一种用于检测牛棒状杆菌的引物组合物及应用

1.本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种用于检测牛棒状杆菌的引物组合物及应用。


背景技术：

2.一些患病动物组织和分泌物、动物性产品、环境中采集的样本内含有牛棒状杆菌感染或污染；
3.牛棒状杆菌是一种革兰氏阳性小杆菌，条件性致病，世界范围内广泛分布，可感染多种动物，全球众多实验动物机构列为实验大、小鼠尤其是免疫缺陷鼠的重点监测病原体之一，也引起其他疾病，目前对于牛棒状杆菌监测技术较为缺乏，导致无法快速准确地检测出牛棒状杆菌，因此，本发明提出一种用于检测牛棒状杆菌的引物组合物以解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于提出一种用于检测牛棒状杆菌的引物组合物及应用，该用于检测牛棒状杆菌的引物组合物应用的试剂盒内的引物组合物可用于检测样本中是否含有牛棒状杆菌基因，灵敏度好、特异性高，可准确定量的测量出牛棒状杆菌的基因，检测时间短，为牛棒状杆菌的监测提供技术支持。
5.为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种用于牛棒状杆菌检测的试剂盒在环介导等温扩增方法中检测牛棒状杆菌基因的应用。
6.进一步改进在于：所述试剂盒内包括引物组合物，所述引物组合物包括外引物、内引物和环引物，所述外引物包括引物f3和引物b3，所述内引物包括引物fip和引物bip，所述环引物包括引物lf和引物lb。
7.进一步改进在于：在所述环介导等温扩增方法中检测牛棒状杆菌基因的应用，试剂盒中引物组合物引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb的摩尔浓度比为1:1:4:4:2:2。
8.进一步改进在于：所述引物f3的序列如seq id no：1所示，所述引物b3的序列如seq id no：2所示，所述引物fip的序列如seq id no：3所示，所述引物bip的序列如seq id no：4所示，所述引物lf的序列如seq id no：5所示，所述引物lb的序列如seq id no：6所示。
9.一种用于牛棒状杆菌检测的试剂盒在环介导等温扩增方法中检测牛棒状杆菌基因的应用，检测步骤具体为：
10.步骤一、提取待测菌质粒dna；
11.步骤二、以步骤一中提取的基因为模板，采用试剂盒内的引物组合物进行对16s基因的环介导等温扩增。
12.进一步改进在于：在所述环介导等温扩增方法中检测牛棒状杆菌基因的应用，环介导等温扩增反应条件为60-65℃恒温保持60min。
13.本发明的有益效果为：本发明试剂盒内的引物组合物可用于检测样本中是否含有牛棒状杆菌基因，灵敏度好、特异性高，可准确定量的测量出牛棒状杆菌的基因，检测时间短，为牛棒状杆菌的监测提供技术支持。
附图说明
14.图1为本发明实施例二含牛棒状杆菌16s基因典型荧光曲线图。
15.图2为本发明实施例二不含牛棒状杆菌16s基因样品典型荧光曲线图。
具体实施方式
16.为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
17.实施例一
18.本实施例提供了一种用于牛棒状杆菌检测的试剂盒，试剂盒组成：
19.反应液a：2
×
等温反应混合液，内含bst dna聚合酶，荧光染料，2mm dntp等
20.反应液b:mgso4(50mm)
21.反应液c:bst dna聚合酶(8u/ul)
22.各引物的dna序列和浓度如下：
23.引物f3：caggtggtgcatggttgt
24.引物b3：cccactgtaccgaccattg
25.引物fip：caagacaagggttgcgctc-gtcagctcgtgtcgtgag
26.引物bip：cgagagactgccggggttaac-tgtgtgaagccctggacat
27.引物lf：tgcgggacttaacccaacat
28.引物lb：tcggaggaaggtgggga(t)(g)
29.引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb浓度分别为2um、2um、8um、8um、4um、4um。
30.荧光定量pcr反应管20ul反应体系：a液10ul，6种引物各1ul，样本dna 9ul。具体如下表所示
31.成份样品管空白对照反应液a(2
×
)10ul10ul引物f3终浓度0.2um0.2um引物b3终浓度0.2um0.2um引物fip终浓度0.8um0.8um引物bip终浓度0.8um0.8um引物lf终浓度0.4um0.4um引物lb终浓度0.4um0.4um反应液b1ul1ul模板dna稀释液1-100ng不加反应液c1ul1ul补水到20ul20ul
32.反应条件：65℃恒温水浴箱中放置70min。pcr仪实时检测反应结果。
33.实施例二
34.根据附图1和附图2所示，本实施例提供了一种用于牛棒状杆菌检测的试剂盒，试剂盒组成：
35.反应液a：2
×
等温反应混合液，内含bst dna聚合酶，sybr green1荧光染料，2mm dntp等
36.反应液b:mgso4(50mm)
37.反应液c:bst dna聚合酶(8u/ul)
38.各引物的dna序列和浓度如下：
39.引物f3
′
：ttgggttaagtcccgcaac
40.引物b3
′
：gattagctgagcctcgcg
41.引物fip
′
：ccgagttaaccccggcagtct-gagcgcaacccttgtctt
42.引物bip
′
：aggaaggtggggatgacgtca-acccactgtaccgaccat
43.引物lf
′
：ccattacgtgctggcaacac
44.引物lb
′
：aatcatcatgccccttatgtccagg
45.引物f3
′
、引物b3
′
、引物fip
′
、引物bip
′
、引物lf
′
和引物lb
′
浓度分别为2um、2um、8um、8um、4um、4um。
46.荧光定量pcr反应管20ul反应体系：a液10ul，6种引物各1ul，样本dna 9ul。具体如下表所示
47.[0048][0049]
反应条件：65℃恒温水浴箱中放置70min。pcr仪实时检测反应结果。
[0050]
用于检测牛棒状杆菌16s基因检测
[0051]
样本dna基因组，样本为粪便、血液、分泌物，牛乳等，从所测样本中提取dna，调节dna浓度为100ng/ul。
[0052]
反应结果空白对照组为非s型扩增曲线，如说明书附图2所示，阳性样品可以扩增类似s曲线，如说明书附图1所示。
[0053]
实施例三
[0054]
利用人工合成牛棒状杆菌16s基因检测试剂盒检测牛棒状杆菌16s基因
[0055]
待测样本基因制备：以分离纯培养细菌为例。
[0056]
用培养基培养牛棒状杆菌，提取培养菌基因组dna。
[0057]
反应体系同实施例1。
[0058]
结果显示，用含有培养基培养牛棒状杆菌提取的基因组稀释液，反应曲线为s型。
[0059]
结果显示，用lb培养基培养大肠杆菌提取的基因和空白对照组为非s型扩增曲线。
[0060]
实施例四
[0061]
利用人工合成牛棒状杆菌16s基因检测试剂盒检测牛棒状杆菌16s基因
[0062]
待测样本基因制备：以分离纯培养细菌为例。
[0063]
用培养基培养牛棒状杆菌，提取培养菌基因组dna。
[0064]
反应体系同实施例2。
[0065]
结果显示，用含有培养基培养牛棒状杆菌提取的基因组稀释液，反应曲线为s型。
[0066]
结果显示，用lb
′
培养基培养大肠杆菌提取的基因和空白对照组为非s型扩增曲线。
[0067]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。