一种用于鉴别区分发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的薄层色谱分析方法与流程

1.本发明涉及一种薄层色谱分析方法，具体涉及一种用于鉴别区分发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的薄层色谱分析方法。


背景技术：

2.发酵冬虫夏草菌粉(cs-c-q80)，为中华被毛孢(hirsntellasinensis l)经液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末，可供《中国药典》一部中的百令胶囊项下进行薄层色谱鉴别分析使用。发酵虫草菌粉(cs-4)是从冬虫夏草(cordycepssinensis(berk)sacc)中分离所得的虫草菌-蝙蝠蛾拟青霉((paecilomyceshepialichen)cs-4)经深层发酵培养，将发酵产物过滤，再进行干燥制成的粉末，可供《中国药典》一部中的金水宝片项下进行薄层色谱鉴别分析使用。
3.发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉都属于液体发酵粉，市场上两者都被作为冬虫夏草来售卖，并大量的应用于医药和保健品行业。但这两者差别非常大，首先是发酵的菌种不同，发酵冬虫夏草菌粉的菌种来源于中华被毛孢菌，发酵虫草菌粉的菌种来源于从冬虫夏草中分离所得的虫草菌-蝙蝠蛾拟青霉。其次，两者的价格不同，发酵冬虫夏草菌粉的价格较贵，通常为发酵虫草菌粉价格的40～50倍。最后，两者在成分含量规定和药用法用量规定均有所不同，发酵冬虫夏草菌粉在成分含量上规定，其所含腺苷含量不得低于0.08％；在药用法用量上，规定口服，每次1～3g，每日3次，而发酵虫草菌粉在成分含量和药用法用量上均没有规定。
4.虽然发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉在本质上有很大的区别，但是从外观上看，两者都是棕褐色精细粉末，肉眼很难将两种菌粉区分开来，这就导致市场上出现了用发酵虫草菌粉冒充发酵冬虫夏草菌粉的现象，影响了使用发酵冬虫夏草菌粉生产出来的药品和保健品的质量信誉，同时因为两者在用法用量上大不同，不按对应的规定剂量服用，对服用者的身体健康将会造成潜在的危害。目前为止，还没有一个快速有效的方法可用于该两者菌粉的鉴别区分。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉两者因外观及其相似，极易被混淆进行售卖和使用，且目前没有快速有效的方法可用于该两者菌粉的鉴别区分的技术问题，而提供一种用于鉴别区分发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的薄层色谱分析方法。薄层色谱具有分离效果好、鉴别快、灵敏度高、成本低、操作简单以及图谱直观等多种优点，在中药材的分离分析中得到了广泛应用。但目前还未见有应用薄层色谱对发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉进行区分的研究报道。
6.本发明的技术解决方案是：
7.一种用于鉴别区分发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的薄层色谱分析方法，其特
殊之处在于，包括以下步骤：
8.1)制备标准对照液和样品液
9.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于可密封的试验容器中，再分别加入所述发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量5～10倍量、质量浓度为70％～100％的乙醇，并进行超声提取30～60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液分别作为发酵冬虫夏草菌粉标准对照液和发酵虫草菌粉标准对照液；
10.1.2)取待鉴别区分的待检菌粉，置于可密封的试验容器中，再加入所述待检菌粉质量5～10倍量，质量浓度为70％～100％的乙醇，并进行超声提取30～60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；
11.2)进行薄层点样
12.将步骤1.1)中制备好的发酵冬虫夏草菌粉标准对照液和发酵虫草菌粉标准对照液和步骤1.2)中制备好的样品液点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成点样原点；
13.3)制备展开剂
14.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以8～12:0.8～1.2:0.8～1.2:1.8～2.2的体积比混合均匀，得到展开剂；
15.3.2)将展开剂置于展开缸中，密封展开缸，预饱和15～20分钟；
16.4)展开
17.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展开缸中；
18.4.2)当展开剂的前沿上行至距离点样原点6cm～10cm时，将硅胶gf薄层板取出；
19.5)显色与鉴别
20.5.1)待步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂干燥后，喷以质量比为5～10％的硫酸乙醇溶液，随后在100-110℃下加热3～5分钟；
21.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板在检视光源光照下进行检视，得到检视图；
22.5.3)将检视图上待检菌粉样品液的点样原点形成的斑点分别与发酵冬虫夏草菌粉标准对照液和发酵虫草菌粉标准对照液的点样原点形成的斑点进行比较；
23.若待检菌粉的斑点和发酵冬虫夏草菌粉标准对照液的斑点一致，则待检菌粉为发酵冬虫夏草菌粉，若待检菌粉的斑点和发酵虫草菌粉标准对照液的斑点一致，则待检菌粉为发酵虫草菌粉，若待检菌粉的斑点和发酵冬虫夏草菌粉标准对照液的斑点不一致，且和发酵虫草菌粉标准对照液的斑点也不一致，则待检菌粉为其他菌粉。
24.进一步地，步骤5.2)中，所述检视光源为365nm紫外光、254nm紫外光以及日光的其中一种。
25.进一步地，步骤5.2)具体为：放至室温后，将硅胶gf薄层板分别在在365nm紫外光、254nm紫外光以及日光光照下进行检视，得到检视图。
26.进一步地，步骤1.1)具体为：取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入所述发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量6倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室
温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；
27.步骤1.2)具体为：取待鉴别区分的待检菌粉，置于带塞的三角瓶中，再加入所述待检菌粉质量6倍量，质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液。
28.进一步地，步骤2)中，所述点样原点位置距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.0～1.5cm。
29.进一步地，步骤3.1)中，乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水的体积比为8:0.8:0.8:1.8。
30.进一步地，步骤3.2)中，所述展开缸采用双槽展开缸，双槽展开缸的大小为10cm
×
10cm、20cm
×
10cm或10cm
×
20cm，且双槽中的展开剂剂量保持一致，并预饱和15分钟。
31.进一步地，步骤4.2)具体为，当展开剂的前沿上行至距离点样原点8cm～10cm时，将硅胶gf薄层板取出。
32.进一步地，步骤5.1)具体为：吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为10％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在105℃下加热3～5分钟。
33.本发明的有益效果：
34.1、本发明采用薄层色谱鉴别区分发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉，具有快速高效、分离效果佳、鉴别快、灵敏度高、简单经济和直观的优点，很好的解决了发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的区分问题。
35.2、本发明采用乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以8～12:0.8～1.2:0.8～1.2:1.8～2.2体积比混合，制备展开剂，得到的斑点分离效果好，特征斑点突出，且没有斑点拖尾和斑点扩散现象，结果直观明显，容易判断。
36.3、本发明采用硅胶gf薄层板，并在紫外光365nm和日光下检视的基础上，增加了在紫外光254nm下进行检视，增加了检测方式的同时，让结果更具可参考价值。
37.4、本发明采用5％～10％的硫酸乙醇为显色剂，方便快速，显色斑点多且斑点色彩明显。
38.5、本发明选用适量的乙醇直接对原料药材进行超声处理并过滤，将滤液作为检测溶液，样品前处理简单，成本低，易于操作。
附图说明
39.图1为本发明实施例中gf薄层板在254nm光照下的检视图；
40.图2为本发明实施例中gf薄层板在365nm光照下的检视图；
41.图3为本发明实施例中gf薄层板在日光光照下的检视图。
具体实施方式
42.以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述。
43.本发明实施例中用于制备标准对照液的发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉原料均来源于中国食品药品检定研究院，待鉴别区分的待检菌粉原料来自市场随机购买。
44.实施例一
45.1)制备标准对照液和样品液
46.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞
的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量6倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料的标准对照液编号分别标为1号和4号。
47.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量6倍量，质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
48.2)进行薄层点样
49.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.0cm；
50.3)制备展开剂
51.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以8:0.8:0.8:1.8的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
52.3.2)将展开剂置于10
×
10cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和15分钟；
53.4)展开
54.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
55.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点8cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
56.5)显色与鉴别
57.5.1)吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为10％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在105℃下加热3～5分钟；
58.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板依次在365nm紫外光、254nm紫外光以及日光光照下进行检视，得到检视图；
59.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
60.实验结果如图1至3所示，三张检视图上，编号2、3的斑点与编号1的斑点在数量和rf上均一致，编号5、6的斑点与编号4的斑点在数量和rf上均一致，可以判断，编号2、3的待检菌粉为发酵冬虫夏草菌粉，编号5、6的待检菌粉为发酵虫草菌粉。三种不同检视光源下得到的检视图图谱一致，且各图谱中的斑点分离明显，图谱结果直观易判断，说明只用365nm紫外光、254nm紫外光以及日光中的其中一种，即可鉴别区分出待检菌粉的品种，本实施例中分别在这三种检视光源下进行检视，得到三种检视图可互相验证，进一步确保结果的准确与可靠。其他实施例中可只用一种检视光源进行检视，得到检视图。
61.实施例二
62.1)制备标准对照液和样品液
63.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量5倍量、质量浓度为90％的乙醇，并进行超声提取30分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的标准对照液编号分别标为1号和4号。
64.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量5倍量，质量浓度为90％的乙醇，并进行超声提取30分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
65.2)进行薄层点样
66.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.5cm；
67.3)制备展开剂
68.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以10:1:1:2的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
69.3.2)将展开剂置于20
×
10cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和20分钟；
70.4)展开
71.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
72.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点6cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
73.5)显色与鉴别
74.5.1)用吹风机吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为5％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在100℃下加热3～5分钟；
75.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板依次在365nm紫外光、254nm紫外光以及日光光照下进行检视，得到检视图；
76.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
77.所得的检视图与实施例一基本一致。
78.实施例三
79.1)制备标准对照液和样品液
80.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉原料对照品原料质量10倍量、质量浓度为100％的乙醇，并进行超声提取50分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜
过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的标准对照液编号分别标为1号和4号。
81.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量10倍量，质量浓度为100％的乙醇，并进行超声提取50分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
82.2)进行薄层点样
83.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.3cm；
84.3)制备展开剂
85.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以12:1.2:1.2:2.2的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
86.3.2)将展开剂置于10
×
20cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和17分钟；
87.4)展开
88.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
89.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点10cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
90.5)显色与鉴别
91.5.1)用吹风机吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为7％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在110℃下加热3～5分钟；
92.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板依次在365nm紫外光、254nm紫外光以及日光光照下进行检视，得到检视图；
93.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
94.所得的检视图与实施例一基本一致。
95.实施例四
96.1)制备标准对照液和样品液
97.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉原料对照品原料质量6倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的标准对照液编号分别标为1号和4号。
98.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量6倍量，质
量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
99.2)进行薄层点样
100.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.0cm；
101.3)制备展开剂
102.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以10:1:1:2的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
103.3.2)将展开剂置于10
×
10cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和15分钟；
104.4)展开
105.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
106.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点8cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
107.5)显色与鉴别
108.5.1)吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为10％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在105℃下加热3～5分钟；
109.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板在365nm紫外光光照下进行检视，得到检视图；
110.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
111.所得的检视图与图2基本一致。
112.实施例五
113.1)制备标准对照液和样品液
114.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量6倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的标准对照液编号分别标为1号和4号。
115.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量6倍量，质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
116.2)进行薄层点样
117.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上
同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.0cm；
118.3)制备展开剂
119.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以10:1:1:2的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
120.3.2)将展开剂置于10
×
10cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和15分钟；
121.4)展开
122.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
123.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点8cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
124.5)显色与鉴别
125.5.1)吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为10％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在105℃下加热3～5分钟；
126.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板在254nm紫外光光照下进行检视，得到检视图；
127.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
128.所得的检视图与图1基本一致。
129.实施例六
130.1)制备标准对照液和样品液
131.1.1)取发酵冬虫夏草菌粉对照品原料和发酵虫草菌粉对照品原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入发酵冬虫夏草菌粉对照品原料、发酵虫草菌粉对照品原料质量6倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为标准对照液；将发酵冬虫夏草菌粉和发酵虫草菌粉的标准对照液编号分别标为1号和4号。
132.1.2)取市场上采买的待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉和两份发酵虫草菌粉作为待检菌粉原料，分别置于带塞的三角瓶中，再分别加入各待检菌粉原料质量6倍量，质量浓度为70％的乙醇，并进行超声提取60分钟，放至室温，然后采用微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品液；将待鉴别区分的两份发酵冬虫夏草菌粉的样品液依次编号为2和3，将待鉴别区分的两份发酵虫草菌粉样品液依次编号为5和6。
133.2)进行薄层点样
134.将步骤1)中制备好的标准对照液和样品液按编号依次点于同一硅胶gf薄层板上同一高度的不同位置上形成六个点样原点；且点样原点距离硅胶gf薄层板底部的距离为1.0cm；
135.3)制备展开剂
136.3.1)将乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水以10:1:1:2的体积比混合均匀，配制得到20ml展开剂，此处乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为纯品；
137.3.2)将展开剂置于10
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10cm双槽展开缸中，两槽中展开剂的量一致，随后密封展开缸，进行预饱和15分钟；
138.4)展开
139.4.1)将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶gf薄层板放入展开缸中，使硅胶gf薄层板斜靠在展缸中且展开缸中的展开剂不能没过点样原点位置；
140.4.2)当展开剂沿着薄层板上行展开，至展开剂的前沿上行至距离点样原点8cm的时候，将硅胶gf薄层板取出；
141.5)显色与鉴别
142.5.1)吹干步骤4.2)展开好的硅胶gf薄层板上的试剂后，喷以质量比为10％的硫酸乙醇溶液，随后采用电加热板在105℃下加热3～5分钟；
143.5.2)放至室温后，将硅胶gf薄层板在2日光光照下进行检视，得到检视图；
144.5.3)将检视图上待检菌粉(编号2、3、5和6)的点样原点形成的斑点分别与编号1(发酵冬虫夏草菌粉标准对照液)和编号4(发酵虫草菌粉标准对照液)的点样原点形成的斑点进行比较。
145.所得的检视图与图3基本一致。
146.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。