长循环阳离子脂质体的合成方法与流程

1.本发明涉及长循环阳离子脂质体的合成，属于有机化学合成和医药技术领域。


背景技术：

2.核酸等基因药物由于其自身优点，最近被广泛开发出来。但是由于核酸本身结构不稳定，易降解，且带较强的负电荷，难以进入细胞等缺点，都限制了核酸应用。所以核酸有效的递送已成为核酸应用的主要挑战之一。目前，研究和临床应用中常用的核酸递送载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体药效虽高，但是毒性较大，所以非病毒载体，特别是脂质纳米球技术逐渐成为核酸递送主要方式。
3.常用的脂质纳米球为阳离子脂质复合物，但是阳离子脂质纳米复合物由于表面带有正电荷，易于与血浆中的血清蛋白产生非特异性吸附，形成大尺寸的聚集体，该聚集体易被网状内皮系统清除，导致其血液循环时间短，稳定性差，运转效率低。为此，需要对阳离子脂质体进行表面修饰，制备长循环阳离子脂质体。目前常用的长循环阳离子脂质体修饰试剂为基于聚乙二醇(peg)的脂质分子，例如如下文中式e所示的化合物，如1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(dmg-peg2000，如下文中式6所示)分子。peg通过氢键和溶剂中的水分子作用，在被修饰的阳离子脂质体表面形成一层水合层，掩盖阳离子脂质体表面正电荷，从而达到抑制蛋白质吸附并减少吞噬系统识别的作用。
4.然而，这类长循环阳离子脂质体的合成十分困难，目前尚未有任何成功率高(更不用说具有高产率)的合成方法的报道。因此，本领域迫切地需要开始一种新的合成长循环阳离子脂质体(如dmg-peg2000)的方法。


技术实现要素：

5.本发明提供一种用于合成式e化合物的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
[0006][0007]
其特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0008]
步骤1：氮气保护下，将式a化合物与式b化合物在碱存在的条件下反应，得到式c化合物；
[0009]
步骤2：式c化合物在酸存在的条件下，开环得到式d化合物；
[0010]
步骤3：向式d化合物中加入式c
nh(2n 1)
cooh的酸和酯缩合剂，得到式e化合物
[0011][0012]
其中，
[0013]
m为20-150的整数，优选40-50的整数，
[0014]
n为10-20的整数，
[0015]
x为氯或溴。
[0016]
在一个实施方案中，所述步骤1中的所述碱为氢化钠、二异丙基乙胺或氢氧化钠。
[0017]
在一个实施方案中，所述步骤1中的所述碱为氢化钠。
[0018]
在一个实施方案中，所述式a化合物和所述式b化合物的摩尔比为1：2～1:8。
[0019]
在一个实施方案中，所述式a化合物和所述式b化合物的摩尔比为1：2～1：4。
[0020]
在一个实施方案中，所述步骤1的反应温度为25℃～65℃。
[0021]
在一个实施方案中，所述步骤1的反应温度为25℃～45℃。
[0022]
在一个实施方案中，所述步骤1中所述式a化合物和所述式b化合物在溶剂中反应，所述溶剂为四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、甲苯或n,n-二甲基甲酰胺。
[0023]
在一个实施方案中，所述步骤1的反应时间为0.5小时～48小时。
[0024]
在一个实施方案中，所述步骤1的反应时间为16～24小时。
[0025]
在一个实施方案中，所述步骤2中的酸为高氯酸、硫酸或甲酸。
[0026]
在一个实施方案中，所述步骤2中的酸为高氯酸。
[0027]
在一个实施方案中，所述步骤2中的反应温度为40～100℃。
[0028]
在一个实施方案中，所述步骤2中的反应温度为90～100℃。
[0029]
在一个实施方案中，所述步骤2中的反应时间为1～48小时。
[0030]
在一个实施方案中，所述步骤2中的反应时间为6～20小时。
[0031]
在一个实施方案中，所述步骤3中，所述式d化合物和所述式c
nh(2n 1)
cooh的酸反应时，加入二异丙基二胺、三乙胺、吡啶或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯。
[0032]
在一个实施方案中，所述步骤3中，所述式d化合物和所述式c
nh(2n 1)
cooh的酸反应时，加入二异丙基二胺。
[0033]
在一个实施方案中，所述步骤3中的所述酯缩合剂为edci/dmap、edci/hobt、hobt/
hatu或dic/dmap。
[0034]
在一个实施方案中，所述步骤3中的所述酯缩合剂为edci/dmap。
[0035]
在一个实施方案中，所述步骤3中的所述式c
nh(2n 1)
cooh的酸和式d化合物的摩尔比为5：1～10：1。
[0036]
在一个实施方案中，所述步骤3中的反应温度为0～50℃。
[0037]
在一个实施方案中，m为42-46的整数(如44)，或20-25的整数(如22)，或100-120的整数(如110)。
[0038]
在一个实施方案中，n为11-17的整数。
[0039]
在一个实施方案中，n为11、13、15或17。
[0040]
在一个实施方案中，m＝44。
[0041]
在一个实施方案中，n＝13。
[0042]
在一个实施方案中，x为溴。
[0043]
在一个优选的实施方案中，m＝44，n＝13且x为溴。即，式a至式e分别对应于以下式1、2、3、5、6的化合物：
[0044][0045]
在一些优选实施方案中，m＝22、44或110，和/或n＝11、13、15或17。例如，在一个优选实施方案中，m＝44且n＝11；在一个优选实施方案中，m＝44且n＝15；在一个优选实施方案中，m＝44且n＝17；在一个优选实施方案中，m＝22且n＝13。
[0046]
[0047][0048]
本发明的合成方法合成步骤短、原料和试剂廉价易得、反应条件温和、操作工艺简便、转化率高，利于工业化生产，为长循环阳离子脂质体(如dmg-peg2000)的开发应用提供了基础。
附图说明
[0049]
图1为本发明一实施例的dmg-peg2000的核磁共振氢谱图；
[0050]
图2为本发明另一实施例的dmg-peg2000的核磁共振氢谱图(a)和质谱图(b)；
[0051]
图3为本发明又一实施例的dmg-peg2000的核磁共振氢谱图；
[0052]
图4为本发明中式7化合物的核磁共振氢谱图；
[0053]
图5为本发明中式8化合物的核磁共振氢谱图；
[0054]
图6为本发明中式9化合物的核磁共振氢谱图。
[0055]
图7为本发明中式10化合物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
[0056]
除非本文另有说明，术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括，但不限于，脂肪酸的酯，并且以通常在水中有较差的溶解性，但可溶于许多非极性有机物中为特征。尽管脂质通常在水中具有较差的溶解度，但是某些类别的脂质(例如，被极性基团修饰的脂质如dmg-peg2000)具有有限的水溶性，并且在某些条件下可以溶解于水中。脂质的已知类型包括生物分子，例如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和磷脂。脂质通常至少可分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，包括磷脂和糖脂(如dmpe-peg)；(3)“衍生脂质”，如类固醇等。此外，如本文所用，脂质也包括类脂质化合物。
[0057]
术语“阳离子脂质”是指在其所处环境的任何ph值或氢离子活性下带正电荷的脂质，或能够响应其所处环境(例如其预期使用环境)的ph值或氢离子活性而带正电荷的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化物质”的范围。
[0058]
术语“核酸”指包含至少两个脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna)的以单或双链形式存在的聚合物。其中寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称(包
括脱氧核糖核酸dna或核糖核酸rna内的核苷酸)，rna包含信使rna(mrna)、转运rna(trna)、核糖体rna(rrna)等。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核苷酸以及合成的核苷酸。
[0059]
聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步发生加成聚合而得到的一类分子量较低的水溶性聚醚。小分子量的低聚聚乙二醇为无色、无臭有吸湿性的粘稠液体，分子中既有醚链，又有羟基，故具有独特的溶解性能，能与水、醇混溶，微溶于醚。聚乙二醇近年来已广泛用于修饰生物大分子及小分子药物的结构。聚乙二醇目前在药用辅料、药物制剂生产、修饰药物分子等方面得到广泛应用，它是实现药物传输过程及控释过程的重要中间体。因为聚乙二醇具有优异的生物相容性，对一些生物相容性差的活性分子可以用官能团化的聚乙二醇改性。将一些生物相容性差的有生物活性的分子用官能团化的聚乙二醇修饰，可以提高活性分子的生物相容性、水溶性，甚至提高生物活性分子的稳定性和降低其毒性。近年来，聚乙二醇修饰脂质体的应用已成为提高药物疗效及减少毒副作用的有效手段。研究发现peg长度能影响rna的体内表达，因此一般使用所含peg平均分子量为1kda～3kda的脂质体。分子量较低(如500或750da)的peg不形成稳定的脂质体。dmg-peg2000作为一种被极性基团修饰的脂质，可以通过与聚阴离子核酸的经典作用自组装成大分子纳米颗粒，然后以这种方式封装核酸，从而有效地将核酸输送至胞浆并释放出核酸，与其靶位结合进而引发目标mrna降解。dmg-peg2000在医药技术领域具有广阔的应用前景。
[0060]
本文中，除非特别指明，否则本发明各化学式中的“c
nh(2n 1)”表示直链烷基。
[0061]
下面结合具体实施例详细阐述本发明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
[0062]
本发明的实施例中所使用的原料、试剂等均可通过商业购买获得，例如可以使用下述表1中的原料及试剂。
[0063]
表1
[0064]
原料/试剂厂家式1化合物厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司环氧溴丙烷北京伊诺凯科技有限公司四氢呋喃北京伊诺凯科技有限公司氢化钠(nah)梯希爱(上海)化成工业发展有限公司二氯甲烷上海润捷化学试剂有限公司无水硫酸钠上海泰坦科技股份有限公司甲醇上海润捷化学试剂有限公司高氯酸上海泰坦科技股份有限公司饱和碳酸氢钠上海润捷化学试剂有限公司肉豆蔻酰氯萨恩化学技术(上海)有限公司二异丙基二胺(diea)上海泰坦科技股份有限公司肉豆蔻酸国药集团化学试剂有限公司edci上海毕得医药科技有限公司dmap上海毕得医药科技有限公司
硅胶上海泰坦科技股份有限公司
[0065]
本发明实施例中测试分析使用的仪器的具体信息请见表2。
[0066]
表2
[0067]
仪器厂家高效液相色谱仪岛津公司核磁共振仪布鲁克公司质谱仪岛津公司硅胶柱上海禾汽玻璃仪器有限公司旋干仪上海诚育仪器设备有限公司maldi-tof日本东京jeol
[0068]
一、式c化合物的合成(步骤1)
[0069]
氮气保护下将式a化合物溶于溶剂，加入碱，在室温下反应2小时。之后将式b化合物溶液逐滴加入到上述反应体系中，反应得到式c化合物。
[0070]
式a化合物和式b化合物的摩尔量优选为1：2～1：8，更优选的，摩尔比为1：2～1：4。例如，式a化合的摩尔量为1.0mmol时，式b化合物的摩尔量可以为2.0mmol、2.5mmol、4mmol、8.0mmol等。当式a化合物和式b化合物的摩尔比高于1：2时，反应不完全，当式a化合物和式b化合物的摩尔比低于1：8时，浪费原料，且当式a化合物和式b化合物的摩尔比在上述范围内时，式a化合物的转化率高。
[0071]
式a化合物和式b化合物的溶剂可以相同，也可以不同，优选使用相同的溶剂。该溶剂无特别限定，只要是能够溶解式a化合物和式b化合物且对反应的进行无不利影响即可。例如，该溶剂可以是四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、甲苯或n,n-二甲基甲酰胺等，从廉价易于获得、溶解效果、利于反应的进行等方面考虑，优选四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃。
[0072]
溶剂的体积无特别限定，只要能够使式a化合物和式b化合物充分溶解，且使反应体系中各反应物的浓度不要过于低即可。优选的，当式a化合物的摩尔量为1.0mmol时，溶解式a化合物的溶剂的体积为20ml，当式b化合物的摩尔量为1.0mmol时，溶解式b化合物的溶剂的体积为5ml。
[0073]
加入的碱可以是常用的有机碱及无机碱，只要能够使式a化合物和式b化合物的烷氧基化反应顺利进行即可。例如可以是nah、diea或naoh等，从廉价易于获得、利于反应的进行等方面考虑优选nah。加入的碱的量无特别限定，只要能够使式a化合物和式b化合物的烷氧基化反应顺利进行即可。优选的，当加入的碱为nah时，式a化合物和nah的摩尔比为1：2。
[0074]
式a化合物和式b化合物的反应时间无特别限定，只要经检测反应完全即可。优选的，反应时间可以是0.5小时、16小时、24小时、48小时等。
[0075]
式a化合物和式b化合物的反应温度无特别限定，只要能够使式a化合物和式b化合物的烷氧基化反应顺利进行即可。优选的，反应温度可以是室温(即25℃)、45℃、60℃、65℃等。
[0076]
可以使用本领域技术人员常用的检测反应是否反应完全的手段来判断式a化合物和式b化合物是否反应完全，例如可以使用hplc检测原料峰是否消失来判断是否反应完全。
[0077]
检测显示反应完全后，将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，得到式c化合物出品。从反应液中提取式c化合物粗品的方法如上所述，也可
以使用其他的萃取试剂、干燥试剂。上述萃取试剂、干燥试剂的体积根据反应液的体积合理选择，只要能够充分萃取、干燥反应液中式c化合物即可。
[0078]
步骤1的实施例
[0079]
实施例1
[0080]
氮气保护下将式1化合物(2.0g，1.0mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(20.0ml)，加入nah(80.0mg(60％in oil)，2.0mmol，2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(0.27g，2.0mmol，2.0eq)溶于四氢呋喃(10.0ml)中，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌16小时。hplc显示反应完全，将反应液倒入20毫升的冰水中，用二氯甲烷(100ml x2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到黄色固体式3化合物(2.1g，收率：100％)。
[0081]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：3.38(s，3h)，3.45-3.69(m，185h)。
[0082]
实施例2
[0083]
氮气保护下将式1化合物(10.0g，5.0mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(100.0ml)，加入nah(0.4g(60％in oil)，10.0mmol，2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(2.7g，20.0mmol，4.0eq)溶于四氢呋喃(50.0ml)中，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌48小时。hplc显示反应完全，将反应液倒入100毫升的冰水中，用二氯甲烷(100ml x4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到棕色固体式3化合物(10.0g，收率：97.3％)。
[0084]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：3.38(s，3h)，3.45-3.69(m，185h)。
[0085]
实施例3
[0086]
氮气保护下将式1化合物(2.0g，1.0mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(20.0ml)，加入nah(80.0mg(60％in oil)，2.0mmol，2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(1.1g，8.0mmol，8.0eq)溶于四氢呋喃(10.0ml)中，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌16小时。hplc显示反应完全，将反应液倒入20毫升的冰水中，用二氯甲烷(100ml x2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到式3化合物(2.0g，粗品，白色固体，97.56％)。
[0087]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：3.38(s，3h)，3.45-3.69(m，185h)。
[0088]
实施例4
[0089]
氮气保护下将式1化合物(1.0g，0.5mmol，1.0eq)溶于2-甲基四氢呋喃(10ml)，加入nah(47.0mg(60％in oil)，1.0mmol，2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(1.1g，8.0mmol，8.0eq)溶于2-甲基四氢呋喃(2.0ml)中，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌16小时。hplc显示反应完全，将反应液倒入20毫升的冰水中，用二氯甲烷和甲醇(100ml x2)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到固体式3化合物(1.0g，收率：97％)。
[0090]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：3.38(s，3h)，3.45-3.69(m，185h)。
[0091]
实施例5
[0092]
取实施例2的反应48小时后的反应液(5ml)，温度升高到60℃，继续反应24h，hplc显示，仍是目标产物，于是结束反应。
[0093]
实施例6
[0094]
氮气保护下将式1化合物(1.0g，0.5mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(10ml)，加入nah(48.0mg(60％in oil)，1.0mmol，2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(0.28g，2.0mmol，4.0eq)溶于四氢呋喃，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌0.5小时。hplc显示反应完全，继续反应，并分别在1小时、2小时、14小时、48小时取样。hplc显示都是目标产物，
结束反应。
[0095]
二、实验路线设计
[0096]
在本领域中，根据文献bjornter horst et al,asymmetric synthesis and structure elucidation of a glycerophospholipid from mycobacterium tuberculosis,journal of lipid research volume 51,2010,1017-1022的报道，在得到环氧乙烷中间体化合物后，为了获得像式e这样的双脂肪酸邻二醇酯，可先用脂肪酸分子进攻环氧乙烷环，得到单脂肪酸酯(如以下反应流程图中的式f化合物)后，再使残留的游离羟基与另一脂肪酸分子发生酯化。即，通过前述bjornter horst et al的文献，可设计本发明的合成式e化合物的方法的反应路线如下所示：
[0097][0098]
当式e化合物为dmg-peg2000时，式a、b、c、f、e分别对应于以下
[0099]
式1、2、3、4、6的化合物，该合成方法的反应路线如下所示：
[0100][0101]
然而，如下文的实施例7和8所述，在实施上述反应路线时，式c(例如式3)的环氧乙烷化合物无法在脂肪酸的作用下开环并获得式4化合物。
[0102]
实施例7
[0103]
将式3化合物(0.2g,0.1mmol,1.0eq)和肉豆蔻酸(45.0mg,0.2mmol,2.0eq)溶于甲苯(5.0ml)中，加入四丁基溴化胺(3.0mg,0.01mmol,0.1eq)于120度搅拌16小时。hplc(elsd)显示原料未反应，未得到目标产物。
[0104]
实施例8
[0105]
将式3化合物(0.2g,0.1mmol,1.0eq)和肉豆蔻酸(228.0mg,1.0mmol,10.0eq)和四丁基溴化胺(3.0mg,0.01mmol,0.1eq)于120度搅拌16小时。hplc(elsd)显示原料未反应，未得到目标产物。
[0106]
由于前述根据现有技术文献设计的路线出人意料地无法完成反应，因此更改反应
路线如下所示：
[0107][0108]
当式e化合物为dmg-peg2000时，式a至式e分别对应于以下式1、2、3、5、6的化合物，该合成方法的反应路线如下所示：
[0109][0110]
三、式d化合物的合成(步骤2)
[0111]
将式c化合物溶于水，室温搅拌溶解，滴加酸，加热搅拌反应得到式d化合物。
[0112]
式c化合物在酸性条件下发生开环反应，该酸优选是高氯酸、硫酸或甲酸，从廉价易于获得、利于反应的进行等方面考虑优选高氯酸。需要说明，并非加入所有酸都能够实现式c化合物的开环，例如当加入本领域通常用于此类开环反应的浓盐酸时，在同样条件下就不能使式c化合物开环。因此，此处酸的使用是关键且需要创造性劳动的。酸的加入量只要能够使式c化合物的开环反应顺利进行即可。例如，当式c化合物的摩尔量为1.0mmol时，若酸为高氯酸，则高氯酸的加入量可以为0.4ml。
[0113]
式c化合物的开环反应的反应温度无特别限定，只要能够使式c化合物的开环反应顺利进行即可。例如，可以将反应液升温至40℃、45℃、70℃、75℃、90℃、95℃、100℃等反应。
[0114]
式c化合物的开环反应的反应时间无特别限定，只要能够使反应完全即可。例如，可以是0.5小时、1小时、3小时、7小时、8小时、14小时、16小时、44小时、48小时等。
[0115]
可以使用本领域技术人员常用的检测反应是否反应完全的手段来判断式c化合物的开环反应是否反应完全，例如可以使用hplc检测原料峰是否消失来判断是否反应完全。
[0116]
检测显示反应完全，用饱和碳酸氢钠的水溶液调ph＝8～9，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到式d化合物粗品。从反应液中提取式d化合物粗品的方法如上所述，也可以使用其他的萃取试剂、干燥试剂。上述萃取试剂、干燥试剂的体积根据反应
液的体积合理选择，只要能够充分萃取、干燥反应液中式d化合物即可。
[0117]
步骤2的实施例
[0118]
实施例9
[0119]
将式3化合物(0.2g,0.1mmol,1.0eq)溶于水(10.0ml)中，加入浓盐酸(1.0ml)于100度搅拌16小时。hplc(elsd)显示原料未反应，而且有杂质生成，未得到目标产物。
[0120]
实施例10
[0121]
250ml的圆底烧瓶中，称取式3化合物(10.0g，4.88mmol，1.0eq)加入水(100.0ml)，室温搅拌溶解，滴加高氯酸(2.0ml)，反应液升温至100℃，搅拌16小时。hplc显示反应完全，用饱和碳酸氢钠的水溶液调ph＝8～9，用二氯甲烷(100.0ml x4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到白色固体式5化合物(10.0g，收率：100％)。
[0122]
实施例11
[0123]
250ml的圆底烧瓶中，称取式3化合物(0.5g，0.25mmol，1.0eq)，加入水(10ml)，室温搅拌溶解，滴加高氯酸(0.1ml)。反应液升温至40～45℃，搅拌，分别在1h、7h、14h取样，通过hplc进行检验，90％以上都是目标产物式5化合物。
[0124]
实施例12
[0125]
250ml的圆底烧瓶中，称取式3化合物(0.5g，0.25mmol，1.0eq)，加入水(10ml)，室温搅拌溶解，滴加高氯酸(0.1ml)。反应液升温至70～75℃，搅拌，分别在1h、7h、14h取样检测，hplc显示90％以上都是目标产物式5化合物。
[0126]
实施例13
[0127]
250ml的圆底烧瓶中，称取式3化合物(5g，2.45mmol，1.0eq)，加入水(50ml)，室温搅拌溶解，滴加高氯酸(1.0ml)。反应液升温至95～100℃，反应0.5h时，hplc显示反应结束，在此温度继续反应，分别在1h、4h、16h取样，仍然为目前产物，继续反应到44小时，结束反应，剩下的样品倒入饱和碳酸氢钠的水溶液调ph＝8～9，用二氯甲烷(100.0ml x4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到白色固体式5化合物(4.9g，收率：100％)。
[0128]
四、式e化合物的合成(步骤3)
[0129]
将式d化合物和式c
nh(2n 1)
cooh的酸(例如当n＝13时，其为c
13h27
cooh即肉豆蔻酸)溶于溶剂中，加入酯缩合剂，然后搅拌反应得到式e化合物(例如式6的dmg-peg2000化合物，或式7-10的化合物)。
[0130]
需要说明，在现有技术中常常使用羟基与酰氯缩合的方式来成酯。然而，如下文的实施例14和15所述，式5的化合物无法与肉豆蔻酰氯反应生成式6的化合物。可见，本发明使用式d化合物和式c
nh(2n 1)
cooh的酸并不是常规的、随机的选择。
[0131]
该反应中所使用的溶剂无特别限定，只要是能够溶解式d化合物和c
nh(2n 1)
cooh且对反应的进行无不利影响即可。例如，该溶剂可以是二氯甲烷。
[0132]cnh(2n 1)
cooh和式d化合物的摩尔量优选为5：1～10：1。例如，式d化合的摩尔量为1.0mmol时，c
nh(2n 1)
cooh的摩尔量可以为5.0mmol、10.0mmol等。
[0133]
当式d化合物和c
nh(2n 1)
cooh反应时，加入的酯缩合剂无特别限定，只要能够使式d化合物和c
nh(2n 1)
cooh的酯缩合反应顺利进行即可。例如，酯缩合剂可以是edci/dmap、edci/hobt、hobt/hatu或dic/dmap等常用的酯缩合剂。从廉价易于获得、利于反应的进行等方面考虑优选edci/dmap。优选的，上述式d化合物和c
nh(2n 1)
cooh的酯缩合反应还可以添加
碱，所用的碱无特别限定，只要能够使式d化合物和c
nh(2n 1)
cooh的酯缩合反应顺利进行即可，例如可以是diea、三乙胺、吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)等常见有机碱。从廉价易于获得、利于反应的进行等方面考虑优选diea。
[0134]
该反应的反应温度无特别限定，只要能够使反应顺利进行即可，例如，可以是0～50℃。
[0135]
该反应的反应时间无特别限定，只要能够使反应完全即可，例如可以是16小时、24小时等。
[0136]
可以使用本领域技术人员常用的检测反应是否反应完全的手段来判断是否反应完全，例如可以使用hplc检测原料峰是否消失来判断是否反应完全。
[0137]
检测显示反应完全，将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品。从反应液中提取式e化合物粗品的方法如上所述，也可以使用其他的萃取试剂、干燥试剂。上述萃取试剂、干燥试剂的体积根据反应液的体积合理选择，只要能够充分萃取、干燥反应液中式e化合物即可。
[0138]
将粗品用硅胶柱纯化，得到式e化合物(例如式6的dmg-peg2000，或式7-10的化合物)。提纯式e化合物粗品的方法不限于使用硅胶柱纯化，任何本领域技术人员一直的提纯方法均可用于本发明。当使用硅胶柱纯化时，硅胶柱的规格及型号无特别限定，只要能够提纯式e化合物粗品即可，优选的，使用的硅胶为spherical 20-35um 100a(上海泰坦科技股份有限公司)，硅胶柱的规格为60mm x 250mm(上海禾汽玻璃仪器有限公司)；洗脱剂的成分及比例无特别限定，只要能够提纯式e化合物粗品即可，优选的，洗脱剂为dcm：meoh＝40：1～10：1(体积比)。
[0139]
步骤3的实施例
[0140]
实施例14
[0141]
将式5化合物(0.1g,0.05mmol,1.0eq)和肉豆蔻酰氯(117.0mg,0.48mmol,10.0eq)溶于二氯甲烷(5.0ml)中，加入吡啶(19.0mg,0.24mmol,5.0eq)于50度搅拌16小时。cad和tlc(与标样对照)显示无目标产物生成。
[0142]
实施例15
[0143]
将式5化合物(0.1g,0.05mmol,1.0eq)和肉豆蔻酰氯(117.0mg,0.48mmol,10.0eq)溶于二氯甲烷(5.0ml)中，加入diea(31.0mg,0.24mmol,5.0eq)于50度搅拌16小时。tlc(与标样对照)显示无目标产物生成。
[0144]
实施例16
[0145]
将式5化合物(10.0g，4.8mmol，1.0eq)和肉豆蔻酸(10.9g，48.0mmol，10.0eq)溶于二氯甲烷(100.0ml)中，加入edci(4.7g，24.0mmol，5.0eq)，dmap(350.0mg，2.4mmol，0.5eq)和diea(6.2g，48.0mmol，10.0eq)，在50度下搅拌24小时，hplc显示反应完全，将反应液倒入100毫升的冰水中，用二氯甲烷(100ml x4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，取12g样品用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝40：1～10：1)，得到dmg-peg2000(6g，50％)。dmg-peg2000的质谱图如图1所示(质谱检测参数如下：使用chca基质，使用jeol jms-s3000 spiral-tofms(jeol，东京，日本)记录maldi-tof质谱图，用349nm nd：ylf激光辐照产生的离子在20kv时加速，然后，离子沿着螺旋离子轨迹通过，其飞行长度约为17m)；核磁共振氢谱图和质谱图分别如图2的(a)和(b)所示。
[0146]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：0.86-0.96(m，6h)，1.25(s，42h)，1.58-1.63(m，4h)，2.27-2.33(m，4h)，3.47(s，3h)，3.57-3.81(m，182h)，4.13-4.17(m，1h)，4.32-4.36(m，1h)，5.20-5.21(m，1h)。
[0147]
实施例17
[0148]
将式5化合物(1.0g，0.48mmol，1.0eq)和肉豆蔻酸(0.55g，2.4mmol，5.0eq)溶于二氯甲烷(10.0ml)中，加入edci(0.47g，2.4mmol，5.0eq)，dmap(108.0mg，0.96mmol，2eq)和diea(0.31g，2.4mmol，5.0eq)，在0-5度下搅拌18小时，hplc显示反应完全，将反应液倒入20毫升的冰水中，用二氯甲烷(20ml x4)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝40：1～10：1)，得到dmg-peg2000(0.6g，50％)。核磁共振氢谱图如图3所示。
[0149]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ：0.86-0.96(m，6h)，1.25(s，42h)，1.58-1.63(m，4h)，2.27-2.33(m，4h)，3.47(s，3h)，3.57-3.81(m，182h)，4.13-4.17(m，1h)，4.32-4.36(m，1h)，5.20-5.21(m，1h)。
[0150]
实施例18：式7-9化合物的合成
[0151][0152]
将式5化合物(1.0g,0.5mmol,1.0eq)和月桂酸(427mg,1.5mmol,3.0eq)溶于二氯甲烷(10ml)中，加入edci(383mg,2.0mmol,4.0eq)，dmap(31mg,0.25mmol,0.5eq)和dipea(323mg,2.5mmol,5.0eq)，回流搅拌16小时。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝20：1)，得到式7化合物(360mg)。核磁共振氢谱图如图6所示。
[0153]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：0.86-0.90(m,6h),1.26-1.37(m,56h),1.58-1.66(m,4h),2.28-2.33(m,4h),3.38(s,3h),3.64(s,182h),4.12-4.17(m,1h),4.32-4.36(m,1h),5.18-5.23(m,1h).
[0154]
以下通过类似于实施例16～18的方法，使用棕榈酸或硬脂酸作为反应原料，合成式8或式9的化合物。
[0155][0156]
实施例19：式8化合物的合成
[0157]
将式4化合物(1.0g,0.5mmol,1.0eq)和棕榈酸(385mg,1.5mmol,3.0eq)溶于二氯甲烷(10ml)中，加入edci(383mg,2.0mmol,4.0eq)，dmap(31mg,0.25mmol,0.5eq)和dipea(323mg,2.5mmol,5.0eq)，回流搅拌16小时。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝20：1)，得到式8化合物(360mg)。核磁共振氢谱图如图5所示。
[0158]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：0.86-0.90(m,6h),1.26-1.37(m,48h),1.58-1.63(m,4h),2.28-2.32(m,4h),3.38(s,3h),3.64(s,182h),4.13-4.17(m,1h),4.33-4.36(m,1h),5.18-5.23(m,1h)。
[0159]
实施例20：式9化合物的合成
[0160]
将式4化合物(1.0g,0.5mmol,1.0eq)和硬脂酸(427mg,1.5mmol,3.0eq)溶于二氯甲烷(10ml)中，加入edci(383mg,2.0mmol,4.0eq)，dmap(31mg,0.25mmol,0.5eq)和dipea(323mg,2.5mmol,5.0eq)，回流搅拌16小时。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝20：1)，得到式9化合物(360mg)。核磁共振氢谱图如图6所示。
[0161]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：0.86-0.90(m,6h),1.26-1.37(m,56h),1.58-1.66(m,4h),2.28-2.33(m,4h),3.38(s,3h),3.64(s,182h),4.12-4.17(m,1h),4.32-4.36(m,1h),5.18-5.23(m,1h)。
[0162]
五、其它化合物的合成实施例
[0163]
根据以下合成路线，在实施例21-23中合成了式10的化合物(m＝22，n＝13)。
[0164][0165]
实施例21：式3a化合物的合成
[0166]
氮气保护下将式1a化合物(10.0g,10.0mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(100ml)，加入nah(800mg,20.0mmol,2.0eq)，在室温下反应2小时。将式2化合物(5.48g,40.0mmol,4.0eq)溶于四氢呋喃(20ml)中，逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌48小时。hplc显示反应完全，将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到黄色固体式3a化合物(9.6g，收率：100％)。
[0167]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：3.38(s,3h),3.64(s,97h)
[0168]
实施例22：式4a化合物的合成
[0169]
250ml的圆底烧瓶中，称取式3a化合物(5.0g,4.73mmol,1.0eq)加入水(100.0ml)，室温搅拌溶解，滴加高氯酸(2.0ml)，反应液升温至100℃，搅拌16小时。hplc显示反应完全，用饱和碳酸氢钠的水溶液调ph＝8～9，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得到白色固体式4a化合物(4.2g，收率：100％)。
[0170]
实施例23：式10化合物的合成
[0171]
将式4a化合物(2.0g,1.86mmol,1.0eq)和肉豆蔻酸(1.6g,5.58mmol,3.0eq)溶于二氯甲烷(10ml)中，加入edci(1.4g,7.44mmol,4.0eq)，dmap(114mg,0.93mmol,0.5eq)和dipea(1.2g,9.3mmol,5.0eq)，回流搅拌16小时。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品，用硅胶柱纯化(洗脱剂：dcm：meoh＝20：1)，得到式10化合物(1.6g)。核磁共振氢谱图如图7所示。
[0172]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ：0.86-0.90(m,6h),1.26(s,41h),1.57-1.63(m,4h),2.28-2.30(m,4h),3.38(s,3h),3.64(s,93h),4.13-4.17(m,1h),4.32-4.36(m,1h),5.18-5.24(m,1h)。