一种能够抑制PCSK9表达的分子构造及药物组合物的制作方法

一种能够抑制pcsk9表达的分子构造及药物组合物
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术旨在获得美国专利申请号为63/134,562(专利名称：compositions and methods for inhibiting expression of pcsk9)的权益和优先权，该专利申请日期为2021年1月6日，其全文以引用方式并入本文中。
技术领域
3.本发明具体涉及一种能够抑制pcsk9表达的分子构造及药物组合物。


背景技术：

4.前蛋白质转化酶枯草杆菌素9(pcsk9)
5.前蛋白转化酶枯草杆菌素9(pcsk9)是哺乳动物丝氨酸蛋白酶家族的第9个成员，丝氨酸蛋白酶是一组蛋白转化酶(pc)，可将无活性的分泌前体裂解成生物活性蛋白和多肽(赛义达等，2003，美国科学院院刊；100：928
–
933)。pcsk9于2003年首次在初级小脑神经元中被发现，其mrna水平在凋亡过程中表达上调(蒋等，2001；赛义达等，2003)，因此最初被称为调节神经凋亡的转化酶-1(narc-1)。pcsk9主要是与ldl相作用(科先科等，2013；费里耶等，2016a；伯尼普等，2020)。pcsk9已经被证明在胆固醇代谢、胆固醇生物合成酶和低密度脂蛋白受体(ldlr)中有重要作用。在体内小鼠模型中，pcsk9的mrna表达水平可以被敲低(麦克斯韦kn，2003，脂肪研究杂志，44：2109-2119)和上调(霍尔顿jd，2003，美国科学院院刊；100：12027-12032)。一些过表达研究表明，pcsk9可以控制ldlr水平，从而控制肝脏摄取ldl的作用(麦克斯韦kn，2004，美国科学院院刊；101：7100-7105；本杰明s等，2004，生物学与化学杂志；279：48865-48875；帕克sw，2004，生物学与化学杂志；279：50630-50638)。
6.pcsk9最显著的作用是与肝脏中低密度脂蛋白受体(ldlr)的相互作用(阿布-法德勒等，2003，自然遗传学；34：154-156)。当带有pcsk9的ldl颗粒与ldlr结合时，pcsk9的催化结构域与ldlr的表皮生长因子样重复a(egf-a)结构域相互作用。当复合物被内吞时，内涵体的低ph增强了pcsk9/ldlr的亲和力，pcsk9阻止了与受体回收相关的ldlr开放延伸构象。相反，pcsk9/ldlr复合物被运送到溶酶体进行降解，导致表面ldlr减少，血浆胆固醇水平升高(赛义达等，2003；本杰明等，2004；波里尔等，2006；洛-苏尔多等，2011)。因为pcsk9主要通过与ldlr结合、并因为这种相互作用诱导ldlr降解而从血浆中清除，所以血浆中pcsk9、ldlr和ldl-c水平的调控是紧密相关的(塔韦里等，2013)。
7.胆固醇水平偏高，特别是低密度脂蛋白(ldl》4.1mmol/l或160mg/dl)与心血管疾病风险增加直接相关。他汀类药物不能充分控制由肝脏低密度脂蛋白受体(ldlr)突变引起的严重高胆固醇血症，该突变会减少ldlr介导的ldl颗粒从血液中清除作用(戈尔茨坦jl等，生物学与化学杂志；1974，249：5153)。这种遗传疾病被称为家族性高胆固醇血症(fh)，这一病症也可能由载脂蛋白b突变引起的，载脂蛋白b是ldl颗粒的主要蛋白成分，有助于ldl颗粒与ldlr的结合。当pcsk9蛋白在胞吞过程中与装载了ldl的ldlr结合时，复合物被导向溶酶体进行降解，而装载了ldl的ldlr不与psck9结合时，ldlr会卸载ldl颗粒，然后返回
细胞表面。因此，功能获得性pcsk9突变会导致ldlr降解增加，从而减少了对血液中ldl颗粒的摄取。低密度脂蛋白胆固醇在血流中的积累可以加速动脉粥样硬化进展，并导致动脉粥样硬化损伤破裂引发心血管事件从而导致过早死亡。
8.2003年abifadel等发现pcsk9基因突变与常染色体显性高胆固醇血症(adh)相关。过去十年的主要发现揭示了以下几点：a.pcsk9的功能获得性突变是adh的一个原因；b.pcsk9的功能丧失性突变与低ldl-c水平和显著降低心血管风险有关。pcsk9的功能缺失突变已在小鼠模型中有研究(拉西德等，2005，美国科学院院刊；102：5374-5379)，并在人类个体中已完成该突变的鉴定工作(科恩等，2005，自然遗传学；37：161-165)。在这两种情况下，pcsk9的功能丧失均会导致总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的水平降低。一项对过去几十年数据的回顾性结果研究表明，丢失一个pcsk9副本可使ldlc水平降低，并增加风险受益保护，避免发展为心血管性心脏病(科恩等，2006，新英格兰医学杂志；354：1264-1272)。
9.在发现pcsk9功能缺失突变的积极作用后，两种针对pcsk9的全人源单克隆抗体被开发出：即由regeneron与赛诺菲合作开发的alirocumab(praluent)和安进(amgen)开发的evolocumab(repatha)。然而，抑制pcsk9并不能降低ldlr阴性纯合子fh患者的ldl-c水平。
10.sirna疗法治疗低密度脂蛋白和其他疾病
11.双链rna可以通过rna干扰(rnai)机制来抑制基因表达。小干扰rna(sirna)引发的rnai调控在治疗人类多种多样的疾病中显示出巨大的潜力，包含从癌症到其他传统的不能用药的疾病。onpattro(patisiran)核酸药已被批准用于治疗由遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性(hattr)引起的成年患者周围神经疾病(多神经病)。这是fda批准的首个基于sirna的药物，用于治疗由hattr引起的多发性神经病变患者。hattr是一种罕见的、使人衰弱的、且通常是致命的遗传疾病，其特征是周围神经、心脏和其他器官中异常淀粉样蛋白的积累。
12.此外，还发现三价-乙酰半乳糖胺(galnac)可通过与去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合，介导sirna高效靶向递送至肝细胞。由于asgpr的特性非常适合将大分子药物传递到肝细胞，因此可以使用asgpr靶向的galnac-sirna偶联物递送到肝脏中。特别具有优势的是，肝细胞在其细胞表面可以表达数以百万计的asgpr拷贝，它们以每10-15分钟的快速周期循环。这些特性使得基于galnac的递送系统非常有效。目前，fda批准上市的最新rnai治疗药物是alnylam公司的givlaari(givosiran)，用于治疗罕见的遗传性急性肝卟啉症(ahp)。该药可以结合和抑制氨基乙酰合成酶1(alas1)的mrna，从而减少这种疾病中的神经毒性中间体。在2020年11月19日，alnylam获得欧盟批准oxlumo
tm
(lumasiran)用于治疗所有年龄组1型原发性高草尿症。oxlumo是首个被批准用于ph1治疗的药物，也是唯一一种被证明可以降低导致ph1疾病进展中有害草酸水平的药物。
13.另一个sirna药物是2020年获欧洲法规批准的用于治疗高胆固醇血症的inclisiran(aln-pcssc；该药物是由alnylam制药公司开发，并授权给medicines公司，后来卖给诺华公司)。它可以与前蛋白转化酶枯草杆菌素9(pcsk9)的mrna序列结合并切割，pcsk9是降低低密度脂蛋白(ldl)胆固醇水平的靶点。有超过30个与rnai相关药物开发的临床试验正在进行。
14.因此，这种基因沉默机制正在彻底改变一种新的药物治疗方法的发展，用于治疗
因基因调控不当而导致的无法用药的疾病和紊乱。
15.已显示双链rna通过rna干扰(rnai)使基因表达沉默。短干扰rna(sirna)诱导的rnai调节显示了治疗多种人类疾病的巨大潜力，包括从癌症到其他传统药物无法治疗的疾病，但是将sirna输送至所需组织仍然存在问题。特别是，需要改进核酸药物对特定细胞类型或组织的靶向性，同时开发无毒的内涵体逃逸剂，如下文所述。
16.当前，已经使用了两种类型的用于核酸药物的有效递送方法。一种方法是使用包含多种成分的脂质的纳米颗粒(脂质体)。另一种方法是使用含有galnac分子的结合物靶向去唾液酸糖蛋白受体(“asgpr”)。
17.基于rna的治疗方法的主要挑战是，所有传递至细胞的途径最终都会导致内体逃逸。由于asgpr的特性非常适合将大分子药物传递到肝细胞，因此可以使用asgpr靶向的galnac-sirna偶联物，将aso和sirna传递到肝脏。特别是，肝细胞在其细胞表面表达数百万个asgpr拷贝，并以每10-15分钟的周期快速循环。这些特性使基于galnac的递送方法即使在一般研究假定的内体逸出率《0.01％的情况下也有效。相比之下，尚未实现aso或rna向其他组织的有效递送。没有其它配体-受体系统能够像asgpr那样，以如此高的水平表达受体，也不会以如此快的速度进入内涵体。实际上，大多数细胞表面受体的表达范围为每个细胞10,000
–
100,000个(或更低)，并且小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞作用通常每90分钟循环一次。参见juliano，《核酸研究》。44，6518
–
6548(2016)。
18.药物进入细胞后，内涵体逃逸仍然是一大问题，对于所有基于rna的治疗方法都是如此。一般需要通过开发新的化学方法和材料来增强内体逃逸，以靶向肝细胞以外的细胞或组织。小分子内溶菌剂(如氯喹)已被用于破坏或溶解内涵体，但在有效浓度下，这些药物始终会溶解细胞内所有类型的内涵体，从而导致巨大的毒性。
19.另一种内体逃逸方法是将内涵体溶解肽或分子直接与rna结合，这将严格限制其作用于含有rna治疗剂的内涵体。使用含有胆固醇或溶血性蜂毒素肽的双分子动态多偶联物(dpc)系统进行的各种逃脱内涵体的临床试验因毒性作用而终止。wooddell等人，《分子治疗》，21973
–
985(2013)；hou等人，《生物技术进展》，33，931
–
940(2015)


技术实现要素：

20.本发明所要解决的技术问题是提供使用具有增强治疗效益的干扰rna分子的组合物和方法。
21.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
22.本发明提供一种能够抑制pcsk9表达的分子构造及方法。所述的化学分子结构包括共价连接到(a)靶向部分和(b)治疗性核酸的肽对接载体(pdov)，其中所述治疗性核酸可以抑制pcsk9基因的表达。
23.本发明提供了使用具有增强治疗效益的干扰rna分子的组合物和方法。所述组合物和方法通过将靶向配体连接到所述化合物上，将治疗化合物(如sirna分子)靶向细胞/组织递送到实验对象。实验对象可能是动物或人类。
24.在一些实施例中，如本文所述的靶向配体可通过正交生物偶联方法接合到内涵体释放肽上。靶向配体可特别用于改善rnai分子向选定靶(例如肝脏)的递送。在其它实施例中，靶向配体允许将rnai分子靶向递送到其它组织中，例如皮肤和大脑中。
25.如本文所述的靶向配体可包括一个或多个靶向部分、一个或多个连接体。连接体通过点击化学、硫醇/马来酰亚胺化学或其他生物正交化学与sirna及靶向配体共价结合。优选的，连接体是亲水性的，并且可以是如水溶性柔性聚乙二醇(peg)，其足够稳定并且限制一个或多个靶向部分之间的潜在相互作用。临床研究证实peg具有安全性和相容性以用于治疗目的。在一些实施例中，连接体可以是聚(l-丙交酯)n(其中n＝5-20)，其中酯键对酶或水解上不稳定。
26.所述靶向配体可包括一个或多个靶向部分、一个或多个具有连接反应性连接部分的基团。它们通过点击化学、硫醇/马来酰亚胺化学或其他生物正交化学与sirna和靶向配体共价结合。连接体反应性连接部分包括但不限于硫醇马来酰亚胺键、由炔烃和叠氮化物反应形成的三唑键、以及由胺nhs酯键形成的酰胺。这些连接中的每一个都适合于共价连接靶向配体和治疗性化合物。
27.在一些实施例中，这里公开的靶向配体包括一个或多个靶向部分、一个或多个具有反应性连接部分的连接体。所述连接体包含硫醇部分或马来酰亚胺部分、羧酸或胺、叠氮基、炔基等。
28.在一些实施例中，本文公开的靶向特定rna化合物可通过rna的3'或5'末端直接偶联到内涵体释放对接肽。靶向配体(例如n-乙酰-半乳糖胺)也可以用一种兼容的方法与相同的对接肽结合。
29.在一些实施例中，本文公开的靶向特定rna化合物也可以通过如rna的3'或5'末端直接与靶向配体(例如n-乙酰半乳糖)偶联。在一些实施例中，rna可以包含一个或多个修饰核苷酸，例如3'-ome(甲氧基)、3'-f(氟)或3'-moe(甲氧乙基)。在一些实施例中，rna可以是rnai试剂，例如双链rnai试剂。在一些实施例中，本文公开的靶向配体与双链rnai试剂的正义链的5'或3'端或双链rnai试剂反义链的5'或3'端相连。靶向配体可选择性地连接到双链rna干扰试剂的正义链和反义链的3'/3’、3'/5'或5'/5'端。
30.靶向配体可经由例如双链rnai试剂的正义链的3'或5'末端处的磷酸盐、硫代磷酸酯或膦酸酯基团共价键合到rnai分子。
31.在一些实施例中，本文公开的靶向特异性rna化合物是针对pcsk9的mrna表达的特异性抑制化合物。
32.在一些实施例中，所述治疗性核酸包括sirna、反义寡核苷酸、mirna、适配体、诱饵寡核苷酸或cpg基序。
33.在一些实施例中，所述治疗性核酸是表1和表2中的一条sirna或多条sirna。
34.优选地，所述sirna分子为包括两个互补的单链寡核苷酸的双链结构，每个单链寡核苷酸的长度为10-29个碱基。
35.进一步优选地，所述单链寡核苷酸的长度为19-27个碱基。
36.优选地，所述核苷酸包括脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸，或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。
37.在一些实施例中，所述sirna分子包括至少一个在2’位置上经过化学修饰的核苷酸。
38.优选地，所述化学修饰的核苷酸是从2
’‑
羟基、2
’‑
o-甲基、2
’‑
氟基、2
’‑
o-甲氧乙基和2
’‑
o-烯丙基组成的集合中选择的：
[0039][0040]
进一步优选地，所述sirna分子包含一个或多个化学修饰的核苷酸，所述化学修饰包含硫代磷酸二脂修饰或二硫代磷酸二脂修饰。
[0041]
本发明还提供一种药物组合物，所述的化学分子结构和药学上可接受的载体。
[0042]
优选地，所述药物学上可接受的载体包括水和一种或多种盐类或缓冲液，所述药物学上可接受的载体选自由无水磷酸钾单碱性、氯化钠、七水磷酸氢二钠、葡萄糖和磷酸盐缓冲盐水组成的集合中的一种或多种。
[0043]
本发明还提供一种所述的药物组合物在降低受试者血清ldl胆固醇或治疗pcsk9基因相关癌症中的应用。
[0044]
优选地，所述对象是灵长类动物。
[0045]
进一步优选地，所述对象是人。
[0046]
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0047]
本发明的化学分子构造能够显著抑制pcsk9表达，并且药物发挥作用的浓度远低于现有技术中的其他药物，并且本发明的药物构造的细胞毒性低，能够有效地将活性成分传递到靶向细胞中，在偶合肽对接载体递送到细胞后，促进被捕获在细胞中的内涵体内的寡聚核酸的释放。
附图说明
[0048]
图1展示了galnac肽对接载体(g-pdov)的设计示意图。三价半乳糖苷被共价偶联到一个分子对接位点a上，寡核苷酸或sirna分别与另一个或两个分子对接位点b共价结合。
[0049]
图2显示了肽对接载体(pdov)的设计：它有一个(hnkm)oxpzq式的多肽骨架，且该多肽骨架具有多个组氨酸(h)、赖氨酸(k)重复单元和多个功能单元x(氨基酸或功能连接体)，其中n＝1-10，m＝1-10，o＝1-10，p＝1-5，q＝1-5。hk重复单元已被证明具有良好的细胞穿透能力并可以促进内涵体释放。赖氨酸或多个功能单位x及z作为配体偶联的对接位点，同时z作为寡核苷酸通过不同的共价键偶联的对接位点。例如，位点
①
将只能在配体，如galnac或其他靶向配体的存在下反应。
③
号位点只能与寡核苷酸和sirna结合。
[0050]
图3为pdov的分子结构。pdov是一种细胞穿透/内涵体释放的多肽，且该多肽结构中插入了多个偶联结合位点x和z。x位点用于结合靶向配体，z位点用于结合多个寡核苷酸或核酸。pdov的一些结构示例包括：a代表多肽序列k、r、h、hh、hhh、hhhh、hhk、hhhk或其他短肽；b代表多肽序列k、r、h、hh、hhh、hhhh、hhk、hhhk或其他短肽，其他氨基酸或结合物；d代表寡核苷酸、sirna、mrna、核酸适配体；r
l
代表配体；rs代表寡核苷酸的连接体。
[0051]
图4显示了一个pdov结构示例，包含一个或两个寡核苷酸位点和一个配体偶联位点。
[0052]
图5显示了第二代pdov的结构示例，包含两个寡核苷酸位点和一个多价配体偶联
位点。
[0053]
图6显示了一个pdov的替代结构，包含两个寡核苷酸位点和多配体偶联位点。配体可以被逐一偶联结合到pdov骨架上。
[0054]
图7显示了偶联位点连接方式的选择。化学基团rs代表一个类似“键”的反应基团，其将pdov多肽载体与寡核苷酸偶联结合。该反应基团可以是胺、肼、n-羟基琥珀酰亚胺、叠氮、炔、羧酸、硫醇、马来酰亚胺或者其他已知的化学反应基团。
[0055]
图8为连接反应位点的代表性示意图。
[0056]
图9显示了偶联结合物rs-linker2-sirna中的linker2(连接体)是多肽和偶联结合位点之间的化学间隔物，允许偶联结合位点附着在linker的末端。linker2可以是脂肪链或聚乙二醇链，也可以是其它疏水脂质或亲水链。末端基团2是与sirna末端化学结合的反应部位。
[0057]
图10显示了配体偶联位点连接选择的示例。用于配体接合r
l
的连接可以从图11中选择。
[0058]
图11为r
l galnac分子示例：单价galnac分子、二价galnac分子和三价galnac分子。偶联位点可以是马来酰亚胺/硫醇或者可以从图9所示的基团2列表中选择。
[0059]
图12显示了sirna-pdov-ligand(配体)化合物1结构的一个典型示例。
[0060]
图13显示了sirna-pdov-ligand(配体)化合物2结构的一个典型示例。
[0061]
图14显示了pcsk9双sirna-pdov-ligand(配体)化合物3结构的一个典型示例。
[0062]
图15.未修饰pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。体外实验在hepg2细胞中进行，12孔板，每孔1
×
105细胞，sirna最终浓度为50μm。转染时间为24小时。本次实验设计中有11个样本，加上一个ns阴性对照，没有空白对照。qrtpcr：hprt(作为内参对照)、pcsk9引物(f r，每个引物20μm，每个反应加0.2μl)和探针(10μm，每个反应加0.4μl)。与lipo ns对照相比，所有9个pcsk9 sirna都显示出显著的基因沉默现象。
[0063]
图16.pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。体外实验在hepg2细胞中进行，12孔板，每孔1
×
105细胞，转染时间为24小时，各sirna最终浓度见图16。。本次实验设计中有7个样本，加上一个ns阴性对照，没有空白对照。qrtpcr：hprt(作为内参对照)、pcsk9引物(f r，每个引物20μm，每个反应加0.2μl)和探针(10μm，每个反应加0.4μl)。与lipo ns对照相比，pcsd3 sirna显示出显著的基因沉默现象。
[0064]
图17.pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。体外实验在hepg2细胞中进行，12孔板，每孔1
×
105细胞，转染时间为24小时，各sirna最终浓度见图17。本次实验设计中有7个样本，加上一个ns阴性对照，没有空白对照。qrtpcr：hprt(作为内参对照)、pcsk9引物(f r，每个引物20μm，每个反应加0.2μl)和探针(10μm，每个反应加0.4μl)。与lipo ns对照相比，pcs48 sirna都显示出显著的基因沉默现象。
[0065]
图18.pcsk9 sirna连续稀释后的基因沉默效率研究。体外基因沉默实验在hepg2细胞中完成，12孔板，每孔2
×
105细胞。sirna最终使用浓度为10nm，10
×
稀释(如10nm、1nm、0.1nm、0.01nm)，细胞转染孵育24小时。pcsk9：hprt引物的多重pcr条件比率为4:1(800nm：200nm)。
[0066]
图19.修饰后的pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。hepg2细胞：12孔板，每孔2
×
105细胞，转染时间为24小时。30ng cdna置于8.2μl体系中。pcs sirna转染浓度：10nm、1nm、
0.1nm、0.01nm，10
×
连续稀释。lipofectamine rnai max 2μl/稀释在98μl opti-mem中；sirna稀释于100μl的opti-mem中；然后将两者混合在一起并孵育15分钟。多重pcr被用于检测，hprt探针(浓度10μm，加0.4μl)。hprt引物(f r，每管20μm)，0.2μl(最终使用浓度200nm)。pcs探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。pcs引物(f r，每管20μm)，0.8μl(最终使用浓度800nm)。taqpath 2
×
预混液使用量为10μl。
[0067]
图20.修饰后的pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。hepg2细胞：12孔板，每孔2
×
105细胞，转染时间为24小时。30ng cdna置于8.2μl体系中。pcs sirna转染浓度：10nm、1nm、0.1nm、0.01nm，10
×
连续稀释。lipofectamine rnai max 2μl/稀释在98μl opti-mem中；sirna稀释于100μl opti-mem中；然后将两者混合在一起并孵育15分钟。多重pcr被用于检测，hprt探针(浓度10μm，加0.4μl)。hprt引物(f r，每管20μm)，0.2μl(最终使用浓度200nm)。pcs探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。pcs引物(f r，每管20um)，0.8μl(最终使用浓度800nm)。taqpath 2
×
预混液使用量为10μl。
[0068]
图21.修饰后的pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。hepg2细胞：12孔板，每孔2
×
105细胞，转染时间为24小时。30ng cdna于置8.2μl体系中。pcs sirna转染浓度：10nm、1nm、0.1nm、0.01nm，10
×
连续稀释。lipofectamine rnai max 2μl/稀释在98μl opti-mem中；sirna稀释于100μl opti-mem中；然后将两者混合在一起并孵育15分钟。多重pcr被用于检测，hprt探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。hprt引物(f r，每管20μm)，0.2μl(最终使用浓度200nm)。pcs探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。pcs引物(f r，每管20μm)，0.8μl(最终使用浓度800nm)。taqpath 2
×
预混液使用量为10μl。
[0069]
图22.修饰后的pcsk9 sirna的基因沉默效率研究。hepg2细胞：12孔板，每孔2
×
105细胞，转染时间为24小时。30ng cdna于置8.2μl体系中。pcs sirna转染浓度：10nm、1nm、0.1nm、0.01nm，10
×
连续稀释。lipofectamine rnai max 2μl/稀释在98μl opti-mem中；sirna稀释于100μl opti-mem中；然后将两者混合在一起并孵育15分钟。多重pcr被用于检测，hprt探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。hprt引物(f r，每管20μm)，0.2μl(最终使用浓度200nm)。pcs探针(原液浓度10μm，加0.4μl)。pcs引物(f r，每管20μm)，0.8μl(最终使用浓度800nm)。taqpath 2
×
预混液使用量为10μl。
[0070]
图23为人的前蛋白转化酶枯草杆菌素9(pcsk9)的信使rna(mrna)转录变异体1的序列(nm_174936.4)。
[0071]
图24.实施例2中主要产物azido-pdov2的氢谱图(d2o,400mhz)。
具体实施方式
[0072]
下面将更详细地描述本发明的这些内容和其他方面的内容。
[0073]
定义：
[0074]
如本文所用，“寡核苷酸”是指长度小于100个核苷酸(例如小于50，小于30或小于25个核苷酸)的化学修饰或未修饰的核酸分子(rna或dna)。它可以是sirna、microrna、抗microrna、microrna模拟物、dsrna(双链rna)、ssrna(单链rna)，适体，形成三链体的寡核苷酸，适体。在一个实施方案中，寡核苷酸是rnai试剂。
[0075]
如本文所用，“sirna分子”或“rnai分子”是双链寡核苷酸，即短的双链多核苷酸，其在将分子引入细胞后干扰细胞中基因的表达。例如，sirna分子靶向并结合单链靶rna分
子中的互补核苷酸序列。按照惯例，当sirna分子被特定核苷酸序列识别时，该序列是指双链体分子的有义链。可以通过本领域已知的技术，对包含该分子的一种或多种核糖核苷酸进行化学修饰。除了在其一个或多个核苷酸的水平上被修饰之外，寡核苷酸的主链也可以被修饰。其他修饰包括使用小分子(例如糖分子)、氨基酸、肽、胆固醇和其它大分子偶联到sirna分子上。
[0076]“肽对接载体(pdov)”指的是一个具有特定序列的合成多肽，包含多个允许与一个或多个配体偶合或者与一个或多个寡聚核酸偶合的偶合点。它包含诸如疏水链或者ph敏感残基等官能团，这些官能团可以在偶合肽对接载体递送到细胞后，促进被捕获在细胞中的内涵体内的寡聚核酸的释放。
[0077]“表达的抑制”是指来自靶基因的蛋白质和/或mrna表达产物的水平不存在或显著降低。抑制不必是绝对的，可以是部分抑制，足以产生由于施用本发明的sirna分子而导致可检测或可观察到的变化。抑制可以通过分析细胞内sirna分子所靶向基因对应的mrna和/或蛋白质产物水平的降低来测量，与无sirna分子处理的细胞作为比较，可能低至10％、50％或绝对(即100％)抑制。抑制作用可以通过检查细胞或生物体的外在性质，即定量和/或定性表型来确定，并且还可以包括在施用本发明的sirna分子后评估病毒载量。
[0078]
sirna分子可以以最小的脱靶事件直接靶向活性基因。“脱靶事件”是指非sirna分子靶标的特定核酸的表达受抑制而显着降低。对于hbv感染，最小的脱靶事件提供了一个独特的机会来满足hbv尚未满足的临床治疗需求。因此，在本发明的一方面，提供了用于抑制hbv基因中的一个或多个靶序列表达的hbv dna特异性的rna干扰制剂。
[0079]
肽对接载体(pdov)
[0080]
pdov以无毒的方式增强其装载的大分子药物逃逸进入细胞质，这使得特定治疗，例如rnai疗法可以实现更有效地递送。本发明提供一种内涵体逃逸肽(pdov)，其以无毒的方式增强大分子载物(例如sirna分子)逃逸到细胞质中。pdov平台的各种示例如图1-4所示。在pdov中，内体逃逸肽既是rna的对接位点连接体，又是靶向配体。多个rna分子可与同一个结构分子结合以实现针对不同mrna的sirna分子的共传递，从而为沉默多疾病相关基因提供协同效应。富含组氨酸和赖氨酸的多肽或线性富含组氨酸和赖氨酸的多肽已被证明是rna递送中有效的细胞穿透和内涵体释放剂。该肽含有富含组氨酸的结构域，其中组氨酸残基的咪唑环在较低的ph值(ph《～6)下被质子化，并在内涵体内部作为质子海绵，从而导致内涵体脂质双层的裂解和rna的释放。下文将更详细地描述pdov上的偶联位点。
[0081]
rnai分子
[0082]
rnai分子是双链化合物。例如，双链sirna可以是抗pcsk9的分子，并且可以在2'位置不做修饰，或用例如2'-och3、2'-f或2'-o-moe进行化学修饰，或者在5'位置用p(o)2＝s进行修饰。也可以进行本领域已知的其他化学修饰，这些修饰可以包括例如聚乙二醇化或脂质官能化，以改善rnai的总体稳定性和生物利用度。
[0083]
在特定实施方案中，双链sirna可以是由表1和表2中任何一个或多个双链体的24、23、22、21、20、19、18、17或16个连续碱基对组成的双链体。
[0084]
表1.sirna序列及其化学修饰
[0085]
[0086][0087]
[0088]
表2.设计脱靶效应最小的pcsk9 sirna序列
[0089]
反义链(5'到3')正义链(5'到3')位置ucauugaugacaucuuuggcaccaaagaugucaucaaugagg1547-1569uguuugaauggugaaaugcccgcauuucaccauucaaacagg2610-2632ucaauaaaagucauucugcccgcagaaugacuuuuauugagc2683-2705acuguuacccguaaaaaugagcauuuuuacggguaacaguga3267-3289ugauaacggaaaaaguuccauggaacuuuuuccguuaucacc3353-3375aaaaguuggcuguaaaaaggccuuuuuacagccaacuuuucu3510-3532aguuacaaaagcaaaacaggucuguuuugcuuuuguaacuug3535-3557aucuucaaguuacaaaagcaagcuuuuguaacuugaagauau3542-3564uaucuucaaguuacaaaagcacuuuuguaacuugaagauauu3543-3565auaaauaucuucaaguuacaaguaacuugaagauauuuauuc3548-3570uaaaaaugcuacaaaacccagggguuuuguagcauuuuuauu3570-3592auaaaaaugcuacaaaacccagguuuuguagcauuuuuauua3571-3593aauaaaaaugcuacaaaacccguuuuguagcauuuuuauuaa3572-3594auauuaauaaaaaugcuacaaguagcauuuuuauuaauaugg3577-3599accauauuaauaaaaaugcuagcauuuuuauuaauaugguga3580-3602
[0090]
靶向配体
[0091]
靶向配体部分可以是如n-乙酰基-半乳糖胺(galnac)，半乳糖，半乳糖胺，n-甲醛-半乳糖胺，n-丙酰基-半乳糖胺，n-丁酰基半乳糖胺，crgd，glp肽或其他小分子。靶向配体通过共价键共价偶联至肽。配体的数量可以为1、2或3。此处公开的靶向配体具有以下所示的结构：
[0092][0093]
rnai与多肽之间的连接体
[0094]
配体偶联rs的连接：化学基团rs可以是各种类似于“点击”的反应基团中的一种，
用于将寡核苷酸与pdov肽载体偶联。rs可以是胺、肼、n-羟基琥珀酰亚胺、叠氮、炔烃、羧酸、硫醇或马来酰亚胺，或本领域已知的其他化学反应基团。有代表性的例子如图8和图9所示：
[0095]
偶联rs-linker2-sirna中的连接体2是位于肽和偶联位点之间的化学间隔物，可将偶联位点连接在接头的末端。连接体2可以是脂肪链或聚乙二醇链，或其他疏水性脂肪链或亲水链。末端的基团2是与sirna末端化学偶联的反应位点。
[0096]
配体与多肽的连接体
[0097]
本文公开的靶向配体和rnai部分包含直接连接sirna(正义链的3'或5'端)的连接体1和连接连接体2-配体的桥(图7)。连接体1的间隔物是线性聚乙二醇，其中乙二醇聚合度为1～50，或聚(l-丙交酯)，其中乙酯重复单元数为1～50或平均分子量为100～3500。结合位点可以是马来酰亚胺/硫醇基团，也可以从图9中的第2组列表中选择。
[0098]
多肽对接载体
[0099]
多肽对接载体(pdov)具有将一个配体偶联位点和多个寡核苷酸位点结合的优势。pdov具有一般结构的肽骨架：(hnkm)oxpzq具有组氨酸(h)、赖氨酸(k)和官能团x和z的多个重复单元(其中x或z是氨基酸或氨基酸衍生物(可以选自连接体1和图9中的官能团)，并且其中：n＝1-10；m＝1-10；o＝1-10，p＝1-5，q＝1-5。hk重复单元已被证明能促进内涵体的释放。赖氨酸残基或官能团x可用作配体连接的对接点，z通过不同的共价键为寡核苷酸的偶联提供对接点。图2是pdov如何偶联的示意图。例如，位点1只能在配体(如galnac或其他靶向配体)存在的情况下反应。位点3在选定的条件下只能与寡核苷酸和sirna结合。(f：官能团偶联方法见图10)。
[0100]
此外，pdov可以具有三个配体偶联位点和多个寡核苷酸位点(参见图6)：a(hnkm)oxpzq肽骨架具有组氨酸(h)、赖氨酸(k)以及官能团x和z(氨基酸或官能连接体)的多重复单元，其中，n＝1-10，m＝1-10，o＝1-10，p＝1-5，q＝1-5。hk重复单元已被证明具有良好的细胞穿透能力和促进内涵体释放效果。赖氨酸或各种官能团x被设计为连接配体的对接位点，z被设计为寡核苷酸通过不同的共价键连接的对接位点。
[0101]
在结构设计中，pdov结构是插入了多个偶联位点x和z的内涵体释放肽。x位点用于偶联靶向配体，z位点用于偶联多个寡核苷酸或核酸。pdov结构的一些例子如图3所示，其中：a表示肽序列k、r、h、hh、hhh、hhh、hhk、hhhk或其他短肽；b表示肽序列k、r、h、hh、hh、hhh、hhh、hhhk或其他短肽或其他氨基酸或组合；d表示寡核苷酸、sirna、mrna或适配体；rl表示配体；rs表示与寡核苷酸的连接体。在一些实施例中，该肽含有5-15个氨基酸。
[0102]
在一些实施例中，pdov具有如图4所示结构。
[0103]
具体实施例：
[0104]
实施例1.叠氮-pdov1(1)的合成与表征
[0105]
肽azido-pdov1(序列为hhh{lys(peg4-n3)}hhckhhh)是使用商业化的自动多肽合成仪合成，并在序列中使用标准的氨基酸和赖氨酸-peg4-n3修饰剂。用c-18反相高效液相色谱法对多肽进行纯化，并用质谱对其进行了表征。1hnmr和质谱分析结果与预期结构一致。
[0106]
实施例2.pdov2和叠氮-pdov2的合成
[0107]
合成pdov2(2)，序列为hhhkhhcrhhh。肽pdov2(hhhkhhcrhhh)是由委托服务商通过自动化多肽合成仪、使用序列中的标准氨基酸合成的。通过c-18反相高效液相色谱对合成
的肽进行纯化，并通过质谱进行表征(如下所示)。1hnmr和质谱分析结果与预期结构一致。
[0108]
azido-pdov2的合成(3)：
[0109][0110]
叠氮化物连接体通过叠氮化物连接体上的酯活化羧酸和肽对接载体2(pdov2)的赖氨酸侧链的伯胺之间形成的酰胺键，连接到pdov2(2)上，形成化合物3。将pdov2肽hhhkhhcrhhh(42mg，0.0280mmol)悬浮于1.0ml dmf中。添加三乙胺(39ul，10当量)，并在室温下将混合物搅拌20分钟。将叠氮-peg4-nhs酯(54mg，0.140mmol，5eq)溶于20ul dmf中，然后添加到反应混合物中。反应混合物在30分钟内缓慢变成澄清溶液，并在室温下进一步搅拌16小时。反应混合物由tlc图谱检测，pdov2完全转化由hplc图谱监测。
[0111]
用水(200μl)对反应混合物进行淬灭，使用旋转蒸发器浓缩，并在半制备反相-c18柱上使用10-90％缓冲液b(乙腈中0.1％tfa)的递增梯度通过hplc纯化粗品。主要产物为azido-pdov2(3)，保留时间为10.5～11.5分钟。将样品部分冻干，得到化合物3的油状清亮残余物(44mg，88％产率)。其质子和质谱分析如下：1h nmr(400mhz，d2o，图24)δ8.74(brd d，8h)和δ7.35(brd d，8h)与δ6.00ppm，与上述肽中8个组氨酸四唑相关的芳香氢一致。所有11个氨基酸的α碳上的亚甲基氢在δ4.75-4.30(br，t，11h)，与聚乙烯基团相关的乙烯氢在δ3.90-3.75(m，100h)；与赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸的侧链质子相关的乙烯氢在δ3.6-2.75(m，53h)和δ1.8-1.3(m，12h)。
[0112]
实施3.叠氮-pdov3肽(4)的合成与表征
[0113]
叠氮-pdov3({lys(peg4-n3)}hhhchh)采用固相自动合成法合成，序列中使用了标准氨基酸外加赖氨酸-peg4-n3修饰剂。通过c-18反相hplc纯化肽，并通过1hnmr和质谱(如下所示)进行表征。1hnmr和质谱分析结果与预期结构一致。
[0114]
实施例4.pdov1-galnac3(5)的合成和表征
[0115][0116]
方案1：pdov1-galnac3(5)的合成。
[0117]
将peg6-galnac3(9)(3.0mg，1.56μmol)的无水dmf(400ul)溶液加入n3-pdov1 2(3.54mg，2.03μmol)的磷酸盐缓冲液(1ml，ph＝7.4)中。将得到的混合物在25℃的氮气中搅拌过夜。样品减压除去溶剂后，经脱盐和pd-10柱纯化，得到纯品pdov1-galnac3 5(5.1mg，白色固体，产率90％)。产物用反相c18柱进行hplc分析，用0.1％tfa水和0.1％乙腈混合溶剂做梯度洗脱。保留时间rt＝4.877分钟，纯度》90％。质谱分析(esi，阳离子)：c
154h240n48o55
s的计算值为3673.7，测定值为3674.8。
[0118]
实施例5.pdov2-galnac3 6和7的合成和表征
[0119][0120]
方案2：制备pdov2-连接体-galnac3。
[0121]
pdov2-peg6-galnac3(化合物6)的制备：化合物3(49.8mg，0.0243mmol)溶于1.0ml脱气的pbs缓冲液(ph 7.4)中。三价半乳糖配体(9)(30.8mg，0.0160mmol)溶于400μl无水dmf溶液中。反应混合物在干燥的氩气下再次脱气，并在室温下搅拌过夜。反应混合物用水(100μl)淬火，并按照glen research推荐的方案通过1.0μmol sephadex nap柱脱盐。将洗脱液冻干，粗品在hplc上通过半制备型c18反相柱以10-90％缓冲液b(0.1％tfa的乙腈和水溶液)的梯度递增洗脱。产物保留时间为4.0分钟，并分离得到油状物(39mg，产率60％)。修饰的寡核苷酸质谱分析证实我们构建的pdov2-peg6-galnac3结构分子是成功的。
[0122]
实施例6.pdov3-galnac3(8)的合成
[0123][0124]
方案3：pdov3-galnac3(8)的合成。
[0125]
pdov3-galnac3(化合物8)的合成：叠氮-pdov3化合物4(47.0mg，38.9μmol)的dmf(1.5ml)溶液在氮气保护下25℃时加入到三价galnac(9)(50.0mg，25.9μmol)的磷酸盐缓冲液(4ml，ph 7.4)中。所得的反应物在25℃搅拌12小时。用高效液相色谱(hplc)监测反应，直到galnac 9被完全消耗。溶剂经冻干除去，粗品经凝胶渗透柱色谱pd-10柱纯化，得到纯品pdov3-galnac3化合物8(70mg，产率86.4％)。hplc在反相c18柱上进行，洗脱溶剂为0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈溶液，rt＝5.038分钟。ms(esi，阳离子模式)确定分子量：c
130h207n37o51
s的精确分子量为3134.45。测定值为3135.8。
[0126]
实施例7.对照-galnac3(control3-galnac3)的合成(11)
[0127]
pdov3-control 3-galnac3的制备：
[0128]
化合物叠氮-control3肽11(序列{lys(peg4-n3)}ssscss)(2.6mg，2.59μmol)溶于1.0ml脱气的pbs缓冲液(ph 7.4)中。galnac-配体(5.0mg，2.59μmol)溶于500ul无水dmf溶液中。反应混合物在干燥的氩气下再次脱气，并在室温下搅拌过夜。反应混合物用水(100μl)淬火，经1.0μmol sephadex nap柱脱盐。收集的洗脱液经冻干得到所需的化合物control3-galnac3 10。该化合物使用分析型hplc c18 rp柱进行分析，缓冲液b的递增梯度为10-90％(0.1％tfa的乙腈和水溶液)。产物保留时间为3.80分钟，分离得到透明油状物(4.9mg，产率67％)。修饰后的寡核苷酸的质谱分析结果证实了pdov3-control3-peg6-galnac分子的结构。
[0129]
实施例8.pcsk9-pdov3-galnac3(12)的合成和表征
[0130][0131]
方案4.pcsk49-pdov3-galnac3(12)的合成。
[0132]
将pdov3-galnac3 8(1.2μmol)的dmso(300μl)溶液加入到pcsk49-sense-5'-dbco(1μmol)无菌无酶的水(300μl)溶液中。所得混合物在25℃下搅拌2小时。减压除去溶剂后，粗品经凝胶渗透色谱pd-10柱纯化，得到纯品正义链pcsk49-pdov3-galnac3化合物17(产率85％)。hplc在pa200型离子交换柱上进行，使用磷酸盐缓冲液，ph＝11，得到pcsk49-pdov3-galnac3，rt＝14.744分钟，纯度》85％。用反义链1:1进行退火(95度5分钟，以1℃/分钟左右的速度冷却至室温，然后在-20度下保存)，得到最终的偶联双链pcsk49-pdov1-galnac3(12)。该产物经hplc和ms表征。
[0133]
实施例9
[0134]
pcsk9 sirna序列的体外筛选。未修饰的pcsk9 sirna基因敲低研究。实验采用hepg2细胞，12孔板每孔1
×
105，转染24小时，sirna终浓度为50μm。11个pcsk9 sirna样本(pcs232、pcs233、pcs28、pcs36、pcs48、pcs49、pcs49b、pcs58、pcsd1、pcsd2、pcsd3)，设置一个ns孔作为对照，不设置空白孔。qrt-pcr：hprt(作为内参对照)和pcsk9引物(f r，每个20μm，每个反应0.2μl)和探针(10μm，每个反应0.4μl)。与lipo ns相比，9种pcsk9 sirna均有明显的基因沉默效果，如图15所示。mrna敲低水平在74％～94％之间。在pcs232、pcs48、pcs58和pcsd3这几条序列可以将pcsk9的表达水平敲低至低于11％。设计的大部分sirna在mrna敲低实验中表现出很强的效力。
[0135]
实施例10
[0136]
pcsk9 sirna序列的体外筛选。实验采用hepg2细胞，12孔板每孔1
×
105，转染24小时，sirna浓度为系列稀释。7个待测样本，加上一个ns孔做为对照，不设置空白孔。qrt-pcr：hprt(作为内参对照)和pcsk9引物(f r，每个20μm，每个反应0.2μl)和探针(10μm，每个反应0.4μl)。与lipofectamine ns相比，pcsd3 sirna具有明显的基因沉默效果(见图16)，pcs48 sirna具有明显的基因沉默效果(图17)。通过连续稀释实验进一步检测pcsk9 sirna的mrna敲低水平，pcsd3 sirna抑制pcsk9 mrna的ic50值小于25pm，pcs48的ic50约为25pm，pcs28
的ic50小于10pm，pcs36的ic50约为0.1nm，pcs49的ic50约为10pm，pcs233的ic50约为0.1nm，pcsd1的ic50约为1nm。
[0137]
实施例11
[0138]
修饰的pcsk9 sirna序列的体外筛选。hepg2:2
×
105细胞/孔，12孔板转染24h。30ng的cdna溶解在8.2μl水溶液。pcs-sirna转染浓度：10nm、1nm、0.1nm和0.01nm，10
×
连续稀释。每个样lipofectamine rnai max 2μl，稀释到98μl的optimem中；sirna溶解于100μl的optimem中；然后混合并共孵育15分钟。多重pcr为hprt探针(10μm，0.4μl)。hprt引物(f r，每个20μm)，0.2μl(最终浓度为200nm)。pcs探针为(10μm，0.4μl)。pcs引物(f r，每个20um)，0.8μl(最终浓度为800nm)。taqpath 2
×
master mix使用10μl(见图19-图22)。sirna被进一步化学修饰以增强稳定性，具体序列见表1。这些修饰后的mpcsk9 sirna通过连续稀释实验进一步检测其mrna敲低水平。结果表明，mpcs49b的ic50约为0.1nm-0.01nm，mpcs58的ic50约为0.1nm，mpcs48a的ic50小于10nm，mpcs48b的ic50约为10nm，mpcsd3a的ic50约为10pm，mpcsd3b的ic50小于10nm。
[0139]
实施例12
[0140]
以pcsk9 mrna基因为靶点并将脱靶效应降至最低的pcsk9 sirna序列设计。前蛋白转化酶枯草杆菌素9(pcsk9，nm_174936.4)，转录变体1。利用sidirect设计在种子区(引导链5
′
端2-8处含有7个核苷酸)tm值较低的sirna序列(见表2)。sirna下调了许多在转录子与sirna种子区具有互补性的非预期基因。sirna诱导这类种子区依赖性脱靶效应的能力与sirna引导链种子区与其靶mrna之间形成的双链的热力学稳定性高度相关。核心双链形成的tm与依赖核心区的脱靶效应密切相关。
[0141]
尽管本公开描述了所述组合物和方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些组合物和方法易受其他实施例的影响，并且某些细节在不脱离本公开的基本原理的情况下，可以对本文中描述的实施方式进行改变。