一种脑炎联检试剂的制作方法

1.本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种脑炎联检试剂。


背景技术：

2.自身免疫性脑炎（autoimmune encephalitis，ae）泛指一类由自身免疫机制介导的脑炎。ae为罕见疾病，估计每百万人口的年发病率为1-5例，其中，非裔美国人的发病率高于白种人。目前ae患病比例占脑炎病例的10%～20%，以抗n-甲基-d-天冬氨酸受体（nmdar）抗体脑炎最常见，约占ae患者的80%；之后在自身免疫性脑炎患者中检出抗富含亮氨酸的神经胶质瘤失活蛋白-1（lgi1）、γ氨基丁酸a型受体（gabarb1/b2）、α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体1（ampar1）、α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体2（ampar2）、接触蛋白相关蛋白2（caspr2）、二缩氨酸相似蛋白6（dppx）、iglon家族蛋白5（iglon5）等抗体。
3.ae强调早诊断早治疗，缩短病程，从而改善认知及临床结局，但由于其病因复杂，症状特异性不高，在诊断上存在较多的困难，其相关抗体包括抗细胞内抗原和抗细胞表面抗原两类，特异性很高；部分抗体对体内潜在肿瘤的发生有很强的提示作用，并且可帮助判断治疗和预后，因此，ae相关抗体的实验室检查对ae的诊治具有重要作用。如果抗nmdar脑炎初始抗体检测可能为阴性，若临床高度怀疑可进行复查。
4.目前报道抗nmdar抗体、抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体检测时采用单色荧光，单色荧光在检测时容易导致假阳性，降低了检测的准确性。


技术实现要素：

5.为解决上述检测中存在的问题，提高自身免疫性脑炎抗体检测的准确性，本发明提供了一种脑炎联检试剂。通过不同色系的荧光及荧光组合，判定不同色系的荧光斑点是否叠加以及荧光特征是否一致，应用于判定样本中是否含有目标抗体，从而提高了抗体检测的准确性，同时可对抗nmdar抗体、抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体进行定性或半定量。
6.一种脑炎联检试剂，该试剂包括孔板试剂、荧光标记的二抗、磷酸盐缓冲液，其特征在于所述的孔板试剂包括表达标记荧光蛋白的nmdar、lgi1、gabarb1/b2、ampar1、ampar2、caspr2转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；荧光标记的二抗与表达荧光蛋白的转染细胞中的所述的荧光为不同色系的荧光。
7.进一步的，所述的表达标记荧光蛋白的nmdar、lgi1、gabarb1/b2、ampar1、ampar2、caspr2转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞分别固定在孔板上不同的加样孔内。
8.进一步的，所述的荧光标记的二抗选自山羊抗人igg、小鼠抗人igg、兔抗人igg、驴抗人igg、马抗人igg或鸡抗人igg。
9.进一步的，所述的荧光标记的二抗中的使用的荧光物选自异硫氰酸荧光素、罗丹
明、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、texas red、藻红蛋白、碘化丙啶、alexa fluor系列、dylight系列、ifluor系列、pe或cy系列。
10.一种脑炎联检试剂的制备方法包括：1）在孔板上的加样孔内分别培养表达标记荧光蛋白的nmdar、lgi1、gabarb1/b2、ampar1、ampar2、caspr2转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；2）将培养好的细胞去除培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗；3）加入固定液将细胞固定；4）将固定好的细胞使用封闭液封闭，干燥。
11.进一步的，所述的荧光蛋白选自红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。
12.进一步的，所述的固定液选自醛类、甲醇、乙醇、丙酮、四氧化锇、苦味酸、氯仿、铬酸、升汞、重铬酸中的一种或或多种制备成的溶液。
13.进一步的，所述的封闭液选自聚乙二醇类、bsa、slowfade diamond、slowfade gold、甘油、石蜡、明胶、芦荟凝胶、防淬灭剂、矿物油中的一种或多种。
14.一种脑炎联检试剂的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：1）准备血清、血浆或脑脊液样本，取稀释后样本加入孔板上的加样孔内；2）37℃温育或者4℃过夜；3）用pbs洗涤；4）将pbs充分沥干，取荧光标记二抗加入孔板上的加样孔内，37℃温育；5）用pbs洗涤；6）向加样孔内加入pbs；7）将孔板置于荧光显微镜下镜检。
15.进一步的，利用荧光显微镜观察荧光斑点及荧光斑点组合，通过判定荧光斑点的位置能否重叠以及荧光特征是否一致，判定样本中是否含有抗nmdar抗体、抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体，通过样本的稀释倍数及斑点的强度，对样本中目标抗体进行半定量检测，为临床判断自身免疫性脑炎患者的严重程度提供依据。
16.进一步的，孔板试剂还可以包括表达标记荧光蛋白的dppx、iglon5、gad65、glyr1、drd2、mglur1、mglur5、gabaarα1、gabaarβ3、neurexin3α、vgkc中的一种或多种的转染细胞，所述的转染细胞分别固定在孔板上不同的加样孔内。
17.进一步的，检测试剂为孔板形式，孔板上的加样孔为固定式或可拆卸式的，可根据样本的数量多少选择不同的孔板进行检测。
18.例如，所述的红色荧光蛋白选自mcherry、mbanana、morange、dtomato、mtangerine、或mstrawberry。
19.本发明提供了一种双荧光定位测定作为自身免疫性脑炎抗体的定量或定性分析法的用于自身免疫性脑炎的诊断方法。
20.本发明使用的双荧光为不同色系，以便利用荧光判读设备或肉眼识别时能够准确区别蛋白荧光和标记荧光的色系。
21.本发明检测试剂，在进行判定荧光位置和强度时，可采用荧光判读设备，也可以采
用肉眼识别，在进行定量检测时，优选采用荧光判读设备判读。
22.本发明使用的细胞选自hek293t细胞，可留种保存。
23.本发明至少具有以下有益效果：1）通过本发明制备抗体检测试剂能够同时检测样本中的多种自身抗体。该检测试剂的特异性强、灵敏度高、实验结果重复性好，能够进行推广应用，在临床上具有极其重要的意义。2）此外，本发明针对现有技术在荧光信号较低的情况下容易导致误判的问题，本发明通过将细胞表达荧光蛋白，再加入荧光标记的二抗，通过观察不同色系发出的荧光细胞的位置能否重叠以及荧光特征，从而降低在荧光信号较低的情况仅通过一种荧光下容易导致误判的问题。3）同一个孔板可以进行多指标的检测联合检测，提高了结果的准确性，节省检测时间。
附图说明
24.图1-图2：样本用脑炎联检试剂检测在显微镜下荧光图（样本中含有抗nmdar抗体）图3-图4：样本用脑炎联检试剂检测在显微镜下荧光图（样本中不含有抗nmdar抗体）
具体实施方式
25.本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
26.本发明实施例通过制备脑炎联检试剂，以及利用该检测试剂检测样本中多种抗体，分别包括抗nmdar抗体、抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体，从而判定样本中是否含有相关抗体，为临床医生诊断自身免疫性脑炎患者严重程度提供依据。
27.其中实施例中采用红色色系的荧光和绿色色系的荧光，其中所述的mcherry发出红色荧光，dylight 488发出绿色荧光。选择不同色系荧光物时保证二者荧光色差肉眼容易区别开即可。
28.实施例1：脑炎联检试剂的制备一种脑炎联检试剂，该试剂包括孔板试剂、dylight 488标记的山羊抗人二抗、磷酸盐缓冲液；其中孔板为96孔板，孔板试剂包括表达标记mcherry荧光蛋白的nmdar、lgi1、gabarb1/b2、ampar1、ampar2、caspr2转染细胞和表达mcherry标记荧光蛋白的空白载体转染细胞，转染细胞在不同的加样孔内。
29.1）在96孔板上的加样孔内分别培养表达标记mcherry（红色荧光蛋白）的nmdar、lgi1、gabarb1/b2、ampar1、ampar2、caspr2转染细胞和表达标记mcherry的空白载体转染细胞，在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞涨至近100%；2）去除培养基，使用1
×
pbs清洗；3）加入50
µ
l的4%多聚甲醛（固定液）将细胞固定60min，弃去固定液，加入50
µ
l的1
×
pbs洗涤2次；4）加入50
µ
l的5%bsa（封闭液）封闭20min，弃去封闭液，加入50
µ
l的1
×
pbs洗涤2
次，干燥。
30.实施例2：脑炎联检试剂用于脑脊液的检测实施例1中制备得到的试剂用于抗nmdar抗体、抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体检测的方法如下：1）准备脑脊液样本，取稀释后脑脊液30
µ
l-50
µ
l加入96孔板上的加样孔内；2）37℃温育1小时或者4℃过夜；3）1
×
pbs洗涤3次，每次3分钟；4）将1
×
pbs充分沥干，取30
µ
l-50
µ
l荧光dylight 488标记的山羊抗人二抗加入孔板上的加样孔内，37℃温育30分钟；5）1
×
pbs洗涤3次，每次3分钟；6）向加样孔内加入30
µ
l-50
µ
l的1
×
pbs；7）将孔板置于荧光显微镜下镜检。
31.实施例3：应用荧光显微镜判读样本中抗nmdar抗体实施例2处理的孔板的判读方法如下：1）利用荧光显微镜分别在518nm波长、610nm波长下观察发出的荧光斑点，通过观察是否发出绿色荧光斑点或红色荧光斑点；2）将发出绿色荧光斑点的位置、特征与发出红色荧光斑点的位置进行比对是否重叠；3）如果发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置能够重叠，并且特征基本一致，可以判定样本中含有抗nmdar抗体；4）如果不能发出绿色荧光斑点；或发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置不能重叠；或发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置能够重叠，但是特征差别较大；可以判定样本中不含有抗nmdar抗体。
32.图1红色荧光斑点与图2绿色荧光斑点的位置重叠而且特征基本一致，说明样本中含有抗nmdar抗体；图3红色荧光斑点的位置在图4中没有荧光斑点，说明样本中不含有抗nmdar抗体。
33.同理可以应用荧光显微镜判读脑脊液中抗lgi1抗体、抗gabarb1/b2抗体、抗ampar1抗体、抗ampar2抗体、抗caspr2抗体。
34.本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本发明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
35.此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对本发明进行修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。