一种双试剂钾检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于临床生化分析领域，具体涉及血清中钾离子检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.电解质钾、钠、钙、氯等为人体细胞组成一个较为恒定的理化环境，维持着人体的生命活动。人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是细胞内液的重要电解质。钾离子大部分(98％)存在于细胞内，少量存在于细胞外液，且浓度恒定。
3.钾离子在保持机体的正常渗透压及酸碱平衡、参与糖及蛋白代谢、保证神经肌肉的正常功能等方面具有重要作用。虽然血清钾测定实为细胞外液钾离子测定，但体内的钾离子经常不断地在细胞内与体液之间互相交换，以保持动态平衡。因此血清钾浓度的高低，在一定程度上也可间接地反映细胞内钾的水平。
4.血清钾是医学界公认的检验危急值项目，具有非常重要的临床意义。
5.血清钾测定方法主要有火焰光度法、离子选择电极法(ise)、酶法、放射性核素稀释-质谱法(id-ms)和中子活化法，其中决定性方法为放射性核素稀释-质谱法(id-ms)和中子活化法，国际临床生化联合会推荐的参考方法为火焰光度法。火焰光度法、放射性核素稀释-质谱法(id-ms)和中子活化法虽然结果准确，干扰因素少，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验和自动分析。
6.目前临床上测定钾应用较普遍的离子选择电极法、酶法各有缺点。离子选择电极法理想的情况是，每个电极都具有单离子选择性，使电极只对一种离子有反应。实际情况却不是这样，所有的离子选择电极都存在有干扰离子。况且，尽管能对离子特异性电极进行校正，但通常特异性仍不是绝对的，所以用电极法测得的结果也不是十分准确。而且测定成本也比较高，尤其是辅助材料及仪器比较昂贵。八十年代末，berry等建立的血清钾离子的酶学测定方法已用于临床实验室，其原理在于：许多离子都有激活酶的作用。钾离子的测定是通过钾依赖性丙酮酸激酶(pk)催化磷酸烯醇丙酮酸(pep)与二磷酸腺苷(adp)生成丙酮酸和三磷酸腺苷(atp)，再在乳酸脱氢酶(ldh)催化下，所生成的丙酮酸和nadh反应，生成乳酸和nad

，在340nm处吸光值下降与钾离子浓度呈正比。酶法检测血清钾离子的优点在于可以使用全自动生化分析仪，不需要专门的仪器和相应的耗材，因此，大大的降低了检测的成本。在国家药品监督管理局网站查询可知已经有数十个厂家的酶法钾试剂盒获得注册证。
7.需要说明的是，目前酶法检测血清钾离子一个重要的缺点是通常需要每天都进行定标，这表明试剂的稳定性存在不足，导致使用上的不便和校准品的消耗。
8.因此，改善酶法钾试剂的稳定性可提高检测方法的可靠性和便利性，使之更符合临床需求。


技术实现要素：

9.为克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种可以克服现有技术缺陷的酶
法血清钾离子检测试剂盒，以及应用该试剂盒测定血清钾离子含量的方法。本发明通过调整试剂1与试剂2的体积比到特定的范围内，获得的结果试剂的稳定性得到提升、无需每天定标，测定可在全自动生化分析仪上进行。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.第一方面，提供一种血清钾离子酶法检测试剂，其包含以下成分：
12.试剂1浓度缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液ph 8.2)200～300mmol/l磷酸烯醇丙酮酸(pep)3.3～5.0mmol/l穴合剂(15-冠醚-5)10～15mmol/l二磷酸腺苷(adp)3.15～5.0mmol/lα-酮戊二酸1.2～3.0mmol/lnadh0.35～1.0mmol/l谷氨酸脱氧酶(gldh)≥11u/ml丙酮酸激酶(pk)≥1.2u/ml稳定剂适量
13.试剂2浓度缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液ph 9.0)5～15mmol/l乳酸脱氢酶(ldh)≥65u/ml稳定剂适量
14.所述检测试剂使用时，试剂1和试剂2的体积比为4-9:6，被测样品与试剂1和试剂2的体积之和的比例为1:12-15，反应温度控制在34-40℃，反应时间控制在反应开始后第6～8分钟，反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测时设定主波长为340nm，副波长为405nm。
15.为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，试剂1和试剂2当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的0.5％(液体试剂)或者浓度在1～3mmol/l范围之内(固体试剂)。用作稳定剂的物质是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫基乙醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、碳酸盐、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、甘露醇或者丁二酸盐中的至少一种，但选择范围不受这些列举所限制。优选地，上述检测试剂中的稳定剂为乙二醇(0.5％，v/v)。
16.第二方面，提供一种基于上述试剂(丙酮酸激酶法)的酶法测定钾离子含量的方法，采用以下步骤进行：
17.(1)样品与试剂1混合：将被测样品与含有二磷酸腺苷、丙酮酸激酶的试剂1混合，由此使钾离子稳定并降低反应浓度和干扰离子浓度；
18.(2)加入试剂2，所述试剂2含有乳酸脱氢酶，其中试剂1与试剂2的体积比在特定的范围内，即4-9:6(试剂1：试剂2)；
19.(3)将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度变化，以钾离子浓度分别为2.5、3.4、4.3、5.2、6.1、7.0mmol/l的标准品稀释的标准浓度为横坐标、吸光度变化为纵坐标绘制标准曲线，对照标准曲线来测定样品中钾离子浓度。
20.优选地，被测样品与总试剂(试剂1 试剂2)的使用比例按体积控制在1:12-15，反应温度控制在34-40℃，反应时间控制在第6～8分钟，检测时设定副波长在405nm。
21.第三方面，提供上述试剂在制备测定血清中的钾离子的试剂中的应用。
22.本发明的有益效果：
23.本发明通过调整检测反应的试剂1与试剂2的体积比在特定的范围内，即4-9:6(试剂1：试剂2)，获得的结果试剂的稳定性得到提升、无需每天定标，测定可在全自动生化分析仪上进行。试剂的线性范围为2.5mmol/l～7.0mmol/l。
具体实施方式
24.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
25.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造厂商所建议的条件。
26.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.实施例1
28.试剂1含有缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液ph 8.2，250mmol/l)、磷酸烯醇丙酮酸(pep，3.8mmol/l)、穴合剂(15-冠醚-5，12mmol/l)、二磷酸腺苷(adp，3.6mmol/l)、α-酮戊二酸(1.8mmol/l)、nadh(0.6mmol/l)、谷氨酸脱氧酶(gldh，15u/ml)、丙酮酸激酶(pk，1.6u/ml)和乙二醇(0.5％，v/v)；试剂2含有缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液ph 9.0，10mmol/l)、乳酸脱氢酶(ldh，80u/ml)和乙二醇(0.5％，v/v)。
29.在全自动生化分析仪(东芝tba-40fr)上，设置参数如下：反应温度37℃，主波长：340nm，副波长：405nm，速率法(rate)，样本与r1在37℃保温5分钟后，加入r2，1分钟后记录吸光度a1，反应2分钟后，记录吸光度a2。计算两点间的吸光度变化，对照标准反应曲线测得样本中的钾离子含量。将上述酶法血清钾检测试剂盒开盖置于生化分析仪试剂仓，每天检测复溶后分装并-20℃保存的朗道质控血清样本3次，过程中仅第一天进行定标。计算每天的均值及与第1天均值的相对偏差。被测样品：试剂1的体积＝15:84，试剂1：试剂2的体积＝4:6，数据如下表1(单位：mmol/l)。
30.表1
[0031][0032]
实施例2
[0033]
除了试剂1、试剂2比例不同，采用实施例1相同的试剂、样本、样本量、检测仪器，被测样品：试剂1的体积＝15:105，试剂1：试剂2的体积＝6:6，数据如下表2(单位：mmol/l)。
[0034]
表2
[0035][0036]
实施例3
[0037]
除了试剂1、试剂2比例不同，采用实施例1相同的试剂、样本、样本量、检测仪器，被测样品：试剂1的体积＝15:126，试剂1：试剂2的体积＝9:6，数据如下表3(单位：mmol/l)。
[0038]
表3
[0039][0040][0041]
实施例4
[0042]
试剂的分析特异性检测：采用与实施例1相同的试剂、试剂量、样本量、检测仪器，用血红蛋白、甘油三酯、胆红素来考察评估钾检测试剂的分析特异性。
[0043]
实验方法：分别配制不同浓度的干扰物质标准溶液，将其添加到基质血清中，标准溶液的加入量为基质血清体积的10％，同时检测添加干扰物质的基质血清(c1)和不添加干扰物质的基质血清(c2)，按公式(a)、(b)、(c)进行计算：
[0044]
加入的标准液终浓度＝加入的标准液浓度
×
加入标准液量/(基础血清量 加入标准液量)
………………………………………………………………………
(a)
[0045]
干扰浓度＝加标准液样品(试验样品)测得浓度c1－未加标准液样品(基础样品)测得浓度c2
………………………………………………………………
(b)
[0046]
相对干扰浓度＝干扰浓度/基质血清浓度
×
100％
……………………
(c)
[0047]
接受标准：相对干扰浓度≤5％。
[0048]
(1)血红蛋白的干扰实验
[0049]
分别配制3、6、9、12、15g/l不同浓度的血红蛋白标准溶液，将其添加到基质血清中，加入量为基质血清体积的10％，作其对试剂检测血清的干扰实验，结果见下表4：
[0050]
表4.血红蛋白对检测的干扰实验结果数据表
[0051][0052]
实验结果表明：当血红蛋白浓度≤1.2g/l时，可以忽略血红蛋白对本方法的干扰，因此在选样过程中，应避免使用溶血样本，特别是严重溶血的样本。
[0053]
(2)甘油三酯的干扰实验
[0054]
分别配制15、20、25、30、35mmol/l不同浓度的甘油三酯标准溶液，将其添加到基质血清中，加入量为基质血清体积的10％，作其对试剂检测血清的干扰实验，结果见下表5：
[0055]
表5.甘油三酯对检测的干扰实验结果数据表
[0056][0057]
实验结果说明：当甘油三酯含量≤3mmol/l时，基本上可以忽略甘油三酯对本方法的干扰。
[0058]
(3)胆红素的干扰实验
[0059]
分别配制0.25、0.50、0.75、1、1.25mmol/l不同浓度的胆红素标准溶液，将其添加到基质血清中，加入量为基质血清体积的10％，作其对试剂检测血清的干扰实验，结果见下表6：
[0060]
表6.胆红素对检测的干扰实验结果数据表
[0061][0062][0063]
实验结果表明：当胆红素浓度≤100μmol/l时，基本上可以忽略胆红素对本方法的干扰。
[0064]
(4)干扰实验结论
[0065]
当样品中血红蛋白浓度≤1.2g/l，甘油三酯含量≤3mmol/l，胆红素浓度≤100μmol/l试剂的检测结果基本不受影响。
[0066]
实施例5
[0067]
试剂的线性范围：用标准物质稀释得到浓度为线性范围上、下限的高、低浓度样品并按不同比例混合成6个稀释浓度(xi)，其中高浓度样本所占比例以20％幅度由0递增至100％。采用与实施例1相同的试剂、试剂量、样本量、检测仪器，对每一稀释浓度样本平行测试3次，分别求得测定均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程和线性相关系数r。用稀释浓度(xi)代入求出线性回归方程，计算yi估计值；按公式(d)计算yi与yi估计值的相对偏差，结果见下表7(单位：mmol/l)：
[0068]
线性相对偏差＝︱y
i-yi估计值︱/yi估计值
…………………………………
(d)
[0069]
表7
[0070][0071]
结果表明，2.5mmol/l～7.0mmol/l范围内的线性相关系数r＞0.990，线性相对偏差＜5％，因此，试剂的线性范围可定为2.5mmol/l～7.0mmol/l。
[0072]
对比例1
[0073]
除了试剂1、试剂2比例不同，采用实施例1相同的试剂、样本、样本量、检测仪器，被
测样品：试剂1的体积＝15:150，试剂1：试剂2的体积＝15:6，数据如下表8(单位：mmol/l)。
[0074]
表8
[0075][0076]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。