，每个试管中分装3 ml；mrs液体培养基分装到250 ml锥形瓶和2l无菌容器中，250 ml锥形瓶每瓶分装200ml，2l无菌容器分装1800ml，高压蒸汽灭菌，121℃，灭菌15min，备用；（3）活化菌种：分别将四种乳酸菌菌种按穿刺法进行菌种活化，接种到试管内的固体培养基上，25～37℃恒温培养1～3天；活化后菌体培养基上的乳酸菌菌种转接至mrs液体培养基中培养，25～37℃恒温培养1～3天，使每个乳酸菌菌种的液体培养基中的活菌数达到0.8
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9 cfu/ml ～1.0
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109cfu/ml；（4）菌种菌液扩大培养：分别将每个菌种活化菌液按1～5%（v/v）的用量比转接至对应的容器内，容器内含有60～80%体积的mrs液体培养基，20～37℃ 恒温培养1～3天，分别得到4个乳酸菌菌液备用；（5）将步骤（4）中培养得到的4个乳酸菌菌液按体积计配比，副干酪乳杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌=(2～6)：(1～5)：(1～3)：(1～4)的比例，混合均匀，即可得到发酵酸菜用的复合乳酸菌。
9.本发明的另一目的在于提供所述的发酵酸菜用的复合乳酸菌在发酵酸菜中的应用。
10.进一步的，采用所述的复合乳酸菌用于酸菜的发酵，具体发酵方法包含以下步骤：（1）将蔬菜进行清洗、除杂、沥干后，装入缸中；（2）将灭菌自来水灌入装有蔬菜的缸中，使水面与蔬菜表面齐平，并添加氯化钙，每公斤腌制菜加入的4g～10g氯化钙；（3）加入复合乳酸菌，每公斤蔬菜添加复合乳酸菌菌液20～40ml，再加灭菌水使水面高于蔬菜表面10～15cm；于0～35℃下进行密封发酵，发酵2～8天后即可食用。
11.上述的发酵酸菜用的复合乳酸菌在发酵酸菜中的应用，所述的复合乳酸菌用于酸菜的发酵工艺中，该工艺不添加任何外源性盐，原料蔬菜亦不需要添加任何外源性盐。
12.本发明的有益效果为：1、本发明所提供的发酵酸菜用的复合乳酸菌菌液具有活力高、发酵启动速度快，温度适应性宽的特点，酸菜发酵液中活菌数不少于0.8
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9 cfu/ml，发酵时间比传统做法缩短50%以上，四季均可进行发酵生产。
13.2、本发明所提供的复合乳酸菌菌液发酵剂用于发酵酸菜，在发酵过程中可降低酸菜发酵环境ph值，能有效抑制酵母菌及有害菌的繁殖，从而防止酸菜腐败变质及酸菜异味的产生；发酵得到的终产品风味丰富，口感柔，较传统自然发酵的酸菜口味更佳。
14.3、将本发明所述的复合乳酸菌用于酸菜的发酵工艺中，无需添加食盐，终产品盐含量《1%。
15.4、本发明所提供的酸菜发酵工艺方法，使用复合乳酸菌菌液发酵，终产品亚硝酸盐含量显著降低，在酸菜发酵工艺中，添加氯化钙，ca 可在发酵过程中有效保持芥菜的鲜亮色泽和脆嫩的口感。
16.5、采用本发明所提供的复合乳酸菌及酸菜发酵方法，发酵得到的酸菜终产品感官品质较好，含盐量较低（低于0.3%），亚硝酸盐含量极低为0.39～0.67ug/ml，有机酸含量较
高为20.11～21.14mg/ml，发酵时间大大缩短，为2～8天；且终产品批次间稳定性显著提高。
17.6、采用本发明所提供的复合乳酸菌进行发酵酸菜，能够丰富发酵风味，缩短发酵时间，使发酵温度更广，培养成本更低，发酵稳定性更好，彻底解决传统发酵工艺中高剂量食用盐添加，高亚硝酸盐含量，终产品风味单一，风味淡，补充复合菌剂成本高，活菌数低，质量稳定性不佳等缺点。
附图说明
18.图1为采用本发明实施例2的方法发酵得到的酸菜产品图。
具体实施方式
19.下面通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不只限于这些例子。
20.实施例11、制备发酵酸菜用的复合乳酸菌，具体包括如下步骤：（1）所用菌种：副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei，cicc 20241)，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum， cicc 20242)，干酪乳杆菌(lactobacillus casei，cicc 23185)，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，cicc 6243)；菌种均购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
21.（2）培养基采用mrs；mrs培养基成分为本行业技术人员公知内容，可通过一般手段获得。mrs固体培养基分装到试管中，每个试管中分装3 ml；mrs液体培养基分装到250 ml锥形瓶和2l无菌容器中，250 ml锥形瓶每瓶分装200ml，2l无菌容器分装1800ml，高压蒸汽灭菌，121℃，灭菌15min，备用。
22.（3）活化菌种：分别将四种乳酸菌菌种按穿刺法进行菌种活化，接种到试管内的固体培养基上，25℃恒温培养3天；活化后菌体培养基上的乳酸菌菌种转接至250ml容器内的mrs液体培养基中培养，25℃恒温培养3天，使每个乳酸菌菌种的液体培养基中的活菌数达到0.8
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9 cfu/ml；（4）菌种菌液扩大培养：分别将每个菌种活化菌液按1%（v/v）的用量比转接至对应的容器内，容器内含有80%体积的mrs液体培养基，25℃ 恒温培养3天，分别得到4个乳酸菌菌液备用；（5）将步骤（4）中培养得到的4个乳酸菌菌液按体积计配比，副干酪乳杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌=6：1：1：4的比例，混合均匀，即可得到发酵酸菜用的复合乳酸菌。
23.2、采用上述制备得到的复合乳酸菌用于酸菜的发酵，具体发酵方法包含以下步骤：（1）将芥菜进行清洗、除杂、沥干后，装入缸中；（2）将灭菌自来水灌入装有芥菜的缸中，使水面与芥菜表面齐平，并添加氯化钙，每公斤腌制菜加入的4g氯化钙；（3）加入复合乳酸菌，每公斤芥菜添加复合乳酸菌菌液20ml，再加灭菌水使水面高于芥菜表面10cm；于20℃下进行密封发酵，发酵8天后即可食用。
24.实施例21、制备发酵酸菜用的复合乳酸菌，包括如下步骤：（1）所用菌种：副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei，cicc 20241)，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum， cicc 20242)，干酪乳杆菌(lactobacillus casei，cicc 23185)，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，cicc 6243)；菌种均购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
25.（2）培养基采用mrs；mrs培养基成分为本行业技术人员公知内容，可通过一般手段获得。mrs固体培养基分装到试管中，每个试管中分装3 ml；mrs液体培养基分装到250 ml锥形瓶和2l无菌容器中，250 ml锥形瓶每瓶分装200ml，2l无菌容器分装1800ml，高压蒸汽灭菌，121℃，灭菌15min，备用。
26.（3）活化菌种：分别将四种乳酸菌菌种按穿刺法进行菌种活化，接种到试管内的固体培养基上，30℃恒温培养2天；活化后菌体培养基上的乳酸菌菌种转接至250ml容器内的mrs液体培养基中培养，30℃恒温培养2天，使每个乳酸菌菌种的液体培养基中的活菌数达到0.9
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109cfu/ml；（4）菌种菌液扩大培养：分别将每个菌种活化菌液按3%（v/v）的用量比转接至对应的容器内，容器内含有70%体积的mrs液体培养基，30℃恒温培养2天，分别得到4个乳酸菌菌液备用；（5）将步骤（4）中培养得到的4个乳酸菌菌液按体积计配比，副干酪乳杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌=2：5：3：1的比例，混合均匀，即可得到发酵酸菜用的复合乳酸菌。
27.2、采用上述制备得到的复合乳酸菌用于酸菜的发酵，具体发酵方法包含以下步骤：（1）将芥菜进行清洗、除杂、沥干后，装入缸中；（2）将灭菌自来水灌入装有芥菜的缸中，使水面与芥菜表面齐平，并添加氯化钙，每公斤腌制菜加入的7g氯化钙；（3）加入复合乳酸菌，每公斤芥菜添加复合乳酸菌菌液30ml，再加灭菌水使水面高于芥菜表面12cm；于30℃下进行密封发酵，发酵4天后即可食用。
28.实施例31、制备发酵酸菜用的复合乳酸菌，包括如下步骤：（1）所用菌种：副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei，cicc 20241)，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum， cicc 20242)，干酪乳杆菌(lactobacillus casei，cicc 23185)，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，cicc 6243)；菌种均购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
29.（2）培养基采用mrs；mrs培养基成分为本行业技术人员公知内容，可通过一般手段获得。mrs固体培养基分装到试管中，每个试管中分装3 ml；mrs液体培养基分装到250 ml锥形瓶和2l无菌容器中，250 ml锥形瓶每瓶分装200ml，2l无菌容器分装1800ml，高压蒸汽灭菌，121℃，灭菌15min，备用。
30.（3）活化菌种：分别将四种乳酸菌菌种按穿刺法进行菌种活化，接种到试管内的固体培养基上，35℃恒温培养1天；活化后菌体培养基上的乳酸菌菌种转接至250ml容器内的
mrs液体培养基中培养，35℃恒温培养1天，使每个乳酸菌菌种的液体培养基中的活菌数达到1.0
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109cfu/ml；（4）菌种菌液扩大培养：分别将每个菌种活化菌液按5%（v/v）的用量比转接至对应的容器内，容器内含有60%体积的mrs液体培养基，37℃ 恒温培养1天，分别得到4个乳酸菌菌液备用；（5）将步骤（4）中培养得到的4个乳酸菌菌液按体积计配比，副干酪乳杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌=4：3：2：3的比例，混合均匀，即可得到发酵酸菜用的复合乳酸菌。
31.2、采用上述制备得到的复合乳酸菌用于酸菜的发酵，具体发酵方法包含以下步骤：（1）将芥菜进行清洗、除杂、沥干后，装入缸中；（2）将灭菌自来水灌入装有芥菜的缸中，使水面与芥菜表面齐平，并添加氯化钙，每公斤腌制菜加入的10g氯化钙；（3）加入复合乳酸菌，每公斤芥菜添加复合乳酸菌菌液40ml，再加灭菌水使水面高于芥菜表面15cm；于35℃下进行密封发酵，发酵2天后即可食用。
32.对比例1传统酸菜的发酵方法，包含以下步骤：（1）将芥菜进行清洗、除杂、沥干，（2）将芥菜装入缸内，按照每公斤芥菜使用 30g食盐，每装一层芥菜撒一层食盐，将芥菜压实，腌制10天，再进行脱盐处理，加水浸泡清新2～3次，沥干水分；（3）将灭菌自来水灌入装有芥菜的缸中，使水面与芥菜表面齐平，并添加氯化钙，每公斤腌制菜加入的7g氯化钙；（4）于35℃条件下进行发酵，20天后即可食用。
33.对比例21、单一菌种发酵液的制备方法：（1）选择副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei，cicc 20241)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，作为唯一发酵菌种。
34.（2）培养基采用mrs；mrs培养基成分为本行业技术人员公知内容，可通过一般手段获得。
35.（3）活化菌种：将副干酪乳杆菌菌种按穿刺法进行菌种活化，接种到试管内的固体培养基上，35℃恒温培养1天；活化后菌体培养基上的乳酸菌菌种转接至250ml容器内的mrs液体培养基中，35℃恒温培养1天，使每个乳酸菌菌种的液体培养基中的活菌数达到8.6
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108cfu/ml。
36.（4）菌种菌液扩大培养：分别将每个菌种活化菌液按5%（v/v）的用量比转接至对应的容器内，容器内含有60%体积的mrs，37℃ 恒温培养2天，得到单一乳酸菌菌液备用。
37.2、采用上述制备得到的单一乳酸菌菌液用于酸菜的发酵，具体发酵方法包含以下步骤：（1）将芥菜进行清洗、除杂、沥干后，装入缸中；（2）将灭菌自来水灌入装有芥菜的缸中，使水面与芥菜表面齐平，并添加氯化钙，
每公斤腌制菜加入的10g氯化钙；（3）加入单一乳酸菌菌液，每公斤芥菜添加单一乳酸菌菌液40ml，再加灭菌水使水面高于芥菜表面15cm；于35℃下进行密封发酵，发酵12天后即可食用。
38.对发酵过程参数如液体活菌数，发酵时间进行测定和记录，对发酵成品进行终产品含盐量，终产品含盐量，亚硝酸盐含量，总酸含量进行测定，并辅以感官评价。以色泽形态、气味、口感、滋味4个方面对酸菜制品进行感官评定。感官评定人员为25名食品专业从业人员，熟悉食品描述定语与食品评判标准。依据国家标准gb2714-2015《食品国家标准酱腌菜》制定评分标准如表1酸菜感官评分标准所示，最终评分为所有评分值的总和(100分)。
39.结果：见表2，本发明中提供的实施例通过多种复合菌种的复配实现提高发酵速度，增加发酵风味的功能。与对比例1，对比例2相比，复合菌种比自然发酵和单一菌种的的发酵，复合菌种的发酵活菌数更高，发酵时间更短，终产品感官评价更优，含盐量显著降低，亚硝酸盐含量更低，有机酸含量更高。这些参数表明采用本发明可以使复合菌种形成互补发酵优势，显著改善自然菌种或单一菌种发酵速度慢，发酵持续时间短等缺点。本发明经过多次探索，获得使复合菌种在酸菜发酵中能够良好共生的合适环境。
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