母体血浆的无创性产前分子染色体核型分析

母体血浆的无创性产前分子染色体核型分析
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2013年1月10日提交的名称为“母体血浆的无创性产前分子染色体核型分析(noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma)”的美国临时专利申请号61/751,213以及2013年3月15日提交的名称为“母体血浆的无创性产前分子染色体核型分析(noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma)”的美国专利申请号13/837,776的优先权。每一件优先权申请均以引用的方式整体并入本文中用于所有目的。
3.本技术与lo等人在2008年7月23日提交的名称为“利用大规模并行基因组测序对胎儿染色体非整倍体进行诊断(diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using massively parallel genomic sequencing)”的共同拥有的美国专利申请号12/178,181相关，该专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文中。


背景技术：

4.胎儿dna在母体血浆中的存在已开辟了无创性产前检查的令人兴奋的可能性[1、2]。近来，使用大规模并行测序(mps)对循环的胎儿dna进行分析以实现产前检查目的已引起了很多的关注。因此，胎儿染色体三体21、13、18和所选择的性染色体非整倍体已在母体血浆dna上利用mps被检测[3-7]并且已迅速地被引入临床服务中。
[0005]
除了由于牵涉到整个染色体的拷贝数变化所导致的异常外，重要的是评估对母体血浆进行的基于mps的分析是否可能灵敏到足以检测出亚染色体缺失或重复。在这方面，peters等人报道了在妊娠期第35周所获得的母体血浆样品中检测到在染色体12上的4.2mb缺失[8]。jensen等人报道了在妊娠期第19周和第20周从两位孕妇所获得的母体血浆样品中检测到在染色体22上的3mb缺失[9]。除缺失区域外，peters等人还对染色体12上的另一个区域以及染色体14上的20个非重叠的4mb区域进行了统计分析[8]。另一方面，jensen等人仅将他们的统计分析集中在染色体22上的缺失区域[9]。因此，根据由peters等人和jensen等人所提供的数据，尚不清楚该种方法是否稳健到足以用于对微缺失或微重复进行全基因组检测或实际上用于对胎儿染色体核型进行无创性测定。
[0006]
lo等人报道了可以在全基因组规模下利用母体血浆dna测序对胎儿单核苷酸多态性(snp)进行基因分型[10]。具体来说，这些研究人员已证明可以利用被称为相对单倍型剂量分析的方法来阐明胎儿从其母亲所遗传的单基因病症的snp等位基因和突变[10]。fan等人确认了相对单倍型剂量分析的稳健性，并且利用这种方法检测出胎儿从其母亲所遗传的约2.85mb的缺失[11]。在将这种方法用于无创性产前染色体核型分析的临床实施中存在两个顾虑。首先，这种方法需要进行母体单倍型分析，这将会需要另外的分析步骤[12、13]或系谱分析。其次，尚不清楚这种方法是否可以用于检测新生亚染色体缺失或重复。


技术实现要素：

[0007]
本文公开了用于检测胎儿基因组中的微扩增或微缺失的方法、系统和设备。在一
些实施方案中，所述方法包括：接收生物样品中的多个dna片段中的每一个的序列标签；确定所述序列标签的基因组位置；确定多个基因组区域中的每一个中dna的密度是否异常高或者异常低；将具有异常高密度的一组连续基因组区域鉴定为微扩增；以及将具有异常低密度的一组连续基因组区域鉴定为微缺失。生物样品可以是以无创方式从怀有胎儿的女性受试者获得的血液样品。
附图说明
[0008]
图1是示出了鉴定胎儿基因组中的微扩增或微缺失的方法的流程图。
[0009]
图2是在母体血浆基因组中所检测的拷贝数变异的circos图。从内向外：案例01至案例06。染色体核型模式图(ideogram)(最外面的环)是沿顺时针方向从pter向qter取向的。每一条代表1mb的窗口。具有在血浆中的表现增加或降低的三个或更多个连续1mb区段的区域分别是用绿色条和红色条来表示的。红色箭头突出显示了在这些异常区域上的大致染色体位置。
[0010]
图3和图4示出了在母体血浆中检测到的拷贝数变异。示出了每一个案例的显示出拷贝数变异的染色体。基因组位置示于x-轴上并且z-分数绘制于y-轴上。每一个竖条代表1mb区段。具有在血浆中的表现增加或降低的三个或更多个连续1mb区段的区域分别是用绿色条和红色条来表示。
[0011]
图5是示出了通过受微缺失/微重复影响的区域的基因组表现的变化以及母体血浆中染色体y序列的比例所估计的胎儿dna百分比的表。(a)chr y法只适用于怀有男性胎儿的那些案例。(b)对于案例05，由于母亲也携带变异，因此母体血浆中受影响区域的基因组表现不能被用于确定胎儿dna百分比。(c)前面的数字和后面的数字分别代表由染色体3上的微重复和染色体4上的微缺失所估计的胎儿dna百分比。
[0012]
图6示出了3mb微缺失/微重复的检测的诊断灵敏度。绘出了检测变异的诊断灵敏度相对于胎儿dna百分比的图。在假定对总共15000万种血浆dna分子进行分析的情况下，进行计算机模拟分析。
[0013]
图7是示出了在假定胎儿dna百分比为5％的情况下，需要被测序和比对以实现不同的诊断分辨率和诊断灵敏度的分子数目的表。在这一理论分析中，基于三个连续区段的基因组表现在同一方向上与参考的平均值相差》3倍sd(过度表现或者表现不足)的标准，所有案例的诊断特异性均为》99.9％。
[0014]
图8是示出了关于在实施例中所论述的样品的信息的表。
[0015]
图9示出了可用于根据本发明的实施方案的系统和方法的示例性计算机系统900的框图。
具体实施方式
[0016]
本发明的实施方案提供了用于确定胎儿基因组中是否存在微扩增或微缺失的方法、系统和设备。简而言之，这一确定可以通过获得生物样品并且对所述样品中源自于多个基因组区域中的每一个的基因组dna的量进行定量来完成。可以适当地将每一个基因组区域的量归一化以获得该区域的密度(即，对应的密度)，并且与参考密度进行比较。对应的密度与参考密度之间存在统计学上显著性差异则可以表明在基因组区域中或者跨越多个基
因组区域存在微扩增或微缺失。为了避免假阳性，当至少两个连续基因组区域中的每一个存在这种统计学上显著性差异时，对微扩增或微缺失进行鉴定。
[0017]
i.引言
[0018]
实施方案可以用于检测染色体的基因或区域的拷贝数的差异。由微扩增(也被称为微重复)所造成的异常高的基因拷贝数可能会导致这些基因的过表达或病理性表达，从而导致疾病如癌症。相反，由微缺失所造成的低基因拷贝数可能会导致表达减少或生物(例如酶促)功能的丧失。因此，对异常拷贝数的检测可以提供胎儿在出生前或出生后可能会面对的疾病的预警。
[0019]
生物样品可以无创方式从怀有胎儿的女性受试者获得。所述样品可以包括血液、血浆、血清、尿液或唾液。血液含有无细胞的dna片段，并且在怀孕的受试者中，这些片段中的一部分是来源于胎儿。可如通过采用大规模并行测序技术对这些dna片段进行测序，以获得序列标签。可使用任何大规模并行测序平台，包括边合成边测序平台(例如illumina/solexa)、边连接边测序平台(例如life technology solid平台)、或单分子测序平台(例如helicos或pacific biosciences)。每一个序列标签均含有产生所述序列标签的dna片段的序列的全部或一部分并且可以与参考基因组序列进行比对以确定该片段的起源的基因组区域。
[0020]
基因组区域，也被称为“区段”，可通过将参考基因组序列进行划分来限定。这些区域对应于染色体的连续序列部分。在优选的实施方案中，每一个区域与一个染色体有关，并且不跨越多个染色体。在一些实施方案中，这些区域具有相同的尺寸，如1mb。基因组区域的尺寸决定了本文所公开的方法的分辨率、以及以统计确定性鉴定微扩增和微缺失所需的dna片段的数目。
[0021]
ii.方法
[0022]
图1是通过对从怀有胎儿的女性受试者所获得的生物样品进行分析来鉴定胎儿基因组中的微扩增或微缺失的方法100的流程图，该生物样品包括来自胎儿和来自女性受试者的无细胞dna。
[0023]
在步骤110中，接收生物样品中的多个dna片段中的每一个的一个或多个序列标签。这些序列标签可通过利用本领域已知的任何方法，例如sanger测序或大规模并行测序对dna片段进行测序而获得。每一个标签均可被称为测序
‘
读数’，并且可对应于产生该标签的dna片段的一部分或全部。举例来说，所述标签可含有该片段的一端或该片段的内部的序列。
[0024]
可利用任何已知方法将dna片段从生物样品中分离出，并且准备用于测序。举例来说，可在测序之前，例如利用聚合酶链式反应(pcr)将这些片段进行拷贝，或者可以将这些片段连接到适合于所采用的测序技术的接头分子或
‘
条形码’序列。还可使用这些片段产生用于桥式扩增的克隆集群，正如在illumina测序和类似技术中所进行的那样。准备用于测序的这组dna片段可被称为
‘
测序文库’。
[0025]
在一些实施方案中，根据配对末端测序产生序列标签，其中在两个方向上从相对端对dna片段的拷贝进行测序。对来自两个方向的测序数据进行的比较允许对该片段的序列，特别是该片段的末端处的序列进行验证。由配对末端测序所获得的序列标签的原始数目提供了样品中dna片段数目的估计值。这一数目可在100万、1000万、10000万、10亿和100
亿之间变化，这取决于样品的大小和性质。在一些实施方案中，当多个序列标签代表相同的序列(即，在两端处相同的序列)时，可将重复的标签放弃或排除而不进行进一步分析。
[0026]
在步骤120中，确定序列标签的基因组位置。这是通过首先利用本领域已知的标准方法将每一个序列标签与参考序列，如重复序列未被屏蔽的人参考基因组(ncbi build 36.1/hg18)进行比对来完成。在一些实施方案中，仅保留两端与同一染色体进行比对的标签用于进一步分析。如果例如与参考序列存在太多的失配，或者如果标签不在规定的尺寸范围内，那么也可将标签放弃。然后基于其序列，将每一个标签归属于参考序列内的基因组区域或
‘
区段’，如上所述。
[0027]
在步骤130中，对于多个基因组区域中的每一个，由基因组区域内具有基因组位置的序列标签确定基因组区域内dna片段的对应量。基因组区域的dna片段的对应量是可从被归属于该区域的序列标签中所含的数据的总体或其一部分计算的参数。这些数据包括例如标签的数目和长度以及标签之间重叠的量。该量参数是在已知用于产生序列标签的技术的情况下计算的，并且是造成这一技术失真的原因，例如可能来源于同一dna片段的多个标签的存在。在基因组区域内的对应的量可以是例如被推断已存在于样品中且来源于基因组区域的片段的数目、或者来自基因组区域的dna的总质量。在优选的实施方案中，在基因组区域内dna片段的对应量是样品中来自该区域的dna的量的定量量度。
[0028]
在步骤140中，对于多个基因组区域中的每一个，将对应的量归一化以获得对应的密度。可以许多方式进行归一化，例如通过将基因组区域的对应量除以其中存在该基因组区域的染色体的对应量的总和或除以整个基因组的对应量的总和。归一化的输出量，即对应的密度，允许对来自不同基因组区域，例如来自不同染色体或样品的对应量进行比较。对应的密度可具有许多不同的解释，如样品中来源于基因组区域的dna片段数目的分率。在一些实施方案中，当可以直接地对对应量进行比较时，不需要进行归一化，并且对应的密度可以等于对应量。
[0029]
在步骤150中，对于多个基因组区域中的每一个，将对应的密度与参考密度进行比较以鉴定对应的密度与参考密度是否存在统计学上的差异。可利用来自该样品的数据中的一些或全部来获得基因组区域的参考密度。参考密度可以等于例如染色体或整个基因组的对应密度的平均值。还可以利用来自其它样品的数据来计算参考密度。举例来说，可从各自怀有胎儿的多名女性受试者获得样品，并且可以同样的方式对每一个样品进行步骤110-140。具体基因组区域的参考密度因此是来自于所有样品或样品的子集的该区域的对应密度的平均值。在一些实施方案中，可存在独立的数据以证实一个子集的女性受试者各自怀有没有基因组微扩增或微缺失的胎儿，并且因此，参考密度可以被计算以反映不存在微扩增或微缺失的情况。
[0030]
鉴于以上内容，参考密度对于多个或所有基因组区域来说可以是(取决于它的计算方式)相同的，或者对于每一个基因组区域来说是不同的值。
[0031]
鉴定对应的密度与参考密度是否存在统计学上的差异(即，所述差异是否具有统计学显著性)可能需要已知用于计算参考密度的对应密度的分布。举例来说，如果一个基因组区域的参考密度是一组对应密度的平均值，则可以计算该组的标准差。可使用该基因组区域(例如所关注的样品)的一个对应密度、参考密度、和标准差，进行统计检验。这种统计检验可以是z-检验或斯图登氏t-检验(student's t-test)，并且可提供从与参考值相同的
分布得到对应密度的概率。如果这一概率降到低于阈值，那么对应的密度与参考密度之间的差异可以被认为具有统计学显著性。或者，如果所述差异超过临界值，如标准差的一定倍数，那么该差异可以被认为具有统计学显著性。
[0032]
优选地，对于所有基因组区域，对应密度与参考密度的比较以及对它们之间的统计学差异的鉴定均是采用相同的标准进行的。在这个步骤中必须要谨慎注意的是，如果对于基因组区域来说存在统计学差异，那么对应的密度是高于还是低于参考密度。
[0033]
除了平均值和标准差外，还可对于一组对应的密度计算其它参数以确定参考密度并且确定对应密度与参考密度是否存在差异。无限制地，这些参数包括中值、众数、百分位数、方差、倾斜、峰度和其它参数。除了z-检验和t-检验外，还可使用其它统计检验来实现这些目的，例如使用上述参数作为输入的检验。
[0034]
在步骤160中，确定被鉴定为具有与参考密度存在统计学差异的对应密度的基因组区域中的任一个与被鉴定为这样的其它基因组区域是否是连续的。可对染色体的一部分、整个染色体、多个染色体、或者整个基因组进行这一确定，这依据专业人员所关注的。在此，如果基因组区域对应于参考基因组序列的连续部分，那么它们是连续的。在优选的实施方案中，如果基因组区域对应于同一染色体，那么它们只可能是连续的。在此所关注的主要是连续基因组区域的组，其中每一个区域的对应的密度与参考密度存在统计学差异并且所有差异都是沿同一方向。也就是说，在所述组内，所有的对应密度均高于(即，在统计学上高于)参考密度，或者所有的对应密度均低于(即，在统计学上低于)参考密度。这样的基因组区域的组的实例是三个连续的区域，其中对于所有三个区域，对应密度与参考密度相比存在统计学差异并且更高(即，在统计学上更高)。具有在统计学上高于或低于参考密度的对应密度的连续基因组区域分别与微扩增或微缺失一致。在一组中更大数目的连续基因组区域与更大的微扩增或微缺失一致。
[0035]
在步骤170中，当至少n(n为等于或大于2的整数)个被鉴定为具有在统计学上高于参考密度的对应密度的第一基因组区域是连续的时，将第一连续基因组区域鉴定为微扩增。
[0036]
在步骤180中，当至少n个被鉴定为具有在统计学上低于参考密度的对应密度的第二基因组区域是连续的时，将第二基因组区域鉴定为微缺失。
[0037]
iii.确定异常区域
[0038]
为了利用本发明检测基因组微扩增和微缺失，将参考基因组序列划分为基因组区域或
‘
区段’。来自于样品的dna片段根据序列与每一个区域相关，并且确定每一个区域中的dna的密度。具有异常高或异常低的密度的区域被认为是
‘
异常的’，并且可对应于微扩增或微缺失。下面对用于鉴定异常基因组区域以及确定它们是对应于微扩增还是对应于微缺失的标准和程序进行论述。
[0039]
a.区段和量
[0040]
本文中所使用的基因组区域的尺寸可以是各种尺寸，根据专业人员的需要并且适合于所采用的测序方法。更小的区域允许更大的对异常密度的分辨率，但需要更大数目的dna片段(因此需要更大的样品)而以统计确定性鉴定异常密度。相反，更大的区域提供更差的分辨率，但需要更少数目的dna片段。在优选的实施方案中，使用相同尺寸的基因组区域以允许跨越染色体和基因组对密度进行比较和归一化。基因组区域可具有例如约100kb、
200kb、500kb、1mb、2mb、5mb或10mb的尺寸。在一些实施方案中，这些基因组区域是非重叠的和/或是相邻的(如下所述)，尽管在一些情况下，在区域之间可能存在重叠或空位，例如以简化对存在于区域边缘附近的序列标签进行的分析。
[0041]
可利用本领域已知的大规模并行测序技术对dna片段进行测序。在一些实施方案中，利用illumina的边合成边测序方法进行测序。已知这种方法根据正被测序的dna片段的gc含量以不一致的效率产生序列标签。因此，可能期望的是，校正针对基因组区域所确定的dna的对应量，所述基因组区域在从数百个到数千个碱基对的规模上具有可变水平的gc含量，从而导致这种测序失真。当使用1mb基因组区域时，可以首先将每一个染色体划分成100kb区段并且可进行局部加权回归散点平滑法(loess)以校正序列标签数目中的gc相关偏差[20]。然后，可将100kb区段合并成1mb基因组区域，以使得经过gc校正的密度可以被用于所有随后的计算。
[0042]
在一个实施方案中，可以基因组表现(gr
x-y
)的形式来计算基因组区域(例如，1mb区段)中的dna密度，其中x和y表示所述区域的起点基因组坐标和终点基因组坐标。来源于每一个区域的序列读数(或标签)数目为rc
x-y
，并且利用这一方程式计算gr
x-y
[20]：
[0043][0044]
其中rc
总
为总读数计数。
[0045]
除以rc
总
是将基因组区域内dna的对应量归一化以获得对应密度的一个实例。在该方法的其它实施方式中，不确定比率而在基因组区域之间直接地对rc
x-y
的值进行比较。这在将样品之间的rc
总
控制为相同时可以进行。
[0046]
b.与参考的比较
[0047]
如上所述，可以将在基因组区域中的对应密度与参考密度进行比较。可以若干不同的方式获得参考密度，例如在多个基因组区域的范围内求出对应密度的平均值，或求出从多个样品获得的相同基因组区域的对应密度的平均值。为了确定在基因组区域中的对应密度是否异常，利用对应的密度和参考密度计算出参数，然后将该参数与临界值进行比较。所述参数的实例包括这两个值之间的差值、该差值的绝对值、或者比率。在适当时可以对这些值进行处理，例如乘以标量，以获得该参数并且允许与临界值进行有意义的比较。
[0048]
c.临界值
[0049]
在一些实施方案中，由对应的密度和参考密度所计算的参数是否超过临界值可以表明对应的密度是否异常(具有统计学差异)。该参数的符号可表明对应的密度是异常高还是异常低，分别提示(但并非具有决定性)微扩增或微缺失。举例来说，如果所述参数是对应密度与参考密度之间的简单差值，则异常高和异常低的对应密度分别对应于所述参数的正号和负号。因此，临界值可以是正的或负的，并且对于超过临界值的参数可被理解成意指该参数超过正临界值或者降到低于负临界值。类似地，如果所述参数是比率，则如果所述参数大于一定值或者小于该值的倒数，那么它可能超过临界值。可以专业人员所需的任何方式选择临界值。举例来说，它可以是任意的，或者可被选择以确保以所需水平的统计确定性对异常密度进行确定。
[0050]
在一个实施方案中，在z-检验中将所述参数与临界值进行比较。z-检验是一种统
计检验并且产生z-分数，该z-分数是就分布的宽度而言一个数与分布的平均值的差距的量度。在此，用于比较对应密度与参考密度的参数是这些密度之间的差值除以用于计算参考密度的值的标准差。
[0051]
以示范方式，从具有正常胎儿染色体核型的八名怀孕(单身)女性受试者获得生物样品，并且使用每一个样品计算单个1mb基因组区域的对应密度。对于给定的基因组区域x-y，将来自样品的对应密度求平均(即，计算平均值)以获得参考密度平均gr
x-y-参考
，并且计算对应密度的标准差sd
x-y-参考
。然后，从所关注的另一名怀孕女性受试者获得测试样品，并且使用来自测试样品的数据计算区域x-y的对应密度(gr
x-y-测试
)。如下计算这一对应密度的z-分数，即z-分数
grx-y
：
[0052][0053]
然后将z-分数与临界值(例如3)进行比较。z-分数大于 3或小于-3分别表示来自测试样品的对应密度是异常高或异常低。为了使不同染色体之间的系统性样品间变异达到最小，对每一个染色体进行中值校正。因此，将对应于特定染色体的所有基因组区域的中值基因组表现用作基线。对于位于该特定染色体上的所有区域，使用与这一基线值之间的差值来计算z-分数。
[0054]
z-分数或者基因组区域中异常密度的任何其它量度可以对样品中胎儿dna的丰度是灵敏的。正如本领域已知的那样，孕妇的血液样品中显著百分比的无细胞dna是来源于胎儿。这一百分比已被观察到处在小于1％到超过20％的范围，这取决于妊娠时间和其它因素。在本文所述的方法中，序列标签是由样品中母体dna和胎儿dna这两者产生的。如果微扩增或微缺失存在于胎儿的基因组中，而不存在于母亲的基因组中，那么会观察到相应的一个或多个基因组区域中dna的密度存在相对小的变异，这是因为用于产生序列标签和确定密度的dna中的少数是胎儿的。相反，如果微扩增或微缺失来源于母体(即母体遗传)，那么它存在于胎儿和母亲这两者的基因组中，因此存在于样品中基本上所有的dna中。因此，将观察到dna密度存在更高的变异。(微扩增或微缺失不太可能存在于母体基因组中，而不存在于胎儿基因组中)。
[0055]
因此，可利用第二临界值来确定基因组区域中dna的对应密度的变异是否是母体遗传的。第二临界值通常大于用于鉴定胎儿基因组中的变异的临界值，并且需要对应密度与参考密度之间存在更大的或更具统计学显著性的偏差。当例如利用z-检验将对应密度和参考密度进行比较时，用作用于鉴定母体遗传的变异的临界值的z-分数可以是用于鉴定母体基因组中不存在的变异的临界值的数倍。在一些实施方案中，第二临界值对应于10、20或更大的z-分数。
[0056]
与较低的变异相比，较高的dna密度的变异，如由母体遗传的微扩增或微缺失所造成的变异，则需要较少的dna和较少的序列标签来以相同水平的确定性进行鉴定。因此，本文中所公开的用于检测胎儿基因组异常的方法的灵敏度取决于样品中胎儿dna的百分比(胎儿％)，如下所述。在异常基因组区域中序列标签的表现不足或过度表现的程度与该区域的胎儿dna百分比呈线性相关[4]。在一些实施方案中，利用以下方程式计算胎儿dna百分比：
[0057][0058]
d.参考密度
[0059]
如上所述，将特定基因组区域中dna的对应密度与参考密度进行比较以确定对应密度是否异常。可以许多不同的方式，利用从一个样品或从多个样品所获得的数据来计算参考密度。在一个样品的情况下，参考密度可以是例如一组基因组区域的对应密度的平均值。这组可对应于染色体的一部分或全部、多个染色体、或者整个基因组。在多个样品的情况下，每一个样品通常是从不同的个体采集。基因组区域的参考密度可以是该区域或者一组区域的在个体之间平均计算的对应密度。在一些实施方案中，生物样品是从具有已知的正常胎儿染色体核型的怀孕女性受试者获得以确立反映不存在微扩增或微缺失的情况的参考密度。然后，可将参考密度与具有未知的胎儿染色体核型的测试受试者的对应密度进行比较。在一些实施方案中，多个(或所有)个体的胎儿染色体核型是未知的，并且在先前不知晓在这些个体的样品中可能存在的变异的情况下计算参考密度。
[0060]
对于不同的基因组区域，参考密度可以是相同的或不同的。举例来说，可对于染色体上或基因组中的所有基因组区域使用相同的值。或者，可将不同的值赋予用于每一个基因组区域的参考密度。参考密度无需由对应密度计算，如通过求出对应密度的平均值来计算，例如，它可以仅仅反映基因组区域的相对尺寸。如上所述，可针对失真，如不同染色体或基因组区域的序列标签的不均匀生成对参考密度进行校正。
[0061]
e.避免假阳性
[0062]
在发现基因组区域的对应密度是异常的(例如，在统计学上高于或低于参考密度)之后，如果该基因组区域与至少一个也是异常的其它基因组区域是连续的，那么可鉴定微扩增或微缺失。如上所述，对于所要进行的这种鉴定，连续区域的对应密度必须在同一方向上偏离参考密度。因此，微扩增对应于其中在每一个区域中对应的密度均异常高的连续的基因组区域，并且微缺失对应于其中对应的密度异常低的连续的基因组区域。
[0063]
根据用于比较基因组区域的对应密度与参考密度的方法，可能存在显著概率的是，当实际上不存在微扩增或微缺失时，该区域将具有异常的dna密度。因此，当确立了许多基因组区域并且对它们的对应密度进行评估时，一些区域可能会偶然地被简单地认为是异常的。需要连续的异常区域来鉴定微扩增或微缺失降低了假阳性，即错误地鉴定这类事件的概率。这种需要也将该方法的分辨率极限设定在一定倍数(例如2倍或3倍)的基因组区域的尺寸。举例来说，如果需要两个或更多个连续区域来鉴定微扩增或微缺失，那么用于1mb基因组区域的分辨率极限为2mb。
[0064]
可利用本领域已知的其它方法来验证利用本文所述的方法所鉴定的微扩增或微缺失。这些其它方法包括例如羊膜腔穿刺术和脐带穿刺术，并且可以是有创的或者包括流产的风险。使用多种方法对异常拷贝数进行验证可进一步降低假阳性的可能性。
[0065]
在本文中，如果两个或更多个基因组区域沿染色体或者在基因组参考序列中占据连续的序列位置而在它们之间或当中没有其它基因组区域，那么认为它们是连续的。在一些实施方案中，成对的连续区域在序列中彼此直接邻接，因此被认为是相邻的。两个区域之间的序列空位(例如，少数碱基对)排除了这些区域是相邻的，但不排除它们是连续的，只要
在本文中所公开的方法下该空位不被视作另一个基因组区域即可。在一些实施方案中，基因组区域是非重叠的，但可替代使用重叠的区域并且所述重叠的区域可以是连续的。专业人员可能希望确立并不相邻的或者重叠的基因组区域以集中在基因组的某些区域，以便简化数据分析或为了其它原因。
[0066]
iv.模拟分析
[0067]
检测微缺失或微重复的灵敏度和特异性可能会受不同参数的影响，所述参数包括样品中的胎儿％、被测序和比对的血浆dna分子的数目以及变异的尺寸。因此，可进行计算机模拟分析以确定：1)在现有的测序深度下检测微缺失/微重复(例如约3mb的尺寸)的灵敏度；以及2)进行分析以在特定的胎儿％(例如5％)下实现特定的灵敏度(例如95％/99％)所需的分子数目。
[0068]
在每一次模拟分析中，可根据所需的分辨率，例如3mb将整个基因组(3,000mb)划分为具有相同尺寸的区段。在一些实施方案中，对于亚染色体变异的检测，需要三个连续的区段具有在同一方向上与参考组的平均值相差》3倍的标准差(过度表现或者表现不足)的基因组表现。因此，区段尺寸将等于所需诊断分辨率的1/3。举例来说，需要1mb的区段尺寸来检测3mb的变异。可假定的是，由微缺失/微重复所覆盖的三个区段具有由于少数胎儿dna群体的影响所导致的异常基因组表现。在血浆中，可以按以下公式计算落在受影响的区域内的区段中的全部分子的预计比例(e)：
[0069][0070]
其中f为血浆中的胎儿dna百分比，
[0071]
d为变异中的染色体数的变化(对于微缺失，d等于-1，并且对于微重复，d等于 1)，以及
[0072]
t为整个基因组的区段的总数。
[0073]
可在假定具有如上所计算的预计的血浆表现的血浆dna分子的二项分布的情况下对例如1,000个正常案例和1,000个受影响的案例进行模拟。可以改变胎儿％、区段尺寸和被分析的分子总数以实现所需的目的。可利用r中的rbinom函数进行模拟(www.r-project.org/)。
[0074]
v.实施例
[0075]
本实施例提供了对人类胎儿dna和母体dna中的微扩增和微缺失的鉴定。
[0076]
a.数据分析的框架
[0077]
将illumina hiseq 2000测序仪上的流通池的一个泳道用于对6个测试案例和8个对照的每一个母体血浆样品进行分析。从每一个血浆dna样品对平均21100万(范围：17700万至23600万)个dna片段进行测序。这种测序产生平均每个案例14400万(范围：9600万至18000万)个可比对并且不重复的测序读数，这相当于单倍体人类基因组的4.81倍。
[0078]
为了获得血浆染色体核型，将整个基因组划分为2,687个1mb区段。将测试样品的每一个1mb区段的基因组表现与参考组的基因组表现进行比较。对于具有正常基因组表现的区域，所有1mb区段的z-分数的预计分布将接近于零。参考区间被限定为从 3到-3的z-分数。在这种参考区间下，在统计学上约0.3％的区段只是偶然将落在这个区间的外部。在对2,687个区段进行分析时，预计平均有8个区段只是偶然将落在参考区间的外部。因此，为了
减少假阳性呼叫，将另外的标准包括在内，所述标准只有当三个连续的1mb区段表现出处在参考区间外部并且在同一方向上的z-分数时才呼叫拷贝数变异。
[0079]
b.亚染色体拷贝数变异的检测
[0080]
利用circos图绘出了每一个案例的整个基因组中的所有1mb区段的z-分数[21](图2)。在测试样品中，这些1mb区段中有94.9％-98.7％显示出正常的表现。在只有当三个连续的区段显示出相同的变异时才呼叫拷贝数变异的上述标准下，在所有案例中准确地鉴定出拷贝数变异而不存在假阳性。
[0081]
图3和图4示出了显示出每一个案例的拷贝数变异的染色体的所有1mb区段的z-分数。对于案例01、02和03，在染色体22的q臂上的三个连续的1mb区段中检测出表现不足。这些案例是具有新生22q11.2微缺失的三个案例。对于案例04和05，在染色体22q上的三个连续的1mb区段中检测出过度表现。案例04是具有2.4mb的新生22q11.2微重复的案例。案例05是在同一区域中具有母体遗传的微重复的案例。对于案例05，由于母亲自身带有微重复，因此可以容易地在母体血浆中检测出这种变异。这由三个连续区段的极高的z-分数值(在39.7至71.7的范围)所支持。可以通过使用基于snp的方法，即相对突变剂量或相对单倍型剂量分析[10、11、22]对胎儿无创性产前检查进行进一步研究。就案例06而言，在染色体3的q臂上五个连续的1mb区段被检测出过度表现，并且在染色体4的q臂上31个连续的1mb区段被检测出表现不足，这对应于3q上的5mb重复和4q上的31mb缺失。对于所有案例，被检测出的拷贝数变异具有与通过阵列cgh、fish和/或qf-pcr所确认的尺寸相当的尺寸。就案例05而言，利用阵列cgh确认了由母亲携带的微重复。对于案例06，利用全染色体核型分析确认了由母亲携带的平衡易位。
[0082]
c.胎儿dna百分比
[0083]
将来自显示出表现不足或过度表现的区域的dna序列用于估计母体血浆中的胎儿％(图5)。对于怀有男性胎儿的三个案例(即案例02、03和04)，通过比较利用这种方法所计算的胎儿％与利用基于chr y的方法[4]所计算的胎儿％来验证这种方法。在这两种方法之间胎儿％值吻合(图5)。对于具有胎儿新生拷贝数变异的五个案例，胎儿％在9.2％至17.8％的范围内。对于案例05，通过微重复的基因组表现所估计的胎儿％为96.7％，从而表明几乎全部的循环dna均将带有这种变化。这一结果与母亲携带变异的这一事实相一致。
[0084]
d.诊断灵敏度的模拟分析
[0085]
使用计算机模拟来确定基于鸟枪法mps的无创性产前分子染色体核型分析的诊断灵敏度(图6)。在现有的约15000万个读数的测序深度下，当胎儿％为5％时，检测3mb染色体变异的诊断灵敏度将是约96％。当胎儿％达到6％时，灵敏度将增加到99％。为了检测更小尺寸的染色体变异，将需要对更多的血浆dna分子进行分析。图7示出了采用三个连续区段标准进行分析而以95％/99％的灵敏度实现3mb、2mb和1mb诊断分辨率所需的血浆dna分子的数目。为了实现95％的诊断灵敏度，需要对每一个区段中约42,000个分子进行分析。因此，需要被分析以在95％的诊断灵敏度下检测2mb和1mb微缺失/微重复的血浆dna分子的总数将分别是19200万和38000万。为了实现99％的诊断灵敏度，针对两种不同的分辨率，需要被分析的分子总数将分别是24000万和48000万。
[0086]
e.讨论
[0087]
在这项工作中，在全基因组水平上并且以3mb分辨率证实了对胎儿染色体微缺失
和微重复进行无创性产前检测的可行性。在5个案例中，检测出涉及到染色体3q、4q或22q的来源于胎儿的亚染色体缺失或重复。在第6个案例中，检测出染色体22q的来源于母体的微重复，正如由所看到的非常高的z-分数所证明。实际上，案例04和06代表了首次以无创方式从母体血浆检测出胎儿微重复。与peters等人[8]和jensen等人[9]的先前报道相比，这些结果代表了向前的重要一步，这些先前报道主要集中于检查一个或少量基因组区域中的拷贝数变异。本文中所呈现的数据清楚地证明了鸟枪法mps可以用于在全基因组规模上检测亚染色体拷贝数变异，换句话说，用于获得胎儿分子染色体核型。
[0088]
在所研究的案例中的三个案例中，在有创性程序之后获取母体血浆样品。在这些案例中胎儿dna百分比在9.2％至17.4％的范围内，这在之前由chiu等人[4]对于在有创性程序前所采集的样品所观察到的范围以内。类似地，虽然大部分的被研究的样品在超过妊娠期第20周时获取，但这些案例的胎儿dna百分比还是在很大程度上与在妊娠期更早期所获取的样品的胎儿dna百分比重叠。尽管如此，它仍可用于在使用在头三个月和中三个月早期在任何有创性程序之前所采集的样品进行的未来、前瞻性、大规模多中心研究中对这些结果进行验证。
[0089]
在一些实施方案中，经分析，诊断算法要求三个连续区段的z-分数均高于 3或者均低于-3来检测亚染色体拷贝数变异。这种算法要求可被检测到的拷贝数变异超过约3mb的连续段。实际上，正如由数据所表明，该算法能够检测出2.4mb的拷贝数变异(案例04和05)。
[0090]
达到这种诊断分辨率所进行的测序的深度比染色体三体测试所需的测序深度高得多。因此，与由染色体三体测试的至少一个供应商所进行的使用相同测序平台的12-plex鸟枪法测序相比，对于每一个案例，在illumina hiseq 2000测序仪的一条泳道中进行测序。在目前的测序深度以及由它所产生的3mb的诊断分辨率下，现行方案可以覆盖约20％的已知致病性拷贝数变体[23]。上文预测的是，将分别需要对24000万和48000万个血浆dna分子进行测序和比对从而以99％灵敏度将诊断分辨率延伸到2mb和1mb。在这些诊断分辨率下，母体血浆dna的鸟枪法mps预计将分别覆盖约50％和80％的已知致病性拷贝数变体[23]。随着大规模并行测序仪的通量的持续增加以及测序成本的随之下降，有可能的是，与这些测序深度相关的成本将在几年的时间内达到医疗服务提供人员可接受的水平。相对于先前所报道的使用每个样品数十亿个测序读数进行的来源于胎儿的单核苷酸变异检测法[10]，这种方法所需的测序量已有显著减小。成本的进一步降低可以来自于对带有致病性拷贝数变体的基因组区域的靶向测序，类似于已对于由母体血浆进行的来源于胎儿的单核苷酸变异检测所实现的那样[24、25]。最后，单分子测序的出现还预计将进一步提高这种方法的诊断准确率，这是因为不需要可能会使被测序的分子的基因组表现失真的扩增过程[26]。
[0091]
综上所述，已证实，通过母体血浆dna的鸟枪法mps获得无创性产前分子染色体核型是可行的。这种方法可以检测胎儿新生拷贝数变化、不平衡的易位和母体拷贝数变化。这些结果已进一步扩展了无创性产前诊断的诊断范围。总结来说，基于对母体血浆dna的mps分析的方法已被开发用于对全染色体非整倍体[3-7]、单基因病的亚染色体拷贝数变化和胎儿突变[10]进行产前检测。这一系列的无创性测试可以首先应用于对胎儿基因组异常和染色体异常进行筛选。通过无创性母体血浆dna测试所揭示的异常可以通过常规的有创性
产前测试进一步确认。当通过大规模前瞻性研究进行验证后，可以设想的是，无创性母体血浆dna测序可以提供对大范围的胎儿基因组和染色体异常进行的产前评估并且提供更安全的产前评估。
[0092]
f.材料和方法
[0093]
伦理学声明：该项研究是由香港中文大学-新界东医院联网临床研究伦理联席委员会(joint chinese university of hong kong-hospital authority new territories east cluster clinical research ethics committee)批准。孕妇是从香港(hong kong)的威尔斯亲王医院(prince of wales hospital)、广华医院(kwong wah hospital)和赞育医院(tsan yuk hospital)、以及首尔(seoul)的峨山医学中心(asan medical center)以书面知情同意书招募的。
[0094]
样品采集：对于案例01、02和03，在有创性程序后将母体外周血液样品采集到含有edta的管中(表1)。对于案例04、05和06，在进行任何有创性程序之前采集母体外周血液样品。在妊娠的12 3/7周至28 4/7周时抽取母体血液样品(图8)。
[0095]
在这六个测试样品中，有三个案例(案例01、02和03)存在胎儿新生22q11.2微缺失，有一个案例(案例04)存在胎儿新生22q11.2微重复(2.4mb)、并且有一个案例(案例05)存在母体遗传的22q11.2微重复(2.4mb)。还有如下的一个案例(案例06)，其中母亲具有t(3；4)(q29；q32)平衡易位并且发现胎儿具有3q29微重复(5.1mb)和4q32.1-q35.2缺失(32.9mb)。进行了全染色体核型分析，并且通过阵列比较基因组杂交(阵列cgh)[16]、荧光原位杂交(fish)或者荧光定量pcr(qf-pcr)与fish的组合来进一步确定胎儿染色体核型。
[0096]
样品处理和dna提取：将外周血液样品在4℃下以1600g离心10分钟，并且将血浆部分在4℃下以16000g再次离心10分钟[17]。如先前所述，利用qiaamp dsp dna血液迷你试剂盒(凯杰公司(qiagen))从1.8ml至8.4ml的母体血浆中提取无细胞dna[3]。如先前所述，通过靶向瘦素(lep)基因的实时pcr测定对所提取的血浆dna进行定量[18]。
[0097]
血浆dna测序：如先前所述，利用配对末端测序样品制备试剂盒(illumina公司)制备血浆dna的测序文库[19]。将13ng至20ng的所提取的血浆dna用于文库制备。通过12个循环的pcr使与接头连接的血浆dna富集。在具有truseq pe集群生成试剂盒(cluster generation kit)v3(illumina公司)的cbot克隆扩增系统(illumina公司)上进行集群生成。利用hiseq 2000测序系统(illumina公司)上的流通池的一个泳道以50bp
×
2的配对末端形式对每一个文库(测试样品和参考样品这两者)进行测序。
[0098]
序列比对和过滤：利用短寡核苷酸比对程序2(soap2)(http://http://soap.genomics.org.cn/)将配对末端读数与重复序列未被屏蔽的人参考基因组(ncbi build 36.1/hg18)进行比对。对于配对末端读数的每一个成员，允许最多2个核苷酸失配。在下游分析中仅包括两端均在正确的取向下与同一染色体进行比对且跨越≤600bp插入尺寸的配对末端读数。被定义为显示了人基因组中的相同的起点位置和终点位置的配对末端读数的重复读数也被去除。
[0099]
g.实施例总结
[0100]
胎儿dna存在于孕妇的血浆中。已利用母体血浆dna的大规模并行测序来以无创方式检测胎儿染色体三体21、18、13和所选择的性染色体非整倍体。已报道了描述了利用大规模并行测序从母体血浆对胎儿微缺失进行的检测的案例报道。然而，这些先前的报道具有
多态性依赖性或者采用局限于基因组的一个或少数的所选部分的统计分析。在本实施例中，报道了在整个基因组中利用母体血浆dna的大规模并行测序以3mb分辨率进行无创性产前染色体核型分析的程序。已使用这种方法对从6个案例获得的血浆进行分析。在5个案例中，已成功地从母体血浆检测出胎儿微重复或微缺失。具有胎儿微重复的两个案例代表了首次从母体血浆对这类变化进行的无创性产前检测。在剩下的案例中，血浆dna测序结果符合怀孕母亲是微重复的携带者。进行了模拟分析以确定需要被测序和比对以使无创性产前染色体核型分析的诊断分辨率提高到2mb和1mb的血浆dna分子数目。综上所述，通过大规模并行测序由母体血浆进行的无创性产前分子染色体核型分析是可行的并且将扩大无创性产前检查的诊断范围。
[0101]
vi.计算机系统
[0102]
本文中提到的任何计算机系统可使用任何合适数目的子系统。在图9中在计算机设备900中示出了这些子系统的实例。在一些实施方案中，计算机系统包括单个计算机设备，其中这些子系统可以是计算机设备的部件。在其它实施方案中，计算机系统可以包括多个计算机设备，每一个计算机设备均是子系统，具有内部部件。
[0103]
图9中所示的子系统经由系统总线975互连。示出了另外的子系统，如打印机974、键盘978、一个或多个存储器件979、连接到显示适配器982的监视器976以及其它子系统。与i/o控制器971连接的外围设备和输入/输出(i/o)器件可通过任何数目的本领域已知的装置，如串行端口977与计算机系统连接。举例来说，可以利用串行端口977或外部接口981(例如以太网、wi-fi等)将计算机系统900连接到广域网(如互联网)、鼠标输入器件、或者扫描仪。经由系统总线975的互连允许中央处理器973与每一个子系统进行通信并且控制来自系统存储器972或一个或多个存储器件979(例如固定磁盘，如硬盘驱动器或光盘)的指令的执行、以及子系统之间的信息交换。系统存储器972和/或一个或多个存储器件979可体现计算机可读介质。本文中所提及的任何数据可以从一个部件输出到另一个部件，并且可以被输出给用户。
[0104]
计算机系统可以包括多个相同的部件或子系统，这些部件或子系统例如通过外部接口981或者内部接口而连接在一起。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或设备可以通过网络通信。在这些情况下，一台计算机可以被认为是客户端并且另一台计算机可以被认为是服务器，其中每一台计算机可以是同一个计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包括多个系统、子系统、或者部件。
[0105]
应当理解的是，本发明的任何实施方案可以控制逻辑的形式，使用硬件(例如专用集成电路或者现场可编程门阵列)和/或使用计算机软件，用通用可编程处理器以模块化或集成方式来实施。本文中使用的处理器包括在同一集成芯片上的多核处理器、或者在单个电路板上或联网的多个处理单元。基于本文中所提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将知晓和理解利用硬件以及硬件与软件的组合实施本发明实施方案的其它方式和/或方法。
[0106]
本技术中所述的任何软件部件或功能可以由处理器所执行的软件代码的形式，利用任何合适的计算机语言，例如java、c 或者perl，采用例如常规的或面向对象的技术来实施。可将软件代码以一系列指令或命令的形式存储在计算机可读介质中以存储和/或传输，合适的介质包括随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、磁介质，如硬盘驱动器或软
parallel genomic sequencing of dna in maternal plasma),proc natl acad sci u s a 105:20458-20463。
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